現(xiàn)代生物技術(shù)的應(yīng)用與管理
2015-04-29 00:00:00張冬煒
【摘 要】在科學(xué)技術(shù)迅速發(fā)展的21世紀(jì)，生物技術(shù)作為一種可能改變未來經(jīng)濟(jì)格局的技術(shù)，在醫(yī)藥健康、環(huán)境保護(hù)、新能源、新材料，現(xiàn)代農(nóng)業(yè)和海洋等領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用，然而盲目地開發(fā)與濫用同樣會給人類健康和生態(tài)環(huán)境帶來潛在的威脅，對其進(jìn)行合理的利用和管理就顯得尤為關(guān)鍵。以三種具有代表性的生物技術(shù)為例，結(jié)合其具體的應(yīng)用價(jià)值分別論述了它們的發(fā)展與前景，研究探討了促進(jìn)社會經(jīng)濟(jì)效益的管理方法，并根據(jù)當(dāng)前趨勢提出建議以供相關(guān)領(lǐng)域的同行和專家參考借鑒。
【關(guān)鍵詞】生物技術(shù)；基因測序；生物芯片；雙向電泳；管理
The Application and Management of Modern Biotechnology
ZHANG Dong-wei
（Shanghai Jiemin Biotechnology Co.，Ltd China Shanghai 200000）
【Abstract】During the rapid development of science and technology in the 21st century，biotechnology plays a very important role in healthcare， environment，new energy material，agriculture ocean etc.As a new possible solution that may transform the economic layout in the future，it could also cause serious consequences to human health and ecologic balance by over deployment or abuse， therefore proper utilization and management would become crucial.This article would describe the application and prospect about modern biotechnology by three classic examples respectively， and then discuss several management approaches that could add more value to human society.Meanwhile it makes some suggestions for peers and experts’reference in related field based on current trends.
【Key words】Biotechnology；Gene sequencing；Biochip；Two-dimensional electrophoresis；Management
0.引言
生物技術(shù)（Biotechnology）是應(yīng)用生命科學(xué)研究成果，以人們的意志設(shè)計(jì)，對生物或生物的成分進(jìn)行改造和利用的綜合性新興技術(shù)，涵蓋了基因工程、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、胚胎學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)、信息學(xué)和計(jì)算機(jī)科學(xué)等多門學(xué)科，具有廣泛的應(yīng)用前景。近半個世紀(jì)來，生命科學(xué)在分子水平上取得了突破性成就，生物技術(shù)也得到了長足的發(fā)展，生物學(xué)家的研究重心從揭示生命的所有遺傳信息轉(zhuǎn)移到在整體水平上對生物功能的研究。生命科學(xué)是實(shí)驗(yàn)科學(xué)，快速準(zhǔn)確地獲得生物體的遺傳信息對于生命科學(xué)研究具有十分重要的意義，因此生命科學(xué)的發(fā)展極大地依賴于生物技術(shù)的發(fā)展。以DNA序列分析技術(shù)為核心的基因組研究技術(shù)推動了基因組研究的日新月異；而以生物芯片技術(shù)為代表的基因表達(dá)研究技術(shù)為科學(xué)家了解基因表達(dá)規(guī)律立下汗馬功勞；在蛋白質(zhì)組研究中，二維電泳和質(zhì)譜技術(shù)的黃金組合又為科學(xué)家掌握蛋白質(zhì)的表達(dá)規(guī)律再鑄輝煌。在后工業(yè)化時(shí)代背景下，生物技術(shù)發(fā)展面臨的主要課題仍然是人口、環(huán)境和資源。
1.基因測序技術(shù)
基因是攜帶有遺傳信息的DNA或RNA序列，是控制性狀的基本遺傳單位。基因通過指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成來表達(dá)自己所攜帶的遺傳信息，從而控制著生物個體的性狀表現(xiàn)，支持著生命的基本構(gòu)造和性能。由30億個堿基對組成的人類基因組大約含有2.5～4萬個基因，儲存著生命的種族、血型、孕育、生長、凋亡過程的全部信息?；驕y序是國際上公認(rèn)的一種基因檢測標(biāo)準(zhǔn)，是基因工程和分子生物學(xué)領(lǐng)域最重要的技術(shù)之一。它能夠從血液、唾液等組織樣本中分析測定基因全序列，預(yù)測罹患多種疾病的風(fēng)險(xiǎn)，從而通過改善自己的生活環(huán)境和生活習(xí)慣，避免或延緩疾病的發(fā)生。目前仍然主要應(yīng)用于科研領(lǐng)域，在相關(guān)準(zhǔn)入標(biāo)準(zhǔn)、管理規(guī)范出臺以前，還不能夠應(yīng)用于臨床實(shí)踐。
基因測序技術(shù)是遺傳學(xué)研究發(fā)展起來的，能夠真實(shí)反映DNA的遺傳信息，是了解基因結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)，可以應(yīng)用于腫瘤學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)等多門學(xué)科。1977年Maxam和Gilbert報(bào)道了化學(xué)降解法，同年Sanger推出了雙脫氧鏈終止法，Sanger法簡便快捷并且適合于自動化測序，因而得到了廣泛的應(yīng)用。上世紀(jì)80～90年代，學(xué)術(shù)界開始涉足人類基因組計(jì)劃，有力地推動了全自動測序技術(shù)的發(fā)展。基因測序儀得到了重大改進(jìn)，毛細(xì)管電泳取代了傳統(tǒng)的薄層板凝膠電泳，采用專利的熒光標(biāo)記和CCD成像技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了自動灌膠、進(jìn)樣、數(shù)據(jù)收集與分析等功能，是一臺可以測定DNA的堿基順序或定量DNA片段大小的精密儀器。在計(jì)算機(jī)控制下有96或384通道兩種可選模式，能夠在24小時(shí)無人干預(yù)狀態(tài)下工作，測序的平均成功率可達(dá)85%，讀長接近1000bp。配合不同的試劑盒還可以進(jìn)行微衛(wèi)星序列分析、單核苷酸多態(tài)性分析、基因突變檢測、HLA配型、法醫(yī)學(xué)上的親子和個體鑒定、微生物與病毒的分型與鑒定等。
圖1 基因測序
進(jìn)入21世紀(jì)后，采用微磁珠和高密度芯片的第二代測序技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，其核心思想是使DNA模板與固體表面相結(jié)合，然后邊合成邊測序，通過捕捉新合成的末端標(biāo)記來確定DNA序列，克服了傳統(tǒng)測序方法成本高、效率低等缺點(diǎn)。二代測序技術(shù)是測序技術(shù)發(fā)展過程中一次革命性的改變，是一次可以對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定的大規(guī)模平行測序技術(shù)，同時(shí)使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能，因此具有更好的尋找和發(fā)現(xiàn)新信息的能力，又被稱為深度測序[1]。例如利用合成法測序的454技術(shù)和利用連接法測序的SOLiD技術(shù)，這些測序平臺的共同特點(diǎn)是不需要大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)行DNA模板擴(kuò)增，由于測序讀長較短帶來了后續(xù)大量的數(shù)據(jù)拼接和注釋工作，其中454測序技術(shù)的讀長已經(jīng)提高到400bp，SOLiD系統(tǒng)原始堿基數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度大于99.94%。二代高通量測序可以幫助研究者跨過文庫構(gòu)建這一實(shí)驗(yàn)步驟，避免了亞克隆過程中引入的偏差，比較適合于對已知序列的基因組進(jìn)行重新測序，而在對全新的基因組進(jìn)行測序時(shí)還需要結(jié)合第一代測序技術(shù)。
運(yùn)用第一代Sanger測序技術(shù)完成人類基因組計(jì)劃耗資近30億美元，歷時(shí)大約13年；而第二代SOLiD技術(shù)完成基因組測序只需幾周的時(shí)間，成本降到100萬美元以下，單次運(yùn)行能產(chǎn)生50GB的數(shù)據(jù)，相當(dāng)于基因組的17倍覆蓋度。新一代測序技術(shù)提高了速度，但測序產(chǎn)生的海量數(shù)據(jù)卻為后續(xù)的分析與儲存帶來巨大的挑戰(zhàn)，現(xiàn)有的生物信息分析軟件還沒有能力處理如此大量的數(shù)據(jù)資料，只有發(fā)展出能迅速準(zhǔn)確分析和儲存大量測序數(shù)據(jù)的軟件和方法，才能充分體現(xiàn)出新技術(shù)高通量和高準(zhǔn)確度的應(yīng)用價(jià)值。另外新一代測序儀的價(jià)格大約在50～100萬美元，一般實(shí)驗(yàn)室是難以負(fù)擔(dān)的，因此對于Kb到Mb范圍的小型項(xiàng)目，傳統(tǒng)的DNA測序方法無疑還是最佳選擇。但在全基因組測序、鑒定體細(xì)胞突變及病毒細(xì)菌感染與變異等大型基因組計(jì)劃的實(shí)施中，新一代測序技術(shù)將發(fā)揮巨大作用。
第三代測序技術(shù)最大的特點(diǎn)是單分子實(shí)時(shí)測序，測序時(shí)無需PCR擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)了對每一條DNA分子的單獨(dú)測序，其分辨率具有不可比擬的優(yōu)勢，因此在稀有突變及其頻率的測定中可以大顯身手。單分子熒光測序是通過顯微鏡對DNA鏈合成時(shí)的熒光強(qiáng)度變化進(jìn)行實(shí)時(shí)記錄來完成的，在蝕刻有納米結(jié)構(gòu)的微陣列芯片上放置數(shù)以千計(jì)的波導(dǎo)管，每個波導(dǎo)管的空間僅能容納一個DNA分子外加一個DNA多聚酶分子，在一塊小小的芯片上能同時(shí)進(jìn)行數(shù)千個測序反應(yīng)；納米孔測序是借助電泳技術(shù)驅(qū)動單個分子逐一通過納米孔來實(shí)現(xiàn)的，在外切酶的輔助下，納米孔的直徑僅允許單個核酸聚合物通過，而不同堿基的帶電性質(zhì)不一樣，通過電信號的差異就能檢測出通過的堿基類別。三代測序技術(shù)保留了DNA聚合酶自身內(nèi)在的反應(yīng)速度和延續(xù)性，同時(shí)系統(tǒng)誤差和干擾會顯著減小，精確度能達(dá)到99.9999%[2]。利用這種技術(shù)組合，科研人員能夠在24小時(shí)內(nèi)獲取基因組信息，檢測費(fèi)用也降到了最低1千美元。據(jù)預(yù)測，DNA測序技術(shù)可能跟隨計(jì)算機(jī)技術(shù)和通訊技術(shù)成為第三個“摩爾定律化”的學(xué)科產(chǎn)業(yè)，并將推動個性化醫(yī)療的全面發(fā)展。
昂貴的費(fèi)用曾經(jīng)是阻礙個體基因組測序普及的最大障礙，而隨著新的高通量測序技術(shù)的發(fā)展，測序成本的不斷降低，以及在計(jì)算機(jī)技術(shù)的輔助下拼接大量的基因組序列信息，可以更加方便快捷地獲取個體遺傳信息，DNA測序技術(shù)已由一項(xiàng)前沿技術(shù)迅速普及為生命科學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。每一種測序方法都具有一定的優(yōu)勢和局限，針對特定目的的基因分析，進(jìn)行合理的評估，根據(jù)具體需求選擇或搭配合適的測序平臺才是最佳的解決方案，雖然第二、第三代測序技術(shù)有很大的通量，基于Sanger原理的毛細(xì)管電泳測序仍然是高精度測序的黃金標(biāo)準(zhǔn)，是一種既能從頭測序又能從頭組裝的成熟技術(shù)，可以協(xié)助驗(yàn)證新一代測序技術(shù)的準(zhǔn)確性和精確度。人類基因組計(jì)劃破譯了人類全部遺傳信息，使人類第一次在分子水平上全面地認(rèn)識自我，盡管發(fā)表于2001年的基因組仍然處于有待完善的階段中，但其已作為基因組的參照序列而被采用，成為生命科學(xué)轉(zhuǎn)化為實(shí)際應(yīng)用的基礎(chǔ)，并繼續(xù)對研究基因型和表現(xiàn)型的關(guān)系，揭示生物進(jìn)化和生命起源的奧秘發(fā)揮著重要的作用。
2.生物芯片技術(shù)
在20世紀(jì)末，生物技術(shù)和電子技術(shù)相結(jié)合誕生了半導(dǎo)體芯片的兄弟—生物芯片（biochip），這將給人類的生活和健康帶來深遠(yuǎn)的影響，對社會的可持續(xù)性發(fā)展也會起到不可估量的作用。目前主要分為兩大類：用于生物計(jì)算機(jī)等生物電子產(chǎn)品制造的生物電子芯片和用于各種生物大分子、細(xì)胞、組織操作以及生物化學(xué)反應(yīng)檢測的生物分析芯片，前一類目前在技術(shù)和應(yīng)用上還不成熟，一般情況下生物芯片所指的是生物分析芯片。生物芯片在生命科學(xué)研究及實(shí)踐、醫(yī)學(xué)科研及臨床、藥物設(shè)計(jì)、環(huán)境保護(hù)等各個領(lǐng)域有著廣泛的用武之地，既具有重大的基礎(chǔ)研究價(jià)值，又具有明顯的產(chǎn)業(yè)化前景。
生物芯片技術(shù)的起源最初得益于埃德溫·邁勒·薩瑟恩（Edwin Mellor Southern）提出的核酸雜交理論，即標(biāo)記的核酸分子能夠與被固化的與之互補(bǔ)配對的核酸分子雜交，從這一角度而言，Southern雜交可以被看作是生物芯片的雛形。生物芯片的基礎(chǔ)研究始于20世紀(jì)80年代末，本質(zhì)上是一種生物技術(shù)，主要是在生物遺傳學(xué)領(lǐng)域發(fā)展起來的，是融微電子學(xué)、生物學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)和計(jì)算機(jī)科學(xué)為一體的高度交叉的新技術(shù)。它是通過縮微技術(shù)，根據(jù)分子間特異性地相互作用的原理，將生命科學(xué)領(lǐng)域中不連續(xù)的分析過程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞、蛋白質(zhì)、基因及其它生物組分的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測。按照芯片上固化的生物材料的不同，可以將生物芯片劃分為基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、細(xì)胞芯片和組織芯片；根據(jù)原理的不同，還可以分為元件型、通道型微陣列芯片以及生物傳感芯片。由于常用硅片作為固相基質(zhì)，且在制備過程中模擬計(jì)算機(jī)芯片的制備技術(shù)，所以稱之為生物芯片技術(shù)。
微陣列芯片（microarray）是指高密度固定在支持介質(zhì)上包含生物信息的分子點(diǎn)陣，每個分子的序列及位置都是已知的，并且是預(yù)先設(shè)定好的。該技術(shù)采用光導(dǎo)原位合成或微量點(diǎn)樣等方法，將大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至組織切片、細(xì)胞等等生物樣品有序地固化于支持物的表面，組成密集二維分子排列，然后與已標(biāo)記的待測生物樣品中靶分子雜交，通過特定的儀器對雜交信號的強(qiáng)度進(jìn)行快速、并行、高效地檢測分析，從而獲取樣品中靶分子的數(shù)量或序列信息。例如基因芯片，它是DNA雜交探針技術(shù)與半導(dǎo)體工業(yè)技術(shù)相結(jié)合的結(jié)晶，具有高通量、微量化和自動化等特點(diǎn)?；蛐酒夹g(shù)由于同時(shí)將大量探針固定于支持物上，所以可以一次性對樣品大量序列進(jìn)行檢測和分析，從而解決了傳統(tǒng)核酸印跡雜交技術(shù)操作繁雜、序列數(shù)量少、檢測效率低等不足。而且，通過設(shè)計(jì)不同的探針陣列、使用特定的分析方法可使該技術(shù)具有多種不同的應(yīng)用價(jià)值，如基因表達(dá)譜測定、突變檢測、多態(tài)性分析、基因組文庫作圖及雜交測序等。表達(dá)譜基因芯片是用于基因功能研究的一種基因芯片，是目前技術(shù)比較成熟，應(yīng)用最廣泛的一種基因芯片，其主要的優(yōu)點(diǎn)是：檢測系統(tǒng)的微型化，對樣品需要量非常小，檢測基因表達(dá)變化的靈敏度高，可檢測豐度相差幾個數(shù)量級的表達(dá)情況，而且節(jié)約費(fèi)用和時(shí)間。采用表達(dá)譜基因芯片研究基因表達(dá)可以同時(shí)研究上萬個基因的表達(dá)變化，研究效率明顯提高，能更多地揭示基因之間表達(dá)變化的相互關(guān)系，從而研究基因與基因之間內(nèi)在的作用關(guān)系，使研究更具目的性和系統(tǒng)性，同時(shí)也拓寬研究領(lǐng)域。微陣列芯片技術(shù)是系統(tǒng)生物技術(shù)的基本內(nèi)容，能為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展提供強(qiáng)有力的手段，促進(jìn)醫(yī)學(xué)從“系統(tǒng)、血管、組織和細(xì)胞層次”向“DNA、RNA、蛋白質(zhì)及其相互作用層次”過渡。
圖2 基因芯片
微型芯片實(shí)驗(yàn)室（lab-on-a-chip）是生物芯片技術(shù)發(fā)展的高級階段，或稱微全分析系統(tǒng)（Micro Total Analysis System），是指把生物或化學(xué)領(lǐng)域所涉及的樣品制備、生物與化學(xué)反應(yīng)、分離檢測等基本操作單位集成于一塊幾平方厘米的芯片上，用以完成不同的生物或化學(xué)反應(yīng)過程，并對其產(chǎn)物進(jìn)行分析的一種技術(shù)。它是通過分析化學(xué)、微機(jī)電加工、計(jì)算機(jī)、電子學(xué)、材料科學(xué)與生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和工程學(xué)等技術(shù)，實(shí)現(xiàn)從試樣處理到檢測的微型化、自動化與集成化這一目標(biāo)。功能化芯片實(shí)驗(yàn)室大體包括三個部分：一是芯片，將微泵、微閥、管道、流量控制與反應(yīng)器等高度集成化，完成液體在芯片內(nèi)部的定向流動與分配等功能；二是分析儀，包括驅(qū)動源和信號檢測裝置；三是實(shí)現(xiàn)芯片功能化的方法與試劑盒[3]。最近的發(fā)展表明，90年代初由Manz等人提出的以微電子加工技術(shù)為依托的芯片實(shí)驗(yàn)室的發(fā)展將會像四十年前微電子技術(shù)在信息科學(xué)的發(fā)展中引發(fā)一場革命一樣，預(yù)計(jì)芯片實(shí)驗(yàn)室將在未來的發(fā)展中對分析科學(xué)乃至整個科學(xué)技術(shù)以及相關(guān)的產(chǎn)業(yè)界產(chǎn)生相似的作用。計(jì)算機(jī)芯片使計(jì)算微型化，而芯片實(shí)驗(yàn)室使實(shí)驗(yàn)室微型化，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域它可以使珍貴的生物樣品和試劑消耗降低到微升甚至納升級，而且分析速度成倍提高，成本成倍下降；在化學(xué)領(lǐng)域，以前需要在一個大實(shí)驗(yàn)室花費(fèi)大量樣品、試劑和很多時(shí)間才能完成的分析和合成，將在一塊小的芯片上花很少量樣品和試劑以很短的時(shí)間同時(shí)完成；在分析化學(xué)領(lǐng)域，它可以使以前大的分析儀器變成平方厘米尺寸規(guī)模的分析儀，將大大節(jié)約資源和能源。芯片實(shí)驗(yàn)室排污很少，所以是一種“綠色”技術(shù)。
目前，生物芯片已從主要應(yīng)用的生命科學(xué)領(lǐng)域擴(kuò)展到其它領(lǐng)域，產(chǎn)業(yè)化發(fā)展越來越明顯、越快速。例如用于DNA、RNA、蛋白質(zhì)等方向分析檢測，還用于化學(xué)和生物試劑、環(huán)境污染的監(jiān)測；監(jiān)控微秒級的化學(xué)和生物化學(xué)反應(yīng)動力學(xué)；用于許多化學(xué)合成反應(yīng)的研究，藥物和化學(xué)合成與篩選等。因此，芯片實(shí)驗(yàn)室不僅為生物醫(yī)學(xué)家，也為合成化學(xué)家打開了通往無限美好明天的大門。由于它的基礎(chǔ)研究和技術(shù)研究越來越專和精，使整體技術(shù)發(fā)展速度加快，再加之它朝著檢測功能化方面發(fā)展，可能成為新的經(jīng)濟(jì)增長點(diǎn)。因此生物芯片在經(jīng)濟(jì)、社會及科研等方面的應(yīng)用前景越來越廣，其產(chǎn)值有可能超過微電子芯片，成為下一個具有巨大商業(yè)潛力的高技術(shù)產(chǎn)業(yè)。
3.蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)
蛋白質(zhì)（protein）是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)和生命活動的主要承擔(dān)者，是構(gòu)成生物體的主要大分子。蛋白質(zhì)占人體重量的16%～20%，人體內(nèi)蛋白質(zhì)的種類很多，性質(zhì)、功能各異，但都是由20多種氨基酸按不同比例組合而成的，并在體內(nèi)不斷進(jìn)行代謝與更新。1994年由Marc Wilkins提出了蛋白質(zhì)組學(xué)，指的是在大規(guī)模水平上研究蛋白質(zhì)的特征，包括蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，翻譯后的修飾，蛋白與蛋白相互作用等，由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于疾病發(fā)生，細(xì)胞代謝等過程的整體而全面的認(rèn)識。蛋白質(zhì)組的研究不僅能為生命活動規(guī)律提供物質(zhì)基礎(chǔ)，也能為眾多種疾病機(jī)理的闡明及攻克提供理論根據(jù)和解決途徑，蛋白質(zhì)組研究的發(fā)展是以雙向電泳技術(shù)作為核心的。
雙向電泳技術(shù)（two-dimensional electrophoresis）是分析從細(xì)胞、組織或其他生物樣本中提取的蛋白質(zhì)混合物的有力手段，通過第一向等電聚焦和第二向聚丙烯酰胺凝膠電泳，將不同種類的蛋白質(zhì)按照等電點(diǎn)和分子量的差異在二維平面上進(jìn)行分離，并得到每種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)、表觀分子量和含量等信息。等電聚焦電泳是60年代中期問世的一種利用等電點(diǎn)不同在pH梯度介質(zhì)上分離蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)，其特點(diǎn)是分辨率高，不受擴(kuò)散作用的影響。等電聚焦是一個與pH相關(guān)的平衡過程，蛋白質(zhì)分子在含有載體兩性電解質(zhì)形成的一個連續(xù)而穩(wěn)定的線性pH梯度中電泳，在偏離其等電點(diǎn)的pH條件下帶有電荷，當(dāng)其遷移至等電點(diǎn)的位置時(shí)靜電荷數(shù)為零，這樣蛋白質(zhì)在電場中以不同的速率靠近并最終停留在各自的pI值；聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺作為支持介質(zhì)的一種常用電泳技術(shù)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠具有分子篩效應(yīng)，加入陰離子去污劑和強(qiáng)還原劑十二烷基硫酸鈉后，能消除不同蛋白分子間的電荷差異和結(jié)構(gòu)差異，因而電泳遷移率就取決于分子量的大小，可以直接測定蛋白質(zhì)的分子量，一般采用不連續(xù)緩沖系統(tǒng)來獲得較高的分辨率[4]。O’Farrell于1975年首次建立二維電泳并成功地分離出約1000個E.coli蛋白，并表明蛋白質(zhì)譜不是穩(wěn)定的，而是隨環(huán)境而變化的。隨著技術(shù)的飛速發(fā)展，現(xiàn)在最多已能分離出10000個斑點(diǎn)，當(dāng)雙向電泳斑點(diǎn)的全面分析成為現(xiàn)實(shí)的時(shí)候，蛋白質(zhì)組的分析變得可行。
蛋白質(zhì)組研究實(shí)質(zhì)上是在細(xì)胞水平上對蛋白質(zhì)進(jìn)行大規(guī)模的平行分離和分析，因而要求有高分辨率的蛋白質(zhì)分離技術(shù)及準(zhǔn)確、靈敏的質(zhì)譜鑒定技術(shù)，如何提高雙向電泳的分離容量、靈敏度和分辨率以及對蛋白質(zhì)差異表達(dá)的準(zhǔn)確檢測是目前雙向電泳技術(shù)發(fā)展的關(guān)鍵問題。雙向電泳技術(shù)雖然難以辨別低豐度蛋白，對操作要求也較高，但其通量高、分辨率和重復(fù)性好以及可與質(zhì)譜聯(lián)用的特點(diǎn)，使其成為目前最流行、可靠的蛋白質(zhì)組研究手段。以雙向電泳和質(zhì)譜分析為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究的程序?yàn)椋簶悠分苽洹入娋劢埂郾０纺z電泳→凝膠染色成像→軟件分析定量→采集感興趣的蛋白質(zhì)點(diǎn)→膠內(nèi)酶切→質(zhì)譜分析確定肽指紋圖譜或部分氨基酸序列→利用數(shù)據(jù)庫確定蛋白。蛋白質(zhì)組研究的主要困難是對用雙向凝膠電泳分離出來的蛋白質(zhì)進(jìn)行定性和定量的分析。
雙向電泳技術(shù)發(fā)展的趨勢是在第一維等電聚焦電泳中采用范圍窄的PH梯度凝膠，以及開發(fā)高靈敏度的的蛋白質(zhì)熒光染色技術(shù)，凝膠電泳中蛋白質(zhì)的著色不僅影響蛋白質(zhì)分離的分辨率，同時(shí)也影響后續(xù)的質(zhì)譜鑒定。樣品的制備和溶解同樣事關(guān)雙向電泳的成效，用化學(xué)法和機(jī)械裂解法破碎以盡可能溶解和解聚蛋白以提高分辨率。樣品預(yù)處理涉及溶解、變性和還原，可以完全破壞蛋白間的相互作用，并除去如核酸等非蛋白物質(zhì)。此外，固相化PH梯度技術(shù)建立了穩(wěn)定的并可以精確設(shè)定的PH梯度，避免了載體兩性電解質(zhì)向陰極漂移等許多缺點(diǎn)，增大了蛋白質(zhì)的上樣量，提高了雙向電泳的分辨率和可重復(fù)性[5]。蛋白質(zhì)研究技術(shù)遠(yuǎn)比基因技術(shù)復(fù)雜和困難，蛋白質(zhì)組學(xué)研究的成功與否，很大程度上取決于其技術(shù)方法水平的高低，可以說蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展既是技術(shù)所推動的也是受技術(shù)限制的。
圖3 蛋白質(zhì)雙向電泳
Unlu等提出了一種熒光差異顯示雙向電泳（F-2D-DIGE）的定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法，比經(jīng)典的雙向電泳具有更高的動力學(xué)范圍和靈敏性。差異凝膠電泳是雙向電泳在技術(shù)上的改良，結(jié)合多重?zé)晒夥治龅姆椒ǎ谕粔K膠上共同分離多個分別由不同熒光標(biāo)記的樣品，并第一次引入了內(nèi)標(biāo)的概念。兩種樣品中的蛋白質(zhì)采用不同的熒光標(biāo)記，混合后再進(jìn)行雙向電泳，用來檢測蛋白質(zhì)在兩種樣品中的表達(dá)情況，極大地提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性和可重復(fù)性。由于每個蛋白點(diǎn)都有自己的內(nèi)標(biāo)，軟件可全自動根據(jù)每個蛋白點(diǎn)的內(nèi)標(biāo)對其表達(dá)量進(jìn)行校準(zhǔn)，保證所檢測到的蛋白豐度變化是真實(shí)的，解決了系統(tǒng)誤差的問題。在DIGE技術(shù)中，不同樣品在同一凝膠上電泳后產(chǎn)生多個凝膠圖像，避免了幾種雙向電泳的比較，并且能夠在納克級進(jìn)行檢測，通過Internet可以獲得參考圖譜。較早期的雙向電泳相比，有兩個主要的進(jìn)步：首先，極高的重復(fù)性可以用來比較不同組織類型、不同狀態(tài)的基因表達(dá)；其次，高加樣量使得雙向電泳成為一項(xiàng)真正的制備型技術(shù)。
成功的二維電泳可以將2000到3000種蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，近年來經(jīng)過多方面改進(jìn)已成為研究蛋白質(zhì)組的最有使用價(jià)值的核心方法，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)成為現(xiàn)代生物技術(shù)快速發(fā)展的重要支撐，并將引領(lǐng)生物技術(shù)取得關(guān)鍵性的突破。由于雙向電泳技術(shù)在蛋白質(zhì)組與醫(yī)學(xué)研究中所處的重要位置，它可用于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后修飾研究，蛋白質(zhì)組的比較和蛋白質(zhì)間的相互作用，細(xì)胞分化凋亡研究，致病機(jī)制及耐藥機(jī)制的研究，療效監(jiān)測，新藥開發(fā)，癌癥研究，蛋白純度檢查，小量蛋白純化，新替代疫苗的研制等許多方面。通過對正常個體及病理個體間的蛋白質(zhì)組比較分析，可以找到某些疾病特異性的蛋白質(zhì)分子，它們可成為新藥物設(shè)計(jì)的分子靶點(diǎn)，或者也會為疾病的早期診斷提供分子標(biāo)志。確實(shí)，那些世界范圍內(nèi)銷路最好的藥物本身是蛋白質(zhì)或其作用靶點(diǎn)為某種蛋白質(zhì)分子。因此，蛋白質(zhì)組學(xué)研究不僅是探索生命奧秘的必須工作，也能為人類健康事業(yè)帶來巨大的利益。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究是生命科學(xué)進(jìn)入后基因組時(shí)代的特征，蛋白質(zhì)組學(xué)與其它大規(guī)?？茖W(xué)如基因組學(xué)，生物信息學(xué)等領(lǐng)域交叉融合，呈現(xiàn)出系統(tǒng)生物學(xué)（Systems Biology）研究模式，將成為未來生命科學(xué)的新前沿。
4.總結(jié)
我國具有豐富的生物資源，合理地開發(fā)和利用生物技術(shù)對國民經(jīng)濟(jì)的健康協(xié)調(diào)和可持續(xù)性發(fā)展有著非常重要的意義。另一方面，有效的創(chuàng)新能力不足，資金投入有限，管理和技術(shù)人才缺乏是目前制約生物技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展的主要因素。在資源有限的情況下，避免從事低水平，重復(fù)性的研究工作，相對集中一部分人力，物力和財(cái)力，建立集生物技術(shù)，自動化技術(shù)和信息技術(shù)為一體的研發(fā)中心，可能是適合我國國情的發(fā)展道路。加強(qiáng)各大專院校、科研院所重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備的配置和管理，優(yōu)化資源共享與人才交流的機(jī)制，創(chuàng)造良好的環(huán)境促進(jìn)具有明顯效益和前景的科研成果轉(zhuǎn)化應(yīng)用。條件成熟時(shí)，可以有針對性地根據(jù)具體需求，國內(nèi)自主研發(fā)新一代的科研儀器。
生物技術(shù)研究中不斷涌現(xiàn)出新信息、新技術(shù)、新療法、新藥物和新觀念等等新事物，在一定時(shí)期內(nèi)還難以判定其利弊優(yōu)劣，在采用它們或研究它們時(shí)，必然涉及道德、法律和社會問題。例如：生物信息的隱私權(quán)問題，基因診斷、治療和預(yù)防中的安全性問題，個人遺傳信息的知情同意權(quán)問題，并由此引發(fā)出來的保險(xiǎn)權(quán)、工作權(quán)、繼承權(quán)、生育權(quán)等等問題。面對當(dāng)前生命科學(xué)工業(yè)的趨勢形成，生物技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)當(dāng)有規(guī)化有節(jié)制地進(jìn)行，生物科技在一定程度上造福了人類社會，同時(shí)也帶來了環(huán)境安全和社會倫理等一系列問題，基于生物技術(shù)發(fā)展有可能帶來的不利影響，如何采取有效預(yù)防和控制措施，對其進(jìn)行科學(xué)管理，逐步提上了日程。
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