5株鵝細(xì)小病毒分離鑒定及VP3基因遺傳進(jìn)化分析

摘 要：從江蘇省各市鵝場死亡的、具有小鵝瘟典型病變的雛鵝肝、脾、腸病料組織中分離到5株病毒分離物。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)鑒定，該5株病毒分離能與小鵝瘟陽性血清發(fā)生沉淀反應(yīng)，并均能使用針對小鵝瘟病毒VP3基因特異性引物擴(kuò)增出與目的條帶大小一致的DNA片段。將PCR產(chǎn)物純化、連接、轉(zhuǎn)化、TA克隆等一系列實(shí)驗(yàn)后將獲得陽性重組質(zhì)粒送測序。另外，為了探究該病毒的遺傳進(jìn)化方向，本研究同時(shí)對鵝細(xì)小病毒VP3基因進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析。

關(guān)鍵詞：鵝細(xì)小病毒；瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)；序列測定；遺傳進(jìn)化

鵝細(xì)小病毒病又稱小鵝瘟，其作為一種急性傳染病給養(yǎng)鵝業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響了養(yǎng)鵝業(yè)的健康發(fā)展。該病主要侵害1月齡以內(nèi)的雛鵝，發(fā)病后主要表現(xiàn)為精神萎靡、食欲廢絕、嚴(yán)重下痢和滲出性腸炎等癥狀[1]。該病的病原為鵝細(xì)小病毒（Goose Parvovirus，GPV），該病毒屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬，GPV僅有一個(gè)血清型[2]，病毒粒徑約20 nm，是目前已知的動(dòng)物病毒中較小、較簡單的病毒之一[3]。我國學(xué)者方定一于1956年首次在江蘇揚(yáng)州發(fā)現(xiàn)并命名為“小鵝瘟”[1]。匈牙利學(xué)者德舍氏（Derzsy’s）于1966年首次使用鵝胚分離到該病毒；1974年，世界家禽協(xié)會(huì)將其正式命名為Derzsy’s病，隨后GPV不斷蔓延至中國臺(tái)灣[4]、匈牙利[5，6]、英國[7]、日本[8]、泰國[9]、德國[10]、美國[11]、瑞典[12]和波蘭[13]等多個(gè)國家和地區(qū)，給全球養(yǎng)鵝業(yè)造成了嚴(yán)重危害。本研究從江蘇省各市鵝場病死雛鵝的肝、脾、腸病料中分離到5株病毒。通過實(shí)驗(yàn)室診斷證明所分離的5株野外病毒均為小鵝瘟病毒，本研究中同時(shí)對該5株GPV的VP3基因進(jìn)行序列測定并進(jìn)行了系統(tǒng)的遺傳進(jìn)化分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料

江蘇省各市鵝場死亡的，具有小鵝瘟典型病變的雛鵝肝、脾、腸病料組織，病料來源及分離時(shí)間見表1。

1.1.2 種胚

9～10日齡SPF胚購自北京梅里亞SPF種禽場；鵝胚購自高郵市非免種鵝場。

1.1.3 抗原與血清

GPV瓊擴(kuò)標(biāo)準(zhǔn)抗原、陽性血清均由本研究中心制備。

1.1.4 試劑及儀器

Taq酶、RNA酶、氨芐青霉素、IPTG、X-gal、dNTP、DNA marker、pEASY-T3 Cloning Kit和膠回收試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；EDTA、Tris堿、SDS和蛋白酶K購自Sigma公司；EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶購自Fermentas公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純級；PCR擴(kuò)增儀為美國ABI公司產(chǎn)品，型號為GeneAmp PCR System 9700；高速冷凍離心機(jī)為美國Sigma公司產(chǎn)品，型號為3K15；小鵝瘟病毒VP3基因的特異性引物：P1：5’-CCAAGCTACAACAACCACAT-3’和P2：5’-TGAGCGAACATGCTATGGAAGG-3’，目的條帶大小為539 bp。

1.2 方法

1.2.1 病毒分離及傳代

取具有典型病變鵝的肝、脾、腸組織，剪碎，按1∶3加入滅菌PBS溶液，研磨，勻漿，經(jīng)超聲波處理后， 5 000 r/min離心15 min，反復(fù)凍融數(shù)次，取上清液加青、鏈霉素雙抗至2 000 U/mL和2 mg/mL，接種非免疫鵝胚，0.2 mL/枚，置38 ℃孵育。收取72 h后死亡鵝胚的尿囊液，分裝成若干青霉素小瓶，每瓶1 mL～2 mL，-70 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩Ｃ看O(shè)不接種的正常鵝胚作對照。傳代時(shí)尿囊液均作1∶100稀釋，分別接種6～8枚鵝胚，每胚0.2 mL，取72 h～120 h之間死亡的鵝胚尿囊液。

1.2.2 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（AGP）

按照參考文獻(xiàn)所述的方法進(jìn)行抗原純化濃縮，取死亡胚尿囊液，經(jīng)6 000 r/min離心20 min棄沉淀，加等量氯仿混合，6 000 r/min離心30 min取上清，經(jīng)PEG 6000棄沉淀濃縮20倍后制成待檢抗原[14]。參照《獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》中的方法進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)[15]。簡述之，在瓊擴(kuò)板周圍孔加入不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)抗小鵝瘟病毒陽性血清，中心孔依次加入標(biāo)準(zhǔn)抗原、待檢病毒分離物和正常鵝胚尿囊液。

1.2.3 紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)

根據(jù)前述方法將病毒液進(jìn)行純化后濃縮2倍制備待檢病毒液。將待檢病毒液用磷酸鹽緩沖液在“U”型板中進(jìn)行2倍連續(xù)倍比稀釋，每孔25 μL，最后1孔加相同體積的磷酸鹽緩沖液作對照。隨即向各孔內(nèi)加入25 μL的 1 %各種動(dòng)物的紅細(xì)胞，充分混勻，37 ℃放置15 min后檢查結(jié)果。

1.2.4 病毒基因組提取

按照參考文獻(xiàn)[4]所述的方法提取GPV各分離株的基因組，簡述之：500 μL尿囊液與裂解緩沖液（含有pH 8.0的50 mM的Tris，5 mM EDTA，2 % SDS和200 μg/mL的蛋白酶K）等體積的混合，完全混勻后使用等體積的酚氯仿（苯酚∶氯仿=1∶1）抽提兩次，12 000 r/min離心10 min后吸取上清使用兩倍體積的無水乙醇進(jìn)行沉淀，-20 ℃放置10 min后12 000 r/min離心10 min后棄上清，使用70 %的酒精溶液清洗沉淀后TE緩沖液溶解， -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 鵝細(xì)小病毒VP3基因的擴(kuò)增及序列測定

以提取的基因組DNA為模板、P1、P2為引物擴(kuò)增VP3基因片段。反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；最后進(jìn)行72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。目的DNA片段與TA克隆載體相連后，經(jīng)轉(zhuǎn)化、挑斑、搖菌、質(zhì)粒提取及鑒定后，將含有重組質(zhì)粒的陽性克隆斑送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

1.2.6 小鵝瘟病毒VP3基因遺傳進(jìn)化分析

將測序結(jié)果進(jìn)行BLAST搜索后，下載并整理了107株小鵝瘟病毒及19株番鴨細(xì)小病毒VP3基因的序列數(shù)據(jù)。使用Lasergene7.1軟件包中的Meaglin軟件進(jìn)行比對，然后使用BioEdit軟件進(jìn)行序列整理，最后對比對后的序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。遺傳進(jìn)化樹利用MEGA 6.0軟件中的最大似然法進(jìn)行構(gòu)建，軟件預(yù)測最佳替換模式為K2+G。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離

鵝胚接種后，多數(shù)胚死亡時(shí)間在60 h～120 h之間，未接種的對照鵝胚均健康存活。與對照鵝胚相比，感染胚可見絨毛尿囊膜增厚，胚胎發(fā)育阻滯，胚體全身嚴(yán)重出血，胚頭充血嚴(yán)重（圖1）；多數(shù)胚胎的心、肝、腎有出血，少數(shù)胚胎的心肌蒼白。

2.2 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（AGP）結(jié)果

瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果表明，用死亡鵝胚尿囊液制備的病毒濃縮抗原能與GPV陽性血清發(fā)生沉淀反應(yīng)，并與小鵝瘟診斷抗原和陽性血清形成的沉淀線吻合。

2.3 紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)結(jié)果

所有5株病毒分離物均不凝集雞、鴨、鵝、豚鼠及兔子的紅細(xì)胞。

2.4 PCR鑒定結(jié)果

GPV各分離株VP3基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，均可見約539 bp的目的條帶，DNA大小與預(yù)期的結(jié)果相符（圖2），結(jié)果表明這5株病毒分離物中均有GPV。經(jīng)雞胚接種實(shí)驗(yàn)、瓊脂糖擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)及PCR檢測實(shí)驗(yàn)充分證實(shí)了這5株病毒分離物均為GPV，并將1～5號病毒分離物分別命名為Goose parvovirus/nanjing/09、Goose parvovirus/taizhou/12、Goose parvovirus/nantong/12、Goose parvovirus/yangzhou/08、Goose parvovirus/yangzhou/11。

2.5 小鵝瘟VP3基因遺傳進(jìn)化分析結(jié)果

使用MEGA5.0遺傳進(jìn)化分析軟件構(gòu)建的ML進(jìn)化樹見圖3，從遺傳進(jìn)化樹來看，GPV與MDPV分布在不同的兩個(gè)分支，這符合該病毒屬一般規(guī)律[16，17]。而GPV又進(jìn)一步演化為3個(gè)分支。本研究中5株GPV分離株中有4株處于國內(nèi)主要分支上，僅有1株（Goose parvovirus/yangzhou/11）與當(dāng)前市售活疫苗在同一分支。該結(jié)果表明隨著GPV病毒在野外的不斷遺傳變異，該病毒在不斷的進(jìn)化演變，從而出現(xiàn)了較新的基因型。

3 討論

本研究通過分離及鑒定獲得了5株GPV野外分離株，并對這5株GPV進(jìn)行了系統(tǒng)遺傳進(jìn)化分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明國內(nèi)主要分支已逐漸形成了新的基因亞型，并且與中國臺(tái)灣的主要分離株具有較近的親緣關(guān)系。但中國臺(tái)灣因其與大陸相分離的特點(diǎn)，也逐漸出現(xiàn)了與內(nèi)陸不同基因型的分支，其與波蘭、美國、匈牙利、德國、英國及法國形成了國外分支。市售活疫苗為1961年從中國大陸分離到的野毒經(jīng)多次傳代致弱而來，但從當(dāng)前病毒分離及遺傳進(jìn)化分析結(jié)果來看，該分支已逐漸淡去其主要流行的特點(diǎn)，本研究中于2011年分離到的一株病毒是該分支最晚分離到，其他市售疫苗分支上的分離株的分離年代均較久遠(yuǎn)。根據(jù)基因型越相近其免疫保護(hù)效果越確實(shí)的一般規(guī)律[18]，我們分析認(rèn)為如果使用國內(nèi)主要分支上的流行株作為疫苗候選株進(jìn)行疫苗的開發(fā)，更具有生物學(xué)意義。

參考文獻(xiàn)：（18篇，略）