基因槍介導的轉(zhuǎn)基因小麥的獲得與鑒定

摘要：運用基因工程技術(shù)將外源抗病基因直接導入具有優(yōu)良農(nóng)藝性狀的小麥品種中，能夠獲得抗赤霉病小麥新品種。采用基因槍介導的共轉(zhuǎn)化法，以bar基因為篩選標記，將幾丁質(zhì)酶基因?qū)腴L江中下游小麥栽培品種鄭麥9023，T0代經(jīng)過PCR鑒定，獲得6株陽性植株，表明幾丁質(zhì)酶基因已整合到小麥基因組中。

關(guān)鍵詞：小麥；赤霉??；基因槍轉(zhuǎn)化；幾丁質(zhì)酶基因

中圖分類號：S512.1；Q785 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）05-1038-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.05.004

Abstract： Genetic engineering can directly introduce exogenous antifungal genes into elite wheat with to obtain new wheat varieties against FHB （Fusarium Head Blight）. Using bar as selection marker， trichoderma chitinase gene（UEch42） was introduced into immature embryos of Zhengmai 9023 by biolistic co-bombardment. PCR results showed that 6 transgenic plants were obtained in T0 generation， indicating that genes were integrated into wheat genome.

Key words： wheat； FBH （Fusarium Head Blight）； microprojectile bombardment； chitinase gene

小麥赤霉?。‵usarium Head Blight，F(xiàn)HB）是由禾谷鐮刀菌引起的禾谷類真菌病害，其致病菌主要在開花灌漿期侵染小麥的穗部，造成穗腐、粒腐，引起減產(chǎn)，甚至顆粒無收。禾谷鐮刀菌在侵染小麥的過程中會產(chǎn)生單端孢霉烯族毒素（Trichothecenes，單族毒素），會滯留在子粒上進入食物鏈，從而引起食品安全問題，危及人畜健康，近年來隨著氣候的變暖，小麥赤霉病在北美和歐洲大陸也時有大面積發(fā)生，這嚴重影響著小麥生產(chǎn)區(qū)的糧食安全。

可是，到目前為止，世界上還沒有發(fā)現(xiàn)完全抗赤霉病的小麥品種，抗赤霉病育種工作已經(jīng)開展了很多年，主要集中在傳統(tǒng)育種方面[1]，但是傳統(tǒng)育種耗時費力，獲得的小麥品種抗性單一，抗性遺傳基礎(chǔ)狹窄[2]，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將赤霉病抗性基因轉(zhuǎn)入小麥栽培品種，豐富小麥中的抗真菌性病害基因，加快育種進程，大大提高育種效率和抗病效果，不失為一種有效獲得抗性小麥品種的重要途徑。

研究表明，幾丁質(zhì)是一種廣泛分布于多數(shù)真菌細胞壁上的主要成分。它是N-乙酰-D-葡萄糖胺以β-1，4-糖苷鍵連接的多聚物。植物中的N-乙酰葡萄糖胺以糖酯鍵形式存在，而非線性同聚物，即植物中缺少該酶的有效底物。所以幾丁質(zhì)酶可以降解病原真菌細胞壁中的幾丁質(zhì)，破壞細胞新物質(zhì)的沉積致使病原體死亡，而且產(chǎn)生的細胞壁碎片具有誘導作用，從而刺激寄主植物的抗病反應。通過基因工程的手段將幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入小麥中，使小麥獲得分泌幾丁質(zhì)酶（Chitinase）的能力。當禾谷鐮刀菌入侵小麥時，轉(zhuǎn)基因小麥分泌的幾丁質(zhì)酶可將此真菌的細胞壁分解，抑制真菌的侵染和繁殖，從而達到抗病的效果。

1992年Vasil等[3]采用基因槍技術(shù)獲得了第一株轉(zhuǎn)基因小麥，隨后，Weeks等[4]利用基因槍技術(shù)將 gus和bar基因?qū)肓诵←?，建立基因槍轉(zhuǎn)化小麥的技術(shù)體系。目前，基因槍轉(zhuǎn)化體系日益成熟，在小麥遺傳轉(zhuǎn)化方法中起著舉足輕重的作用[5，6]。基因槍法與其他轉(zhuǎn)化方法相比，具有許多優(yōu)點：受體材料來源廣泛，無宿主限制，它避免了原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株困難的問題以及農(nóng)桿菌的宿主范圍限制；具有可控性高、操作簡便、快速、靈活等特點，從而實現(xiàn)多基因共轉(zhuǎn)化[7]。到目前為止，基因槍法運用最小表達框進行小麥遺傳轉(zhuǎn)化成為應用最為廣泛的方法[8-11]。

本研究采用基因槍共轉(zhuǎn)化的方法，利用bar基因作為篩選標記基因，將含有幾丁質(zhì)酶基因用于基因槍轉(zhuǎn)化，以期獲得含有幾丁質(zhì)酶基因的轉(zhuǎn)基因小麥，并探索利用幾丁質(zhì)酶基因改良小麥抗赤霉病性狀的可行性，對小麥提高赤霉病抗性研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用小麥品種鄭麥為9023，質(zhì)粒為pXJC- ch42、pBar。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 培養(yǎng)基成分參考文獻[12]。

1.2.2 外植體選擇 取開花后12～14 d的麥穗，剝?nèi)←溗胫虚g部位比較飽滿的體被白色絨毛呈嫩綠色的未成熟幼胚，用70%乙醇消毒30 s，無菌水快速沖洗1次，0.1%氯化汞消毒6～8 min，無菌水沖洗3～5次，每次2 min；在無菌條件下剝?nèi)“胪该鳡畹挠着?，接種于愈傷誘導培養(yǎng)基中，放于27 ℃培養(yǎng)后用于轉(zhuǎn)化，挑選呈淡黃色，顆粒狀，較致密的愈傷轉(zhuǎn)至高滲培養(yǎng)基作高滲處理。

1.2.3 基因槍轟擊方法與參數(shù) 利用Bio-Rad公司生產(chǎn)的PDS-1000型高壓氦氣基因槍。轟擊參數(shù)：壓力7.58 Mpa，距離 9 cm，真空度93.13 kPa，轟擊次數(shù)1次，每槍金粉用量為250 μg，DNA用量為 1.5 μg，根據(jù)Bio-Rad公司基因槍使用說明書提供的方法轟擊，轟擊后繼續(xù)高滲暗處理16 h。

1.2.4 恢復培養(yǎng)及篩選 轟擊后的愈傷繼續(xù)高滲 16～20 h，然后轉(zhuǎn)入恢復培養(yǎng)基于 27 ℃中培養(yǎng)，根據(jù)愈傷組織在恢復培養(yǎng)基上生長的狀態(tài)，愈傷組織快速增殖開始出現(xiàn)大量胚狀體的時候，即可轉(zhuǎn)入分化篩選培養(yǎng)基。將恢復后的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入分化篩選培養(yǎng)基，待愈傷分化出抗性綠芽后轉(zhuǎn)入再生篩選培養(yǎng)基，將生長狀態(tài)良好的綠苗轉(zhuǎn)入生根篩選培養(yǎng)基。將生根篩選后存活的苗轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基中壯苗，隨時觀察苗的狀態(tài)。當幼苗明顯變綠，根系較發(fā)達時即可置于4 ℃春化，移栽至溫室。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測 用CTAB法提取小麥幼嫩葉片基因組DNA。對目的基因進行PCR檢測。以dd H2O和未轉(zhuǎn)化的同一品種植株DNA作陰性對照進行PCR擴增，可以擴增出408 bp的特異性片段。PCR儀為MJ-100型，反應條件為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，61 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，10 ℃10 min終止反應。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥轉(zhuǎn)bar基因植株篩選

取開花后12～14 d的麥穗，剝?nèi)←溗胫虚g部位比較飽滿的體被白色絨毛呈嫩綠色的未成熟幼胚（圖1A），在無菌條件下剝?nèi)“胪该鳡畹挠着?，接種于愈傷誘導培養(yǎng)基中（圖1B），挑選呈淡黃色，顆粒狀，較致密的愈傷轉(zhuǎn)至高滲培養(yǎng)基，置于小皿中央的圓圈內(nèi)高滲處理4～6 h（圖1C），轟擊后的愈傷繼續(xù)高滲 16～20 h，然后轉(zhuǎn)入恢復培養(yǎng)基于 27 ℃培養(yǎng)（圖1D），恢復培養(yǎng)后愈傷組織快速增殖出現(xiàn)大量胚狀體（圖1E），將恢復后的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入分化篩選培養(yǎng)基分化篩選 （圖1F），分化篩選后愈傷分化出綠點（圖1G），將長出的綠苗分成單株，轉(zhuǎn)入生根篩選培養(yǎng)基篩選，得到部分抗性組培苗（圖1H），將生根篩選后存活的苗轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基中，隨時觀察苗的狀態(tài)。當幼苗明顯變綠，根系較發(fā)達時即可置于4 ℃春化，移栽至溫室（圖1I）。

2.2 轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定

取鄭麥9023 T0代植株的幼嫩葉片，用CTAB 法提取小麥葉片DNA，用幾丁質(zhì)酶基因的特異引物LI/UER對抗性植株進行PCR鑒定，鄭麥9023在T0代獲得6株陽性植株（表1，圖2），表明幾丁質(zhì)酶基因已整合到小麥基因組中。

3 小結(jié)與討論

幾丁質(zhì)又稱殼多糖，是由N-乙酰葡萄糖胺通過β連接聚合而成的結(jié)構(gòu)同多糖。廣泛存在于自然界中，是真菌類細胞壁的主要成分。通過基因工程的手段將幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入小麥中，使小麥獲得分泌幾丁質(zhì)酶（Chitinase）的能力。當禾谷鐮刀菌入侵小麥時，轉(zhuǎn)基因小麥分泌的幾丁質(zhì)酶可將此真菌的細胞壁分解，抑制真菌的侵染和繁殖，從而達到抗病的效果。在本研究中，幾丁質(zhì)酶基因具有廣譜抗菌功能，能抑制十幾種病原菌和非病原真菌的生長及孢子萌發(fā)，其幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)對細胞壁的高親和力導致其強烈的抑菌效果。T0代經(jīng)PCR鑒定，獲得6株陽性植株，表明幾丁質(zhì)酶基因已經(jīng)整合到小麥基因組中。

bar基因是從吸水鏈霉菌（Streptomyce hygroscopicus）中分離出來的，編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶（Phosphinithricin acetlyltransferase，PAT），PAT能夠催化PPT的游離氨基乙酰化，乙?；腜PT無法抑制GS活性，從而對PPT起到解毒作用[13]。含有bar基因的植物具有對Bialaphos的抗性，因此，bar基因可作為選擇性標記基因，利用其在轉(zhuǎn)化植物體內(nèi)中的表達，只要在篩選培養(yǎng)基中加入一定劑量的 Bialaphos，就會殺死非轉(zhuǎn)化細胞，而生存下來的就是含有標記基因的轉(zhuǎn)化細胞。在Bialaphos篩選體系獲得抗性植株164株，經(jīng)PCR鑒定，T0代才獲得轉(zhuǎn)基因小麥植株6株。這種在Bialaphos篩選體系下抗性苗多而陽性苗少的現(xiàn)象，可能是由于植物細胞本身具有一定的耐受性和抗逆性，非轉(zhuǎn)化細胞即使在高濃度的篩選劑篩選中也出現(xiàn)逃逸現(xiàn)象，產(chǎn)生假轉(zhuǎn)化體，還有可能是由于某些轉(zhuǎn)化組織的解毒能力很強，能夠使最接近的非轉(zhuǎn)化組織得到交叉保護[14]。

參考文獻：

[1] 吳兆蘇，沈秋泉，陸維忠，等.小麥抗赤霉病基因庫的建拓[J].作物學報，1984，10（2）：73-80.

[2] 宋鳳英，李蘭芬，陳立君，等.小麥赤霉病的抗性改良研究進展[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學，2005（3）：41-44.

[3] VASIL V， CASTILLO A M， FROMM M E， et al. Herbicide resistant fertile transgenic wheat plants obtained by microprojectile bombardment of regenerable embryogenic callus[J]. Bio Technology， 1992， 10： 667-674.

[4] WEEKS J T， ANDERSON O D， BLECHL A E. Rapid production of multiple independent lines of fertile transgenic wheat（Triticum aestivum）[J]. Plant Physiol，1993， 102： 1077-1084.

[5] VASIL I K， VASIL V. Transformation of wheat via particle bombardment[J]. Methods in Molecular Biology， 2006， 318： 273-283.

[6] VASIL I K. Molecular genetic improvement of cereals： Transgenic wheat（Triticum asetivum L.）[J]. Plant Cell Rep， 2007， 26（8）：1133-1154.

[7] ROMANO A， RAEMAKERS K， BERNARDI J， et al. Transgenic organization in potato after particle bombardment mediated co-transformation using plasmids and gene cassettes[J]. Transgenic Res， 2003， 12： 461-473.

[8] VIDAL J， KIKKERT J， DONZELLI B. Biolistic transformation of grapevine using minimal gene cassette technology[J]. Plant Cell Rep， 2006， 25： 807-814.

[9] ZHAO Y， QIAN Q， WANG H Z， et al. Co-transformation of gene expression cassettes via particle bombardment to generate safe transgenic plant without any unwanted DNA[J]. In Vitro Cellular Developmental Biology-Plant，2007，43： 328-334.

[10] YAO Q， CONG L， HE G， et al. Optimization of wheat co-transformation procedure with gene cassettes resulted in an improvement in transformation frequency[J]. Molecular Biology Reports， 2007， 34： 61-67.

[11] GUIRIMAND G， BURLAT V， OUDIN A. Optimization of the transient transformation of Catharanthus roseus cells by particle bombardment and its application to the subcellular localization of hydroxymethylbutenyl 4-diphosphate synthase and geraniol 10-hydroxylase[J]. Plant Cell Rep， 2009， 28：1215-1234.

[12] LIU Z W， LI H P， CHENG W， et al. Enhanced overall resistance to Fusarium seedling blight and Fusarium head blight in transgenic wheat by co-expression of anti-fungal peptides[J]. European Journal of Plant Pathology， 2012， 134： 721-732.

[13] THOMPSON C J， MOVVA N R， TIZARD R， et al. Characterization of the herbicide-resistance gene bar from Streptomyces hygroscopicus[J]. EMBJ， 1987， 6： 2519-2523.

[14] CHRISTOU P， FORD T L， KOFORN M. Production of transgenic rice （Oryza sativa L.） plants from agronomically important Indica and Japonica varieties via electric discharge particle acceleration of exogenous DNA into immature zygotic Embryos[J]. Nature Biotech， 1991， 9： 957-962.