畢赤酵母重組菌GS115—Ch—Glu發(fā)酵培養(yǎng)基設(shè)計(jì)及發(fā)酵條件優(yōu)化

摘要：以畢赤酵母重組菌（Pichia pastoris）GS115-Ch-Glu為研究對(duì)象，進(jìn)行了亞麻子發(fā)酵脫毒工藝的研究，并對(duì)重組菌的發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，畢赤酵母重組菌GS115-Ch-Glu發(fā)酵擴(kuò)大培養(yǎng)的培養(yǎng)基最佳碳源為2.5%玉米淀粉，最佳氮源為5.0%黃豆粕。優(yōu)化后的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵條件為溫度28 ℃、轉(zhuǎn)速250 r/min、發(fā)酵時(shí)間33 h、初始pH 6.5、接菌量1.5%、裝液量50 mL/250 mL。在此最佳發(fā)酵條件下，菌體產(chǎn)量為9.0×1010 個(gè)/mL。

關(guān)鍵詞：畢赤酵母（Pichia pastoris）；發(fā)酵條件；優(yōu)化

中圖分類號(hào)：Q815 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）05-1155-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.05.032

Abstract： Pichia pastoris GS115-Ch-Glu as a sort of useful recombinant yeast was used to detoxify in linseed. Its fermentation conditions were optimized. The results showed that the optimal carbon and nitrogen source were 2.5% corn starch and 5.0% soybean meal. The optimal fermentation conditions in basal medium were the temperature of 28 ℃， the speed of 250 r/min， the incubation time of 33 hours， the initial pH value of 6.5， the inoculation rate of 1.5% and the liquid volume of 50 mL/250 mL. Under these conditions， the fermentation yield of the cell production was per milliliter of 9.0×1010 strains.

Key words： Pichia pastoris；fermentation condition；optimization

亞麻子含多功能活性物質(zhì)，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高且具有多種臨床應(yīng)用價(jià)值。因此，亞麻子成為功能食品領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，冷榨亞麻子油含有豐富的α-亞麻酸，是補(bǔ)充亞麻酸的最有效方法，因此亞麻子是一種潛在的優(yōu)良油脂原材料。但亞麻子中所含的生氰糖苷存在很大毒性，大大降低了亞麻子在糧油加工業(yè)的使用范圍和利用價(jià)值。目前，亞麻子的脫毒方法主要是通過物理和化學(xué)的處理方法，但這些方法存在脫毒率較低、成本較高、難以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化、溶劑殘留安全風(fēng)險(xiǎn)等問題，并且會(huì)影響亞麻子中的營(yíng)養(yǎng)成分，降低了營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1]。

微生物法脫毒因其作用條件溫和、脫毒成本低、安全等優(yōu)點(diǎn)[2]越來越受到生物研究領(lǐng)域的關(guān)注，但微生物自身代謝和繁殖產(chǎn)生的酶活力低，脫毒效果較差，脫除率最高為77%[3，4]。為此，中山大學(xué)海洋學(xué)院成功構(gòu)建了分泌融合表達(dá)氰化物水合酶和β-葡萄糖苷酶的基因工程菌——畢赤酵母重組菌（Pichia pastoris）GS115-Ch-Glu，該工程菌株具有強(qiáng)氰根吸收能力和高效生氰糖苷降解能力，可使生氰糖苷中的CN-高效解離成HCN，又能將游離的HCN作為惟一碳氮源[5]。本研究利用已經(jīng)構(gòu)建好的畢赤酵母重組菌GS115-Ch-Glu菌種進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)，并對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以期發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)水平的要求。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：畢赤酵母重組菌GS115-Ch-Glu菌種，由中山大學(xué)海洋學(xué)院王江海實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

培養(yǎng)基成分：碳源包括葡萄糖、乳糖、玉米淀粉、甘油；氮源包括蛋白胨、酵母浸膏、黃豆粕、棉子粉。

種子培養(yǎng)基：2%胰蛋白胨、1%酵母提取物、1.34%YNB（無氨基酵母氮源）、1%甘油、4×10-5%生物素，加入緩沖溶液，121 ℃滅菌20 min即得到BMGY液體培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 畢赤酵母重組菌種子液的培養(yǎng) 取活化后的酵母菌1環(huán)，接種于150 mL液體種子BMGY培養(yǎng)基中， 然后進(jìn)行膜過濾；放入搖床，在30 ℃，250 r/min的轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)24 h備用。

1.2.2 碳源的確定 分別以葡萄糖、乳糖、玉米淀粉、甘油為碳源，保持其他培養(yǎng)基成分不變進(jìn)行培養(yǎng)選擇出最佳碳源。然后將最佳碳源按照2.0%、2.5%、3.0% 3種不同比例進(jìn)行培養(yǎng)基配制確定最佳使用比例。在培養(yǎng)過程中（0～48 h）每隔3 h取樣測(cè)定OD值（為保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確，進(jìn)行1 000 r/min離心，下同），繪制曲線。在曲線出現(xiàn)最高峰時(shí)，測(cè)定畢赤酵母重組菌的產(chǎn)量進(jìn)行比較，選擇出最適碳源及最佳比例。

1.2.3 氮源的確定 固定碳源為2.5%玉米淀粉，分別以蛋白胨、酵母浸膏、黃豆粕、棉子粉為氮源，保持其他培養(yǎng)基成分不變進(jìn)行培養(yǎng)，選擇出最佳氮源。然后將最佳氮源按照3.0%、5.0%、7.0% 3種不同比例進(jìn)行培養(yǎng)基配制確定最佳比例。確定方法同“1.2.2”。

1.2.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化

1）初始pH。采用確定好的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在溫度28 ℃、轉(zhuǎn)速250 r/min、發(fā)酵時(shí)間33 h、接菌量1.5%、裝液量50 mL/250 mL的條件下，分別測(cè)試不同初始pH（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）對(duì)發(fā)酵產(chǎn)菌量的影響，確定最佳初始pH。

2）發(fā)酵時(shí)間。采用確定好的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在溫度28 ℃、轉(zhuǎn)速250 r/min、初始pH 6.5、接菌量1.5%、裝液量50 mL/250 mL的條件下測(cè)試不同發(fā)酵時(shí)間（27、30、33、36、39、42 h）對(duì)發(fā)酵產(chǎn)菌量的影響，確定最佳發(fā)酵時(shí)間。

3）發(fā)酵溫度。采用確定好的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)速250 r/mim、發(fā)酵時(shí)間33 h、初始pH 6.5、接菌量1.5%、裝液量50 mL/250 mL的條件下，測(cè)試不同發(fā)酵溫度（25、28、31 ℃）對(duì)發(fā)酵產(chǎn)菌量的影響，確定最佳發(fā)酵溫度。

4）轉(zhuǎn)速。采用確定好的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在溫度28 ℃發(fā)酵33 h、初始pH 6.5、接菌量1.5%、裝液量50 mL/250 mL的條件下，測(cè)試不同轉(zhuǎn)速（150、200、250、300、350 r/min）對(duì)發(fā)酵產(chǎn)菌量的影響，確定最佳轉(zhuǎn)速。

5）接菌量。采用確定好的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在溫度28 ℃、轉(zhuǎn)速250 r/min、發(fā)酵時(shí)間33 h、初始pH 6.5、裝液量50 mL/250 mL的條件下測(cè)試不同接菌量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）對(duì)發(fā)酵產(chǎn)菌量的影響，確定最佳接菌量。

6）裝液量。采用確定好的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在溫度28 ℃、轉(zhuǎn)速250 r/min、發(fā)酵時(shí)間33 h、初始pH 6.5、接菌量1.5%的條件下，測(cè)試不同裝液量（25、50、75、100 mL/250 mL）對(duì)發(fā)酵產(chǎn)菌量的影響，確定最佳裝液量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對(duì)畢赤酵母重組菌發(fā)酵產(chǎn)菌量的影響

由圖1可知，培養(yǎng)33 h時(shí)，培養(yǎng)基添加碳源玉米淀粉的OD值達(dá)到峰值，添加碳源甘油其OD值在培養(yǎng)39 h時(shí)達(dá)到峰值，添加乳糖和葡萄糖作為碳源時(shí)，二者OD值變化不明顯。基于酵母菌培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)的特點(diǎn)，為了利于大規(guī)模生產(chǎn)，選擇發(fā)酵時(shí)間不超過48 h的培養(yǎng)基，因此確定玉米淀粉為重組菌GS115-Ch-Glu的最佳碳源。

由圖2可知，以玉米淀粉作為培養(yǎng)基最佳碳源，當(dāng)玉米淀粉的比例為2.5%，培養(yǎng)時(shí)間為33 h時(shí)，培養(yǎng)基OD值達(dá)到峰值，而添加3.0%和2.0%的玉米淀粉其OD值分別在36 h和39 h達(dá)到最大值，之后OD值都呈下降趨勢(shì)。因此，確定玉米淀粉為重組菌GS115-Ch-Glu的最佳碳源，且比例為2.5%。

2.2 不同氮源對(duì)畢赤酵母重組菌發(fā)酵產(chǎn)菌量的影響

由圖3可知，培養(yǎng)33 h時(shí)，培養(yǎng)基添加氮源黃豆粕的OD值達(dá)到峰值18.6，且之后OD值的變化比較小；添加棉子粉在培養(yǎng)33 h時(shí)OD達(dá)到峰值6.9；添加酵母浸膏和蛋白胨作為氮源時(shí)，OD值在培養(yǎng)39 h分別能達(dá)到16.8和16.2，但是耗時(shí)比較長(zhǎng)，所以確定黃豆粕為重組菌GS115-Ch-Glu的最佳氮源。黃豆粕作為氮源不僅有較高的產(chǎn)菌量，同時(shí)還能維持高效產(chǎn)菌一段時(shí)間，且廉價(jià)，因此黃豆粕還可以考慮作為長(zhǎng)效氮源而利用到大規(guī)模生產(chǎn)中。

由圖4可知，以黃豆粕作為培養(yǎng)最佳氮源，黃豆粕的比例為5.0%，培養(yǎng)時(shí)間為33 h時(shí)，培養(yǎng)基OD值達(dá)到峰值18.9，之后OD值的變化比較小，這與前期試驗(yàn)結(jié)果一致。而添加7.0%和3.0%黃豆粕其OD值均在培養(yǎng)39 h達(dá)到最大值，之后其OD值呈下降趨勢(shì)，因此確定黃豆粕為重組菌GS115-Ch-Glu的最佳氮源，且比例為5.0%。

2.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.3.1 最佳發(fā)酵初始pH確定 由圖5可見，培養(yǎng)基初始pH為5.5、7.5時(shí)，畢赤酵母重組菌發(fā)酵產(chǎn)菌量差別不大；初始pH為6.0、7.0時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)菌量差別也不大；當(dāng)培養(yǎng)基初始pH為6.5時(shí)，畢赤酵母重組菌發(fā)酵產(chǎn)菌量達(dá)到最高峰，為4.8×1010 個(gè)/mL，因此確定重組菌GS115-Ch-Glu的最佳發(fā)酵初始pH為6.5。

2.3.2 最佳發(fā)酵時(shí)間確定 由圖6可見，當(dāng)培養(yǎng)到33 h時(shí)，培養(yǎng)液中畢赤酵母重組菌產(chǎn)菌量達(dá)到最高值，為5.4×1010 個(gè)/mL，之后隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵產(chǎn)菌量趨于穩(wěn)定。因此，確定重組菌GS115-Ch-Glu的最佳發(fā)酵時(shí)間為33 h。

2.3.3 最佳發(fā)酵溫度確定 從圖7可以看出，當(dāng)發(fā)酵溫度在28 ℃時(shí)，培養(yǎng)液中畢赤酵母重組菌產(chǎn)菌量達(dá)到最高值，為6.8×1010 個(gè)/mL，隨著發(fā)酵溫度繼續(xù)升高，產(chǎn)菌量呈下降趨勢(shì)。因此，確定重組菌GS115-Ch-Glu的最佳發(fā)酵溫度為28 ℃。

2.3.4 最佳轉(zhuǎn)速確定 從圖8可以看出，當(dāng)培養(yǎng)過程中轉(zhuǎn)速為250 r/min時(shí)，培養(yǎng)液中畢赤酵母重組菌產(chǎn)菌量達(dá)到最高值，為8.1×1010 個(gè)/mL，轉(zhuǎn)速太大或太小都不利于該菌體的生長(zhǎng)繁殖。因此，選擇轉(zhuǎn)速為250 r/min進(jìn)行菌體培養(yǎng)。

2.3.5 最佳接菌量確定 由圖9可見，當(dāng)接菌量為1.5%時(shí)，畢赤酵母重組菌發(fā)酵產(chǎn)菌量達(dá)到最高峰，為8.6×1010 個(gè)/mL，之后發(fā)酵產(chǎn)菌量隨接菌量的增加而降低，確定1.5%的接菌量為最佳接菌量。

2.3.6 最佳裝液量確定 從圖10可以看出，當(dāng)裝液量為50 mL/250 mL時(shí)，培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)菌量達(dá)到峰值，為9.0×1010 個(gè)/mL，隨后產(chǎn)菌量隨裝液量的增加而降低。因此，確定重組菌GS115-Ch-Glu的最佳裝液量為50 mL/250 mL。

3 小結(jié)

畢赤酵母重組菌GS115-Ch-Glu進(jìn)行發(fā)酵擴(kuò)大培養(yǎng)的培養(yǎng)基成分為2.5%的玉米淀粉作為碳源、5%的黃豆粕作為氮源，其優(yōu)化了的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵條件為溫度28 ℃、轉(zhuǎn)速250 r/min、發(fā)酵時(shí)間33 h、初始pH 6.5、接菌量1.5%、裝液量50 mL/250 mL。在此最佳發(fā)酵條件下，測(cè)得培養(yǎng)基OD值達(dá)到35，比其他報(bào)道[6，7]的數(shù)據(jù)增長(zhǎng)了5左右，菌體產(chǎn)量為9.0×1010 個(gè)/mL，為亞麻子作為食用油脂優(yōu)質(zhì)的原材料創(chuàng)造了條件。本研究中的碳源和氮源都是相對(duì)廉價(jià)的原材料，特別是黃豆粕還可以考慮作為長(zhǎng)效氮源使用，這樣更好地滿足了工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)的要求。

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