嘔吐毒素對未成熟小母豬胃腸道的經(jīng)口毒性研究

產(chǎn)毒素鐮刀菌是世界各地的小麥、黑小麥和其他谷物中最常見的病原菌。大多數(shù)鐮刀菌侵染植物的不同部分或不同生長時期，如幼苗、頂端、根部、莖部和果穗，會導致谷物產(chǎn)量嚴重下降，通常約下降10 %～40 %。當谷物植物被真菌侵染時，會面臨被這些真菌的二級代謝產(chǎn)物（如真菌毒素）污染的風險，這些代謝產(chǎn)物隨后侵入飼料和食物中。霉菌毒素污染動物飼料引發(fā)的主要問題不是急性疾病，而是持續(xù)不斷地攝入低水平的霉菌毒素將會造成動物一系列的代謝、生理和免疫失衡的問題。在波蘭的氣候條件下，從生長期的谷物和草木中發(fā)現(xiàn)的主要鐮刀菌毒素有嘔吐毒素（Deoxynivalenol，DON）、玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）、串珠鐮刀菌素（Moniliformin，MON）和伏馬毒素（fumonisin）。近年來，在溫暖氣候條件下，嘔吐毒素污染農(nóng)作物正越來越成為一個與赤霉?。℉ead Blight，F(xiàn)HB）有關的普遍問題，很可能是因為廣泛采用免耕農(nóng)業(yè)（no-tillage farming）、氣候類型逐步改變以及同時寄主植物（如玉米和小麥）的擴大栽培面積不無關系。大量研究表明，選擇一種低敏感性的作物品種也是保證谷物中嘔吐毒素含量較低的有效措施，即便在高感染環(huán)境下也是如此。這個策略能使農(nóng)民利用水土保護性耕作的優(yōu)點，同時生產(chǎn)高質(zhì)量的谷物。

從分子結(jié)構上講，嘔吐毒素是一種有機極性的化合物，國際理論和應用化學聯(lián)合會將其命名為12，13-環(huán)氧-3α，7α，15-單端孢霉-9-蒽-8-酮。第8位碳原子上的酮基是B族單端孢霉烯毒素的一個典型特征。此外，羥基和乙酰酯基團的數(shù)量和位置也能夠影響其在細胞內(nèi)的相對毒性。此外，通過該環(huán)氧基團，毒素能與真核生物核糖體的大亞基結(jié)合，并干擾肽基轉(zhuǎn)移酶，從而抑制肽鏈合成過程的起始和延伸。嘔吐毒素影響蛋白質(zhì)合成的相對能力也與其他因素有關：如進入細胞的速度、胞漿酶的代謝、活性結(jié)合位點親和性的改變或干擾蛋白質(zhì)合成能力。

嘔吐毒素的毒性強度依賴于污染的劑量、植物品種、持續(xù)攝入的時間、純度及浸入的途徑。有關單端孢霉烯毒素基因毒性的研究數(shù)據(jù)很少，這些毒素被國際腫瘤研究機構歸為第3類。在眾多動物物種中，豬對嘔吐毒素特別敏感，因此可以作為人對嘔吐毒素敏感性研究的模型。嘔吐毒素在豬體內(nèi)的吸收非常迅速，血漿內(nèi)的毒素濃度在攝入15 min～30 min內(nèi)即可達到峰值。豬經(jīng)口攝入的嘔吐毒素82 %可被全身吸收。在豬體內(nèi)的嘔吐毒素短時間內(nèi)就可被全身吸收，半衰期僅為3.9 h，而且在組織中的累積非常有限。根據(jù)對試驗動物和細胞系進行的大量研究顯示，低水平攝入嘔吐毒素可以調(diào)節(jié)細胞因子、趨化因子和炎性因子的基因表達，同時會產(chǎn)生免疫刺激。此外，低到中等劑量口服單端孢霉烯毒素，可引起豬嘔吐、腹瀉、胃腸炎、食欲不振、體重增重降低、葡萄糖及谷氨酰胺與5-甲基四葉酸吸收不良、食管穿孔、循環(huán)性休克等癥狀，最終死亡。嘔吐毒素通過改變腸道上皮細胞的形態(tài)和導致屏障功能的分化而影響腸上皮細胞的完整性。相應地，高水平地攝入嘔吐毒素可加快白細胞凋亡，并伴隨免疫抑制和胃腸道黏膜表皮細胞及淋巴細胞的嚴重損害，從而引起出血、內(nèi)毒素血癥和休克。嘔吐毒素能侵襲的其他靶標器官包括骨髓和胸腺，這都會引起免疫抑制。非常有趣的是，這些胃腸道效應也會出現(xiàn)在經(jīng)鼻吸入單端孢霉烯毒素的豬上。美國食品及藥物管理局（The United States Food and Drug Administration，USFDA）已經(jīng)制定了用于特定用途的谷物和谷物副產(chǎn)物中嘔吐毒素的建議標準（Advisory Levels）。對食用牛、年齡大于4月齡的肥育牛和肉雞而言，草料中的嘔吐毒素含量限定標準為10 mg/kg；而對豬和其他種類而言，此標準為5 mg/kg。

胃腸道是防止機體受飼料污染因子影響的第一道屏障，也是霉菌毒素攻擊機體的第一個靶器官。腸道是免疫調(diào)節(jié)機制同步保護機體抗擊病原體的最先響應的免疫部位，而且還是維持組織內(nèi)動態(tài)平衡以避免出現(xiàn)由環(huán)境變化引起的免疫介導型病理的免疫器官。然而，研究表明，霉菌毒素極易經(jīng)由旁細胞途徑（paracellular pathway）穿過腸道表皮的屏障。本文的研究目的是在無可見不良影響（No Observed Adverse Effect Level，NOAEL）的劑量下，采用高效液相色譜技術，對口服嘔吐毒素的小母豬消化器官（例如肝臟、大腸和小腸等）中該毒素的吸收、累積和最終存在的情況進行檢測。

1 結(jié)果與討論

在過去近二十年中，許多試驗利用以動物為模型研究了嘔吐毒素的毒性。結(jié)果表明，攝入的嘔吐毒素會影響動物的許多生理功能，包括采食、繁殖力或免疫力。本研究以兩組未成熟小母豬（體重為20 kg左右）為試驗對象，在42 d的試驗期按每千克體重12 μg毒素的劑量經(jīng)口服用嘔吐毒素（E組，18頭）或者安慰劑（C組，21頭），隨后利用層析法分析測定小腸、大腸和肝臟中的嘔吐毒素含量。目前為止，有關嘔吐毒素對豬生產(chǎn)性能影響和毒理數(shù)據(jù)大多是在攝入中、高水平的毒素下測得的，例如每千克飼料2 mg～10 mg嘔吐毒素。來自于歐洲12個國家的11 022份谷物樣本分析結(jié)果顯示，57 %的樣本含有嘔吐毒素，其中7 %的樣本含750 μg/kg以上的嘔吐毒素。嘔吐毒素最重要的一個物理化學特性是能夠抵御高溫的影響，所以飼料和食品中的嘔吐毒素會對動物和人的健康產(chǎn)生一定的威脅。事實上，眾所周知飼料和食物的加工方法可能不會影響產(chǎn)品中嘔吐毒素的含量。此外，飼料形狀上的差異似乎可調(diào)控嘔吐毒素的生物有效性，因為飼料的形態(tài)會影響毒素從基質(zhì)中的釋放，從而影響動物組織中毒素的殘留濃度。在本研究的整個試驗期內(nèi)，由于嘔吐毒素相對于體重的攝入量以及受小部分飼料基質(zhì)的精確控制，動物每日攝入的嘔吐毒素稍有不同。

1.1 嘔吐毒素在小腸組織的殘留

本文探討了攝入低水平的嘔吐毒素對未成熟小母豬十二指腸、空腸和回腸的影響。如表1所示，本試驗研究顯示，日糧可顯著影響毒素在動物組織中的含量。動物個體在每天每千克體重120 μg的劑量下攝入嘔吐毒素時，小腸組織中嘔吐毒素的含量從0.00（第Ⅰ期和第Ⅱ期）到18.60 ng/g（第Ⅳ期）。第Ⅰ期和第Ⅱ期的樣本組織中沒有檢測到嘔吐毒素。檢測到的嘔吐毒素含量最高的樣本是第Ⅳ期-第Ⅵ期的屠宰樣本，十二指腸、空腸和回腸中的濃度分別為7.20 μg/kg、9.20 μg/kg和18.60 μg/kg。只有回腸樣本中的DON含量與組織中DON的濃度呈線性關系，但組內(nèi)個體間差異較大。

D?nicke等研究顯示，體重88 kg的豬喂給嘔吐毒素含量為4.2 mg/kg的飼料1.1 kg時，僅約1 %的嘔吐毒素到達小腸近端（十二指腸和結(jié)腸），且每千克凍干消化糜的嘔吐毒素最大含量為1.3 mg。然而，在體內(nèi)試驗中，豬在攝入嘔吐毒素后，較低和多變的毒素積累還是能夠?qū)е履c道上皮細胞形態(tài)的改變。在Goyarts等的研究中，口服嘔吐毒素15 min后，豬血清樣本可以檢測到嘔吐毒素。這種通過血清對嘔吐毒素侵害進行的早期檢測結(jié)果，表明毒素能快速進入體內(nèi)，且毒素的入侵始于胃或十二指腸的上端部位?，F(xiàn)有的論據(jù)可以解釋觀察到的各組織逐漸飽和的狀態(tài)，這種現(xiàn)象最終會導致隨著時間的推移消化道連續(xù)部位中嘔吐毒素含量升高；反之，我們必須記住這些會忽視嘔吐毒素影響的水平，但逐漸飽和的組織不會隨著時間的推移提高消化道較早部位中嘔吐毒素的水平，這可能歸因于獲得的食物耐受性，阻止消化道特別是回腸和降結(jié)腸中的炎性發(fā)展。這可能是霉菌毒素在誘導局部免疫系統(tǒng)前的某種“逃避”機制，類似于由常見病原體在慢性感染期引起的T調(diào)節(jié)細胞（T regulatory cells，Tregs）誘導情況。

根據(jù)已有結(jié)果，殘留系數(shù)是動物組織中嘔吐毒素的含量（μg/kg）除以日糧中霉菌毒素的濃度（μg/kg）的商，根據(jù)以前的研究，包含在特定試驗期內(nèi)口服的總劑量。

第Ⅰ和第Ⅱ個試驗周期的平均殘留系數(shù)總和為0，而在該階段殘留系數(shù)最大值出現(xiàn)在第Ⅲ試驗期（十二指腸內(nèi)為0.027）、第Ⅳ試驗期（空腸0.027）和第Ⅵ試驗期（0.037）的樣本中（表1）。對于十二指腸和空腸的樣本來說，平均殘留系數(shù)隨著在第Ⅳ試驗期的十二指腸和第Ⅴ試驗期的空腸中接觸嘔吐毒素的部位增加而降低，但十二指腸總的殘留系數(shù)要高于空腸和回腸的。在Goyarts等的研究中，嘔吐毒素和脫環(huán)氧基嘔吐毒素的平均殘留系數(shù)，通過樣本中兩種毒素物質(zhì)的總含量除以日糧中嘔吐毒素的含量進行計算。在所有豬上，平均殘留系數(shù)的升降順序為膽（0.1046）、腎臟（0.0151）、肝臟（0.0057）、血清（0.0023）、肌肉組織為（0.0016）和背膘為0.0002）。

嘔吐毒素在小腸組織內(nèi)的分布比例如圖1所示。從第3天開始霉菌毒素在不同組織中的分布開始變化。在第Ⅲ試驗期，十二指腸內(nèi)的嘔吐毒素濃度最高。而在第Ⅳ試驗期，空腸和回腸嘔吐毒素也達到了相同水平。在第Ⅴ和第Ⅵ試驗期，回腸樣本中嘔吐毒素濃度最高，同時在十二指腸和空腸里也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。

1.2 嘔吐毒素在大腸和肝臟組織的殘留

利用嘔吐毒素進行單個毒素的攻毒時，該毒素在試驗的前三天沒有從收集到的橫結(jié)腸和降結(jié)腸消化糜樣本中檢測到（表2）。直到第Ⅳ試驗期，在肝臟組織中檢測到了嘔吐毒素的最高濃度（7.90 ng/g），隨后在升結(jié)腸和降結(jié)腸中也得到了類似的檢測結(jié)果（第Ⅴ和第Ⅵ試驗期）。胃腸道不同部分的嘔吐毒素濃度范圍分別如下（單位：ng/g）：肝臟從6.70（第Ⅳ試驗期）到8.80（第Ⅴ試驗期），盲腸從0.0（第Ⅰ試驗期）到20.5（第Ⅴ試驗期），橫結(jié)腸從0.0（第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ和Ⅵ試驗期）到1.8（第四試驗期），降結(jié)腸從0.0（第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ試驗期）到20.0（第Ⅵ試驗期）。在整個試驗周期內(nèi)各組織中的嘔吐毒素平均濃度，最高平均濃度為盲腸樣本中的8.70 ng/g。

在另一個類似的研究中，嘔吐毒素的濃度下降順序為：膽>腎>血清>肝=肌肉，研究中豬采食了分別含0 %、25 %和50 %的含2.5 mg/kg嘔吐毒素的小麥。

大腸各段中的嘔吐毒素平均殘留系數(shù)明顯不同。盲腸樣本中的數(shù)據(jù)最為穩(wěn)定，較高的殘留系數(shù)出現(xiàn)在第Ⅵ期的盲腸（0.046）、第Ⅴ期的升結(jié)腸（0.0049）、第Ⅳ期的橫結(jié)腸和第Ⅵ期的降結(jié)腸（0.040）（表2）。

盲腸中的總殘留系數(shù)要高于升結(jié)腸、降結(jié)腸和和結(jié)腸內(nèi)的；肝臟中的平均殘留系數(shù)從0.013到0.081不等。整個試驗周期內(nèi)，只有在這些組織樣本中觀察到了降低的系數(shù)值（表3）。

大腸和肝臟樣本中嘔吐毒素分布如圖2所示。從試驗第Ⅱ期到第Ⅲ期，肝臟組織中嘔吐毒素含量從最大到逐步下降，而從第Ⅳ試驗期起，所有組織分析樣本中的嘔吐毒素含量表現(xiàn)出相同的水平。

觀察到的變化分布趨勢與作者的調(diào)查一致，表明嘔吐毒素在體內(nèi)的活動是多方面的。如嘔吐毒素是控制NOS-1組成異構體與NOS-2誘導型異構體的基因mRNA表達過程的一個抑制因子。一氧化氮是非腎上腺素和非膽堿能系統(tǒng)中神經(jīng)傳導的抑制子，一氧化氮含量的減少，導致小母豬消化道功能發(fā)生這種特殊的變化。結(jié)果，低水平的一氧化氮能加快食道、胃和腸道的蠕動，抑制胃的適應過程（馳松、吸收、適應和連續(xù)收縮），增強腸道括約肌的張力，因此導致胃排空和小腸內(nèi)食糜轉(zhuǎn)移受阻，即增生過程過被激活。這里提到的所有情形都是可促進依賴生物體能量來源的高生物轉(zhuǎn)化的因素，以及可較好地解釋嘔吐毒素在結(jié)腸中的細胞毒性特性，小劑量攝入時的細胞毒性較低。

目前為止，研究人員調(diào)查了豬暴露在低劑量嘔吐毒素下后的血液、生化、免疫和組織病理參數(shù)。嘔吐毒素的毒理學機理在一些器官，如肺、肝或腎中可能相類似，同時該毒素也可能會引起或促進與代謝應激相關的豬小腸細胞的死亡。攝入嘔吐毒素后出現(xiàn)的小腸正常功能紊亂似乎與以下事實相關，即腸道上皮細胞可能在攝入毒素后長時間地暴露在腔內(nèi)高水平的嘔吐毒素之下。一項有關嘔吐毒素對豬小腸細胞系的細胞毒性（IPEC-J2）試驗表明，能夠誘發(fā)細胞毒性的最低有效劑量在乙醇溶液中的水平為0.5 μM～2.5 μM，而當濃度達到10 μM時嘔吐毒素會引起細胞損害，包括細胞變圓、自溶和單細胞層的細胞損失。這些觀察結(jié)果得到了我們實驗室近期未發(fā)表的一些試驗的證實，這是低水平的嘔吐毒素只會引起局部細菌群落輕微毒性的結(jié)果?？梢约僭O，在大腸的最后一段（升結(jié)腸），嘔吐毒素的細胞活性增強，但是這只發(fā)生在低水平和糞便中酶活性增強的情況下。換句話說，在豬消化道的最后一段可能會出現(xiàn)病理變化加重的情況。此外，在攝入48 h時，ATP的水平以與嘔吐毒素呈劑量依賴型的方式顯著下降。豬嘔吐毒素急性毒性包括在在靜脈注射2 h后開始出現(xiàn)消化系統(tǒng)癥狀和嘔吐，以及排便增多和腹瀉。豬的體外培養(yǎng)模型試驗發(fā)現(xiàn)，攝入高水平嘔吐毒素4 h后可以確診空腸出現(xiàn)嚴重的病變，包括腸道絨毛萎縮和融合、腸細胞裂解和浮腫。相似地，日糧嘔吐毒素水平為4 mg/kg時，會引起胃底部褶皺化；在攝入含2.8 mg/kg嘔吐毒素的日糧5周后，豬的體重無變化，但組織病理學變化明顯。此外，在攝入嘔吐毒素的豬中，其空腸和回腸可出現(xiàn)多灶性萎縮和絨毛融合、絨毛尖端壞死、腸細胞空泡和腸道固有層水腫等現(xiàn)象。Pinton等在另一項研究中發(fā)現(xiàn)，嘔吐毒素可使致病性大腸桿菌在通過豬IPEC-1上皮細胞單分子層時出現(xiàn)劑量依賴性的轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。相似地，當豬攝入低水平的嘔吐毒素時，傷寒沙門氏菌在通過豬IPEC-J2細胞系時也觀察到了較高的易位現(xiàn)象。

我們的研究結(jié)果與上述討論的結(jié)果，對有關嘔吐毒素毒性和其在豬消化系統(tǒng)各個組織內(nèi)分布的知識作了重大貢獻。本文是第一次報道經(jīng)口服用嘔吐毒素后對小母豬胃腸道中毒素含量的定量分析，同時可能是對有關經(jīng)口服用嘔吐毒素后果方面的知識的一個重要補充。

綜合目前的研究結(jié)果以及其他研究者的結(jié)果可得出某些結(jié)論，低水平攝入的嘔吐毒素在消化道最后部位中的累積，可引發(fā)特定的情況，但不一定會產(chǎn)生病理變化，其中之一的原因可能與嘔吐毒素的細胞毒性有關。結(jié)果，病原微生物的數(shù)量下降，這可能成為大腸中的其中一個促炎因子；另一方面，動物器官暴露在低劑量的霉菌毒素之下，是一個可以抑制NOS控制基因mRNA表達的因子。在這種情況下，我們可以推斷出一個結(jié)論，即低劑量（低于無可見有害作用水平）的嘔吐毒素可能具有一定的治療作用。

2 試驗部分

2.1 試驗動物

本試驗以39頭臨床健康的小母豬為研究對象，試驗在波蘭奧爾什丁瓦爾米亞瑪祖里大學獸醫(yī)學院獸醫(yī)預防與飼料衛(wèi)生系內(nèi)進行。小母豬初始體重約20 kg，實行單欄個體飼養(yǎng)，自由飲水與采食。試驗日糧按仔豬的能量和氨基酸需求在當?shù)嘏渲疲覂H受到嘔吐毒素的污染，污染量用色譜分析法測定。

2.2 試驗設計

總共39頭試驗小母豬被分入對照組（21頭）和試驗組（18頭）兩個處理組。試驗組小母豬按每天每千克體重口服12 μg嘔吐毒素，連續(xù)服用42 d。嘔吐毒素分析樣本在每天早飼喂前以膠囊形式服用；對照組豬在與試驗組豬相同的時間內(nèi)口服安慰劑（不含嘔吐毒素的膠囊）。嘔吐毒素的飼喂量依體重決定，每周進行調(diào)整。在試驗的第1、7、14、21、28、35和42天，試驗組和對照組各選取3頭豬進行撲殺（即每次共撲殺6頭），但第1天僅撲殺3頭對照組小母豬。每周收集撲殺小母豬的胃腸道組織（肝左葉、十二指腸第一段與十二指腸中段、空腸中段、升結(jié)腸中段、降結(jié)腸中段）樣本。

2.3 化學藥品

嘔吐毒素標準品和有機溶劑（HPLC級）購自德國Sigma公司。所有用于提取和純化嘔吐毒素的化學試劑均購自波蘭POCh公司。HPLC流動相用水經(jīng)Milli-Q純水系統(tǒng)（USA）純化。

2.4 組織樣本

以下組織樣本的處理：十二指腸、空腸、回腸、盲腸、升結(jié)腸、橫結(jié)腸、降結(jié)腸和肝臟經(jīng)磷酸鹽緩沖液清洗后收集。純組織在研磨和提取前于-80 ℃下凍存、備用。

2.5 提取和純化

組織樣本（2 g）用甲醇勻漿2次，隨后4 000 rpm離心，甲醇自然蒸發(fā)。根據(jù)操作說明，剩余物經(jīng)20 mL水和20 mL 0.2 M 乙酸鈉稀釋后加入免疫親和柱的頂部，以乙腈-水混合液洗脫（乙腈∶水=82∶12）。洗脫液在40 ℃時于氮氣流下完全蒸發(fā)，干燥殘留物于-20 ℃下儲存，待HPLC分析。

2.6 嘔吐毒素HPLC分析

嘔吐毒素（λmax=224 nm）色譜分析系統(tǒng)由配備Waters 2996型光電二極管陣列檢測器的Waters 2659型高效液相色譜系統(tǒng)和Nova Pak C-18柱（300 mm× 3.9 mm）系統(tǒng)組成。根據(jù)相關校準曲線，通過測定保留時間點上的峰面積，對嘔吐毒素進行定量。嘔吐毒素的檢測極限為0.001 μg/g。

2.7 統(tǒng)計分析

各組織樣本中的嘔吐毒素含量采用SPSS統(tǒng)計分析方法中的Tukey-test法進行差異顯著性分析。結(jié)果以平均數(shù)和標準差表示。

3 結(jié)論

口服嘔吐毒素7 d后（第Ⅰ試驗期），只有在肝臟中能夠檢測到該毒素。小腸組織中嘔吐毒素含量遞減順序為回腸>十二指腸>空腸，大腸和肝臟組織中嘔吐毒素的濃度遞減順序為盲腸>升結(jié)腸>肝臟>降結(jié)腸>橫結(jié)腸。最大的殘留系數(shù)可達到如下水平：回腸（小腸組織）為0.037（第Ⅵ試驗期）、升結(jié)腸（大腸組織）為0.049（第Ⅴ試驗期）、盲腸（大腸組織）為0.046（第Ⅵ試驗期）和肝臟為0.081（第Ⅰ試驗期）?？傊@些結(jié)果表明，嘔吐毒素的口服劑量和時間會影響其在小母豬胃腸道內(nèi)的分布。