豬圓環(huán)病毒的研究進(jìn)展（續(xù)完）

摘 要：隨著人們對微量元素營養(yǎng)研究的不斷深入，其營養(yǎng)作用越來越被重視，本文綜述了微量元素鋅在豬體內(nèi)的分布、生理代謝及營養(yǎng)作用。

關(guān)鍵詞：鋅；分布；代謝；作用

4 診斷

4.1 病毒抗原檢測技術(shù)

4.1.1 間接免疫熒光試驗

該法是一種比較特異的血清學(xué)診斷方法。將病料接種PK15細(xì)胞，用兔抗高免血清與細(xì)胞培養(yǎng)物反應(yīng)，可對PCV進(jìn)行檢測和定性。Allan等利用間接免疫熒光法來檢測PCV-2，將組織病料以蓋玻片在PK15細(xì)胞上培養(yǎng)，丙酮固定，用兔抗PCV-2高免血清與細(xì)胞培養(yǎng)物中的PCV-2反應(yīng)，對PCV-2進(jìn)行檢測和分型。

4.1.2 核酸探針及原位雜交技術(shù)

原位雜交是應(yīng)用已知堿基順序并帶有標(biāo)記物的核酸探針與組織、細(xì)胞中待檢測的核酸按堿基配對的原則進(jìn)行特異性結(jié)合而形成雜交體，然后再應(yīng)用與標(biāo)記物相應(yīng)的檢測系統(tǒng)，通過組織化學(xué)或免疫組織化學(xué)方法在被檢測的核酸原位形成帶顏色的雜交信號，在顯微鏡或電子顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位。Kim等針對PCV-1（ORF1）的349 bp特異DNA片段和PCV-2（ORF2）的481 bp特異DNA片段，借助于PCR技術(shù)獲得這兩個目的片段，進(jìn)行地高辛標(biāo)記，然后用于原位雜交，從福爾馬林固定、石蠟包埋的組織中檢測病毒的DNA。原位雜交技術(shù)是結(jié)合病理學(xué)技術(shù)和免疫學(xué)技術(shù)而進(jìn)行的，其檢測靈敏度較高，而且能夠精確定位，但其操作復(fù)雜，并需要專業(yè)的人員，它的應(yīng)用受到了極大的限制。

4.1.3 PCR診斷技術(shù)

PCR技術(shù)以其敏感、特異、快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點成為目前病毒學(xué)診斷、分子生物學(xué)實驗最常用的技術(shù)之一，它也是在PCV的病原檢測和定型中最常用的技術(shù)。目前，國內(nèi)外已經(jīng)建立了多種檢測PCV-1與PCV-2的PCR技術(shù)。

王憲文等建立快速、簡便、特異的檢測豬圓環(huán)病毒II型的PCR方法，根據(jù)已發(fā)表的豬圓環(huán)病毒II型基因序列設(shè)計合成了一對引物，應(yīng)用PCR技術(shù)對豬圓環(huán)病毒進(jìn)行基因擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測定，以豬瘟病毒、豬偽狂犬病毒、豬細(xì)小病毒為對照，進(jìn)行特異性試驗，取部分病料進(jìn)行重復(fù)性試驗。結(jié)果PCR方法擴(kuò)增出了長度為702 bp的片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序和序列分析表明擴(kuò)增的序列為PCV-2序列；豬瘟病毒、豬偽狂犬病毒、豬細(xì)小病毒的PCR擴(kuò)增均為陰性。呂艷麗等根據(jù)PCV-2的基因序列設(shè)計一對特異的PCR引物進(jìn)行PCR檢測，建立了特異的PCR診斷方法。該方法可以檢測細(xì)胞和組織中的病毒核酸。

Ouar dani等根據(jù)已發(fā)表的PCV-2和PCV-1基因序列設(shè)計了兩套引物，一套中的一對引物針對PCV-1和PCV-2的ORF2基因序列可擴(kuò)增出488 bp的目的條帶，另一對引物針對PCV-1的ORF1基因能擴(kuò)增出375 bp的基因片段，而對PCV2的ORF1不能擴(kuò)增；另一套中的一對引物針對PCV-1和PCV-2的ORF1基因序列均可擴(kuò)增出646 bp的目的條帶，另一對引物只對PCV-1的ORF2基因能擴(kuò)增出425 bp的目的條帶，而不能擴(kuò)增PCV-2的ORF2基因，從而能夠很好地區(qū)分PCV-1和PCV-2的感染。

王貴平等根據(jù)GenBank登錄的豬圓環(huán)病毒2 型（PCV-2）的全基因組序列，設(shè)計了2對引物，建立了檢測PCV-2的套式PCR方法。對該方法用序列分析、酶切等方法進(jìn)行了鑒定。同時用該套式PCR方法對華南地區(qū)287個豬場的1 560份樣品進(jìn)行了檢測，結(jié)果，983份為PCV-2陽性，陽性率為63 %。Kim等運用多重套式PCR來同時檢測PCV-1、PCV-2及PPV，并同原位雜交法進(jìn)行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種方法的檢出率均為100 %，因而證實了該法可以成功地同時檢測上述三種病毒。

Chung等建立了實時定量PCR方法用于PRRSV c DNA和PCV-2 DNA的定量檢測，應(yīng)用該方法對自然感染豬和攻毒豬的PRRSV和PCV-2在肺、脾、扁桃體及淋巴器官中的分布和定量進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，PRRSV和PCV-2病毒載量分別5.73～8.38和5.65～6.91（拷貝數(shù)/mg）。已建立的定量PCR方法可能是將來疫苗研制和發(fā)病機(jī)理研究的有用工具.

Fenaux M等先以PCR快速而有效地擴(kuò)增微量的豬圓環(huán)病毒DNA，然后再利用RELP區(qū)分PCV1和PCV2，以此來進(jìn)行豬圓環(huán)病毒的檢測和定型。他們根據(jù)PCV1和PCV2的243 bp片段，利用僅在PCV2上有的限制性酶切片段位點NcoI來鑒定PCV1和PCV2。PCV2的PCR產(chǎn)物可被NcoI切成168 bp和75 bp的兩個片段，而在PCV1的PCR產(chǎn)物上則無NcoI的位點，所以不能被NcoI切割，這樣就可以直接區(qū)分PCV1和PCV2了。

4.1.4 核酸環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（LAMP）技術(shù)

LAMP在保持PCR技術(shù)優(yōu)點的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步增強(qiáng)了反應(yīng)的特異性和縮短了檢測時間。陳豪泰等利用LAMP技術(shù)針對豬圓環(huán)病毒II型的cap基因進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果表明該方法較常規(guī)PcR方法敏感，最低檢出限僅為5個拷貝數(shù)。

4.2 病毒抗體檢測技術(shù)

ELISA方法是目前檢測PCV-2病毒抗體最常用有的方法，郎洪武等用加拿大PCV-2克隆化特異性表達(dá)抗原陽性血清、陰性血清，按常規(guī)ELISA法進(jìn)行斷奶仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合征抗體檢測，被檢血清以1∶400稀釋，陽性和陰性對照血清以1∶100稀釋，當(dāng)被檢樣品的OD值≥3倍陽性對照OD值時判為陽性，否則為陰性。該法靈敏度較高。崔尚金等采用PCV抗原和正常細(xì)胞對照抗原，建立了間接ELISA，并被農(nóng)業(yè)部推薦為進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查的方法。Walker等首次利用PCV-1和PCV-2特異性單克隆抗體建立了競爭ELISA方法來檢測PCV22抗體，并將該方法和間接免疫熒光方法相比較，對來自英國、加拿大和法國的484份感染PCV-2的豬血清的檢測結(jié)果表明，競爭ELISA方法的檢出率為99.58 %，而間接免疫熒光的檢出率僅為97.14 %。張志慧等采用IPMA法標(biāo)定不同PCV-2抗體效價的陽標(biāo)準(zhǔn)陽性血清50份和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清30份，對5種PCV-2-ELISA抗體檢測試劑盒的敏感性、特異性及符合率進(jìn)行平行檢測，結(jié)果顯示，這5種試劑盒的敏感性為74.0 %～96.0 %，特異性為83.3 %～96.7 %，符合率為77.5 %～96.3 %，其中以國產(chǎn)阻斷ELISA試劑盒和Ingenasa公司的試劑盒效果最好。此外，本研究采用國產(chǎn)阻斷ELISA試劑盒對PCV-2疫苗免疫豬血清抗體檢測表明，疫苗免疫21 d后抗體陽性率達(dá)50 %，免疫28 d抗體陽性率達(dá)100 %；對PCV-2人工感染豬血清抗體檢測顯示，病毒接種后第28 d抗體陽性率為30.0 %，第42天陽性率為100 %；對臨床送檢豬血清抗體檢測表明，PCV-2抗體陽性率介于45.0 %～76.5 %。本研究通過對PCV-2五種抗體檢測試劑盒的比較及應(yīng)用顯示，國產(chǎn)阻斷ELISA試劑盒可以作為檢測PCV-2疫苗免疫及臨床感染豬血清抗體的有效方法。

5 疫苗

PCV-2是一種豬疾病綜合征的病原體，這種疾病綜合征在歐洲被稱為豬圓環(huán)病毒病（PCVD），在美國被稱為豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病（PCVAD），在世界上養(yǎng)豬業(yè)比較發(fā)達(dá)的國家，PCV-2被認(rèn)為是給養(yǎng)豬業(yè)帶來損失最多的病原體之一。疫苗免疫接種是防控PCVD的有效手段，國內(nèi)外學(xué)者在PCV-2疫苗研究方面開展了大量研究。

5.1 現(xiàn)有商品化疫苗

2004年，第一個商品化的PCV-2疫苗在法國和德國面世。目前市場上用于預(yù)防豬群中PCVAD發(fā)生的商品化疫苗一共有7種，分別由Meriall、Boehringer Ingelheim、ntervet、Schering-Plough、Pfize、上海海利和南農(nóng)高科7家公司生產(chǎn)，其中滅活疫苗三種、亞單位疫苗三種、嵌合疫苗一種，在對照攻毒試驗中，市售PCV-2疫苗的效果已得到了廣泛的檢驗，證明這些商品化疫苗在對抗PCV-2感染時具有良好效果。為有效防控PCV-2感染發(fā)揮了重要作用。

5.2 正在開發(fā)疫苗

現(xiàn)在市面上的商品化PCV-2疫苗大部分都是基于PCV-2a基因型的，而且效果確實，但是現(xiàn)在世界范圍內(nèi)豬群PCV-2的主要流行亞型是PCV-2b基因型。此外，在PCV2活載體疫苗、核酸疫苗及標(biāo)記疫苗等新型基因工程疫苗的研究方面也取得了突破性進(jìn)展，也有望實現(xiàn)商品化。

5.2.1 嵌合疫苗

近年來已至少鑒別出了3種有明顯區(qū)別的PCV-2基因型，PCV-2a、PCV-2b和PCV-2c。PCV-2a和PCV-2b都不同程度的與PCVAD的發(fā)生相關(guān)；PCV一2c僅在丹麥的一些無臨床癥狀的豬群中有過報道，目前一些流行病學(xué)方面的研究表明，自然感染PCV-2的豬群中流行亞型是PCV-2b，且PCV-2b的毒力似乎比PCV-2a更強(qiáng)一些，因此，也有人用PCV-2b的ORF2替換PCV-1的ORF2，包裝出了一種新的嵌合病毒。這種嵌合病毒在動物體內(nèi)是減毒的，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)，并且可以產(chǎn)生對PCV-2a的交叉保護(hù)。

5.2.2 DNA疫苗

研究證實，含PCV-2 ORF2基因的質(zhì)粒載體（pORF2）能誘導(dǎo)仔豬產(chǎn)生抗PCV-2感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答，F(xiàn)enaux等用PCVl-2嵌合病毒DNA疫苗免疫仔豬，免疫后42 d，檢測到大部分仔豬PCV-2抗體陽轉(zhuǎn)，攻毒后21 d，對照組仔豬出現(xiàn)病毒血癥，淋巴結(jié)腫大，淋巴組織衰竭等癥狀，而免疫組仔豬未出現(xiàn)病毒血癥，淋巴組織損傷程度較輕，淋巴組織的病毒載量顯著降低，表明PCVl—2嵌合病毒DNA疫苗可以有效預(yù)防PCV-2感染。目前，盡管DNA疫苗具有諸多優(yōu)點，但外源基因在體內(nèi)的表達(dá)調(diào)控及其在體細(xì)胞中的轉(zhuǎn)移可能會產(chǎn)生意外的免疫病理反應(yīng)等瓶頸問題，使得些DNA疫苗的前景還不甚明朗。

5.2.3 活載體疫苗

腺病毒作為基因轉(zhuǎn)移載體已廣泛應(yīng)用于基因工程疫苗研發(fā)，Wang等成功構(gòu)建了表達(dá)PCV-2 ORF2基因的重組腺病毒rAd-Cap，然后通過動物免疫保護(hù)試驗評價rAd-Cap對仔豬的免疫保護(hù)效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在首免后37 d即能檢測到抗PCV-2的高水平ELISA抗體和病毒中和抗體，免疫仔豬的相對日增體質(zhì)量率顯著高于攻毒對照組，而組織損傷程度和病毒血癥的發(fā)生率卻明顯低于攻毒對照組。偽狂犬病也是一種重要的豬病，經(jīng)常與圓環(huán)病毒合并感染。有報道稱用偽狂犬病病毒（PRV）作為活病毒疫苗載體的研究工作中取得突破性進(jìn)展，Ju等成功構(gòu)建了表達(dá)PCV2 ORFl-ORF2融合蛋白的重組偽狂犬病毒PRV-PCV2，Western blot試驗證實ORFl-ORF2融合蛋白在重組病毒中正確表達(dá)，用PRV-PCV2免疫小鼠后，能在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生抗PRV和PCV-2的特異性抗體，保護(hù)小鼠抵抗PRVEa強(qiáng)毒株攻擊；而且，仔豬免疫試驗也證實PRV-PCV-2能誘導(dǎo)仔豬產(chǎn)生針對PRV和PCV2的特異性免疫應(yīng)答。與重組腺病毒對比，重組偽狂犬病毒能在豬體內(nèi)很好地繁殖，因此，在PRV-PCV2二聯(lián)活載體疫苗研制方面具有巨大的潛力和應(yīng)用價值。Pei等在豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）cDNA克隆的ORFs1b與2a之問插入2個限制性酶切位點和1個轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列TRS6，將其改造成一個通用的病毒載體，然后將PCV-2 ORF2基因插入2個限制性酶切位點之間，由TRS6啟動轉(zhuǎn)錄，構(gòu)建了表達(dá)Cap蛋白的重組質(zhì)粒，用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞成功獲得了P129-PCV重組PRRSV。動物免疫試驗證實：免疫5周后，在P129-PCV免疫的豬體內(nèi)能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗PCV2特異性抗體應(yīng)答。

此外，還有以將病原體的保護(hù)性抗原與噬菌體的外殼蛋白以融合蛋白形式展示于噬菌體的表面，構(gòu)建的表達(dá)外源抗原的噬菌體載體疫苗；用乳酸球菌作為遞呈載體來表達(dá)PCV-2 Cap蛋白從而制備口服疫苗；還有以大腸桿菌、博德特氏菌以及酵母作為載體進(jìn)行活載體疫苗研究的報道。

5.2.4 標(biāo)記疫苗

標(biāo)記疫苗是指應(yīng)用DNA重組技術(shù)將分子標(biāo)記插入病毒基因組中而研制的一類新型的重組疫苗，該類疫苗毒株可與野毒株相區(qū)別。有報道稱PCV-2基因組cap基因的C端至少容許插入27個氨基酸，而且插入后的氨基酸剛好是暴露在病毒粒子表面而形成新穎抗原表位。減毒活嵌合PCVl-2a病毒能展示短抗原表位標(biāo)簽，從而誘導(dǎo)感染豬產(chǎn)生抗PCV-2抗體和抗表位標(biāo)簽抗體，從而給后續(xù)的特異性抗體檢測帶來便利。Beach等將GLU或KT3標(biāo)簽定向克隆至PCVl-2嵌合病毒Cap蛋白的C末端，成功構(gòu)建了2種帶分子標(biāo)記的PCVl-2嵌合病毒，并證實其能在PKl5細(xì)胞上增殖，試驗感染豬后能在血清中檢測到PCV-2中和抗體和抗GLU或KT3標(biāo)簽的特異性抗體，為臨床區(qū)分PCV2自然感染和疫苗免疫奠定了堅實的基礎(chǔ)。

豬圓環(huán)病毒病是近年來阻礙養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要傳染病，目前，豬圓環(huán)病毒病已成為當(dāng)今的研究熱點，也取得了不小的進(jìn)展，相信隨著對病毒的病原特性、疾病的發(fā)病機(jī)理、動物的免疫保護(hù)機(jī)制以及病毒感染的流行病學(xué)特點等的深入研究，將一定會建立更加快速靈敏的檢測方法，研制更加安全高效的新型疫苗，從而控制PCV-2的流行，減少養(yǎng)豬業(yè)的損失。