高效液相色譜法測定復(fù)方氨基酸注射液中的酪氨酸和色氨酸含量

【摘 要】本文采用高校液相測定了復(fù)方氨基酸注射液中酪氨酸和色氨酸的含量，固定相為：安捷倫Cl8（4.6mm×250mm，5um），甲醇-乙腈-0.1%醋酸鈉水溶液（3：5：92）為流動相，檢測波長為280nm；色氨酸在50～150μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系；酪氨酸在100～900μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。色氨酸和酪氨酸的平均回收率分別為99.5%、99.5%，RSD為0.63%（n=6）、0.56%（n=6）；此方法簡便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可用于復(fù)方氨基酸注射液中色氨酸和酪氨酸的含量測定。

【關(guān)鍵詞】復(fù)方氨基酸注射液；色氨酸；酪氨酸

復(fù)方氨基酸注射液是一種透明、無色或微黃色的澄明液體，可提供完全、平衡的18種必需和非必需氨基酸，改善氮平衡。復(fù)方氨基酸注射液具有促進(jìn)人體蛋白質(zhì)代謝正常，糾正負(fù)氮平衡，補(bǔ)充蛋白質(zhì)，加快傷口愈合的作用。復(fù)方氨基酸注射液用于大面積燒傷、創(chuàng)傷及嚴(yán)重感染等應(yīng)激狀態(tài)下肌肉分解代謝亢進(jìn)、消化系統(tǒng)功能障礙、營養(yǎng)惡化及免疫功能下降的病人的營養(yǎng)支持。復(fù)方氨基酸注射液含有L-脯氨酸（C5H9NO2）、L-組氨酸（C6H9N3O2）、L-色氨酸（C11H12N2O2）、L-絲氨酸（C3H7NO3）、L-丙氨酸（C3H7NO2）、L-精氨酸（C6H14N4O2）、L-纈氨酸等。本文采用高校液相測定了復(fù)方氨基酸注射液中酪氨酸和色氨酸的含量。

1.儀器與試藥

WP-UP-Ⅱ-30分析型實(shí)驗(yàn)室專用超純水機(jī)（四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司）；FL2200-2高效液相色譜儀（浙江福立分析儀器有限公司）；CO-1000型色譜柱溫箱（武漢恒信世紀(jì)科技有限公司）；B8510E-DTH超聲波清洗機(jī)（必能信超聲（上海）有限公司）；320 XT 電子分析天平（上海精科天美貿(mào)易有限公司）；U-1901 雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。色氨酸和酪氨酸對照品由中國藥品生物制品檢定所提供。乙腈（武漢萊恩化工有限責(zé)任公司）、甲醇（武漢萊恩化工有限責(zé)任公司）、醋酸鈉（鄭州世紀(jì)凱美化工產(chǎn)品有限公司）、四氫呋喃（襄樊金譯成精細(xì)化工有限公司）、三乙胺（福建省福州市匯豐化工有限公司）、磷酸二氫鈉（東莞市多正化工有限公司）、磷酸（鄭州世紀(jì)凱美化工產(chǎn)品有限公司）。

2.含量測定

2.1色譜條件

依據(jù)查閱文獻(xiàn)及考查的結(jié)果[1-12]，確定色譜條件如下。色譜柱為安捷倫Cl8規(guī)格為（4.6mm×250mm，5um）；甲醇-乙腈-0.1%醋酸鈉水溶液（3：5：92）為流動相；檢測波長為280nm；流速1.0mL·min-1；柱溫：30℃。理論板數(shù)按酪氨酸峰計算應(yīng)不得低于2000。

2.2供試品溶液的制備

取復(fù)方氨基酸注射液適量，精密量取，置50mL量瓶中，加流動相適量，超聲處理十分鐘使溶解，放置至室溫，加流動相稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45μm）濾過，即得。

2.3對照品溶液的制備

分別精密稱取酪氨酸和色氨酸對照品約5mg和50mg，置100mL容量瓶中，用加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得（每1mL溶液中分別含酪氨酸50μg和色氨酸500μg）。

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

制備濃度為50μg·mL-1、60μg·mL-1、70μg·mL-1、80μg·mL-1、90μg·mL-1、100μg·mL-1、110μg·mL-1、120μg·mL-1、130μg·mL-1、150μg·mL-1的色氨酸對照品溶液，制備濃度為100μg·mL-1、200μg·mL-1、300μg·mL-1、400μg·mL-1、500μg·mL-1、600μg·mL-1、700μg·mL-1、800μg·mL-1、900μg·mL-1的酪氨酸對照品溶液。分別按色氨酸、酪氨酸的測定參數(shù)繼續(xù)測定。以吸光度為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程。試驗(yàn)表明，色氨酸在50～150μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系；酪氨酸在100～900μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5精密度試驗(yàn)

依照2.3項(xiàng)下制備對照品溶液，分別精密吸取色氨酸和酪氨酸對照品溶液重復(fù)測定6次，測定峰面積積分值，對照品峰面積積分值的RSD分別為0.51%和0.53%。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)精密度良好。

2.6重現(xiàn)性試驗(yàn)

分別稱取同批復(fù)方氨基酸注射液樣品6份，分別依照2.3項(xiàng)下供試品制備方法制備供試品，按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)含量測定項(xiàng)下方法測定含量，并計算樣品的RSD值，RSD值為0.77%，0.68%，結(jié)果表明，此含量測定方法的重現(xiàn)性良好。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)

依照2.3項(xiàng)下供試品制備方法制備供試品溶液，分別在0，2，4，8，10h進(jìn)樣測定，供試品色氨酸和酪氨酸峰面積的RSD分別為0.69%和0.76%。結(jié)果表明色氨酸和酪氨酸至少在10h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8回收率試驗(yàn)

采用加樣回收試驗(yàn)，取已知含量的同一批供試品各6份，分精密添加一定量的色氨酸和酪氨酸對照品，按供試品制備所述方法制備供試品溶液，測定含量，計算回收率。6次測定的平均回收率分別為99.5%和99.5%，RSD分別為0.63%和0.55%。

2.9樣品含量測定

依照上述含量測定方法，測定復(fù)方氨基酸注射液三批樣品中色氨酸和酪氨酸的含量，結(jié)果三批樣品的色氨酸和酪氨酸含量分別為標(biāo)示量的99.6%、100.1%、99.5%和99.5%、99.6%、100.2%。

3.討論

分別考察甲醇-乙腈-0.1%醋酸鈉水溶液（5：10：85），甲醇-四氫呋喃-0.075mol/L醋酸鈉緩沖液（pH4.5）（30：20：50），乙腈-四氫呋喃-三乙胺磷酸緩沖液（25：15：60），甲醇-乙腈-0.1%醋酸鈉水溶液（3：5：92），甲醇-乙腈-水（40：40：20），10.25mol/L醋酸鋅-50mmol/L醋酸溶液（含3%乙腈），乙腈-0.1%醋酸鈉水溶液（8：92）不同比例的流動相，結(jié)果以甲醇-乙腈-0.1%醋酸鈉水溶液（3：5：92）為流動相，供試品各峰分離效果最好，故選用甲醇-乙腈-0.1%醋酸鈉水溶液（3：5：92）為流動相。復(fù)方氨基酸注射液中色氨酸和酪氨酸的含量為標(biāo)示量的95%-105%。 [科]

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