喹乙醇代謝殘留標(biāo)識(shí)物3—甲基喹惡啉—2—羧酸檢測(cè)方法的優(yōu)化

摘 要：建立雞肉中喹乙醇代謝標(biāo)識(shí)物3-甲基喹惡啉-2-羧酸（MQCA）的高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）殘留分析方法。樣本在一定溫度下酶解、鹽酸酸化后，用酸乙酯提取，吹干濃縮后再用0.1 %甲酸水溶液+乙腈（V∶V=1∶9）溶解，加入正已烷除雜；以0.1 %甲酸水溶液-乙腈為流動(dòng)相，經(jīng)C18柱分離，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）正離子模式進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MQCA提取效果好，檢出限為0.05 μg/kg，在0.5 μg/kg～5.0 μg/kg添加水平的平均回收率在73.72 %～95.22 %之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.27 %～2.79 %。本方法適用于雞肉組織中喹乙醇代謝物殘留檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：喹乙醇；3-甲基喹惡啉-2-羧酸；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

中圖分類號(hào)：S859.79+6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1001-0769（2015）08-0074-03

喹乙醇又稱喹酰胺醇，商品名為倍育諾、快育靈，在畜禽生產(chǎn)中，能有效地預(yù)防疾病，提高飼料利用率，促進(jìn)代謝，提高氮的沉積，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)、組織細(xì)胞的形成，加速生長(zhǎng)，增加經(jīng)濟(jì)效益。由于喹乙醇有中度至明顯的蓄積毒性，對(duì)大多數(shù)動(dòng)物有明顯的致畸作用，對(duì)人也有潛在的三致性，即致畸形，致突變，致癌。因此，喹乙醇在美國(guó)和歐盟都被禁止用作飼料添加劑?！吨袊?guó)獸藥典》（2005版）也有明確規(guī)定，喹乙醇被禁止用于家禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖。但喹乙醇是高效、低成本的抗生素生長(zhǎng)促進(jìn)劑，在一些養(yǎng)殖行業(yè)仍在使用，甚至出現(xiàn)濫用，因此建立靈敏、可靠的檢測(cè)方法對(duì)其實(shí)施監(jiān)管十分必要。

3-甲基喹惡啉-2-羧酸是喹乙醇在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生的代謝物，在體內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定，為喹乙醇代謝殘留標(biāo)識(shí)物。MQCA的檢測(cè)方法已有很多文獻(xiàn)報(bào)道，其中最常見的是液相色譜法[3，4]和液相色譜-質(zhì)譜法[1，2，5]，本方法在前人研究工作的基礎(chǔ)上，對(duì)樣本前處理進(jìn)行了改進(jìn)，建立了雞肉中喹乙醇代謝物的UPLC-MS/MS檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

AcQuity UPLC/XeVo TQMS液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Waters公司），電子天平（Mettler Toledo公司，型號(hào)：PL2002），高速冷凍離心機(jī)（SIGMA公司，型號(hào)3K15），純水機(jī)（德國(guó)Millipore公司），恒溫水浴搖床（德國(guó)Memmet公司，型號(hào)WEN45），MAX（60 mg，3 mL）固相萃取柱（美國(guó)Waters公司）。

3-甲基喹惡啉-2-羧酸（MQCA）（德國(guó)Dr. Ehrenstorfer GmbH公司），3-甲基喹惡啉-2-羧酸-d4（MQCA-d4，加拿大TRC公司），Protease蛋白酶（P5147，美國(guó)Sigma公司），Tris堿（T1503，美國(guó)Sigma公司）甲醇、乙腈、乙酸乙酯（色譜純，Merck公司）；甲酸（色譜純，Aladdin公司）濃鹽酸（優(yōu)級(jí)純，東江試劑公司）。

標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取10 mg MQCA標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇定溶于10 mL棕色容量瓶中，配制成1.0 mg/mL MQCA標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，精確稱取1 mg MQCA-d4標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇定溶于10 mL棕色容量瓶中，配制成0.10 mg/mL MQCA-d4L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-20 ℃以下避光保存。

1.2 樣本前處理

取雞胸及雞腿肌肉充分絞碎，勻質(zhì)，-20 ℃以下避光保存。

稱取5 g（精確到0.01 g），樣本于50 mL離心管中，加入濃度為100 μg/mL 的MQCA-d4內(nèi)標(biāo)工作液0.1 mL，加入8 mL 0.2 mol/L pH 9.6 Tris/HCL緩沖溶液和0.3 mL 10 mg/mL蛋白酶水溶液[6]，渦旋混勻，置于恒溫水浴搖床47 ℃酶解16 h～18 h，取出樣本放至室溫，加入10 mL 0.3 mol/L鹽酸溶液，振蕩5 min，4 ℃、9 000 r/min離心5 min，將上層清液轉(zhuǎn)移至另一干凈的50 mL離心管。

加入10 mL乙酸乙酯，渦旋2 min，4 ℃、 9 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一干凈的50 mL離心管。重復(fù)乙酸乙酯提取步驟，合并上清液，35 ℃下氮吹濃縮至干，殘?jiān)?.1 %甲酸水溶液+乙腈（V∶V=1∶9）溶解，加入2 mL的正已烷，渦旋1 min，4 ℃、9 000 r/min離心5 min，取下層清液，過0.22 μm濾膜，進(jìn)樣，UPLC-MS/MS測(cè)定。

1.3 色譜質(zhì)譜條件

ACQUITYUPLC BEH C18（1.7 μm，3.0 mm× 100 mm），柱溫40 ℃；流動(dòng)相為乙腈和0.1 %甲酸水溶液，流速為0.3 mL/mim，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式，分別對(duì)MQCA和MQCA-d4標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行一級(jí)離子掃描，確定化合物的電離方式和分子離子，在獲得分子離子峰（母離子）質(zhì)荷比后，再進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜（子離子）掃描，優(yōu)化碰撞能量，確定兩個(gè)豐度比較高的子離子作為定性和定量離子。在ESI（+）檢測(cè)模式下，化合物質(zhì)譜采集參數(shù)（表1）。

空白基質(zhì)及添加藥物樣本色譜圖見圖1和2。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量限

配制MQCA的質(zhì)量濃度為2.0 μg/L～ 100.0 μg/L的基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)工作液，內(nèi)標(biāo)濃度均為10.0 μg/L，以目標(biāo)物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值Y為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度X（μg/L）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3）。

以加標(biāo)樣本中待測(cè)化合物色譜峰的信噪比等于3對(duì)應(yīng)的濃度為方法檢出限，確定雞肉中的MQCA的檢出限為0.05 μg/kg。

2.2 方法回收率實(shí)驗(yàn)

分別取雞肉空白樣本，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，加標(biāo)濃度分別為 0.5 μg/kg、2.0 μg/kg、5.0 μg/kg。將加標(biāo)樣本和空白樣本按前述方法進(jìn)行處理，上機(jī)測(cè)試，結(jié)果見表2、表3和表4。

3 討論與結(jié)論

3.1 樣本前處理方法的選擇

由于MQCA呈弱酸性，水解液經(jīng)酸化后，才能夠被乙酸乙酯提取，趙珊等[1]選擇直接加入0.8 mL濃鹽酸對(duì)MQCA進(jìn)行酸化，但我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)：因?yàn)闈恹}酸有較強(qiáng)腐蝕性，直接加入濃鹽酸后，提取液變得很粘稠，離心后，在上清液與殘?jiān)g有一層果凍狀凝膠，影響提取效果。對(duì)此，我們參考BG/T 20746-2006的方法，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)加入濃度為1.0 mol/L鹽酸溶液8 mL效果最好，回收率高。

文獻(xiàn)報(bào)道的喹乙醇代謝物的除雜凈化都是用不同類型的SPE小柱來實(shí)現(xiàn)的，包括活化-上樣-淋洗-洗脫等步驟繁瑣，耗時(shí)[1，5]。我們通過實(shí)驗(yàn)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)不過SPE柱，直接用0.1 %甲酸水溶液+乙腈（V∶V=1∶9）溶解濃縮后的殘?jiān)?，加? mL的正已烷除脂除雜，目標(biāo)物分離效果好，基質(zhì)干擾很少，空白基質(zhì)圖譜（圖1）及0.5 μg/kg陽性加標(biāo)色譜圖（圖2），完全能達(dá)到檢測(cè)要求。因此我們采用直接溶解加正已烷除脂的方法，大大節(jié)省了人力、物力。

3.2 結(jié)論

本方法建立了雞肉中喹乙醇的代謝殘留標(biāo)示物3-甲基喹噁啉-2-羧酸（MQCA）的超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的測(cè)定方法。樣本經(jīng)過酶解、提取、凈化，有效地消除了基質(zhì)干擾，方法具有較高的靈敏度，以MQCA-d4做為內(nèi)標(biāo)，提高了定量準(zhǔn)確性。經(jīng)過優(yōu)化試驗(yàn)驗(yàn)證，一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣本溶液（2 μg/L、 5 μg/L、20 μg/L、50 μg/L、100 μg/L）的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)r=0.999；方法檢出限確定為0.05 μg/kg，亦能達(dá)到GB/T 20746-2006檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法中的檢出限；在0.5 μg/kg～5.0 μg/kg添加水平的平均回收率在73.72 %～95.22 %之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.27 %～2.79 %；通過回收率和多種食品樣本的實(shí)測(cè)實(shí)驗(yàn)證明：上述方法樣本前處理方法簡(jiǎn)便、快捷、易操作，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的條件設(shè)置合理，相關(guān)參數(shù)優(yōu)化較佳，靈敏度較高，可準(zhǔn)確進(jìn)行定性、定量檢測(cè)，適用于可食動(dòng)物肌肉、肝臟中喹乙醇的代謝殘留標(biāo)示物3-甲基喹噁啉-2-羧酸殘留的檢測(cè)。

參考文獻(xiàn)：（6篇，略）