家豬肌內(nèi)注射和接觸傳染感染非洲豬瘟病毒后的帶毒及排毒動(dòng)力學(xué)研究

摘 要：非洲豬瘟病毒（African Swine Fever Virus，ASFV）是豬的一種強(qiáng)毒型病原體，從2007年起在東歐流行，目前還沒有有效的疫苗或治療方法。ASF病毒是當(dāng)前的流行毒株，在豬體內(nèi)帶毒和排毒（shedding and excretion）的動(dòng)力學(xué)機(jī)理至今尚不清楚。因此，本試驗(yàn)希望通過(guò)將易感的家豬與經(jīng)肌內(nèi)注射感染ASF病毒格魯吉亞2007/1毒株的家豬進(jìn)行接觸，以測(cè)定ASF病毒在豬欄內(nèi)和豬欄之間由受感染豬向易感豬進(jìn)行傳播的動(dòng)力學(xué)機(jī)理。試驗(yàn)采集了血液、口液、鼻液、腸液（直腸）樣本，以通過(guò)病毒滴定法和實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）法檢測(cè)ASF病毒，利用血清學(xué)試驗(yàn)測(cè)定ASF病毒特異性抗體。肌內(nèi)注射和接觸傳播感染均能造成豬急性發(fā)病，不過(guò)試驗(yàn)表明因感染途徑不同而導(dǎo)致豬的發(fā)病機(jī)制有所差異。接種感染豬在接種的第3天可在血液中分離到有傳染性的ASF病毒，而通過(guò)直接接觸和間接接觸進(jìn)行感染的豬分別在曝露后第10天和第13天方可從血液中分離到有傳染性的ASF病毒。臨近出現(xiàn)ASF臨床癥狀時(shí)，ASF病毒在血液中的滴度高于在鼻液和腸液中的?？谝簶颖局袥]有分離到有傳染性的ASF病毒，不過(guò)ASF病毒的基因組被檢測(cè)到。只有一頭接種感染的豬在接種后第12天檢測(cè)到ASF病毒特異性抗體。本項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果提供了ASF病毒格魯吉亞2007/1毒株在家豬中帶毒和排毒的定量數(shù)據(jù)，同時(shí)表明該毒株引起持續(xù)感染的能力有限。

關(guān)鍵詞：家豬；野豬；非洲豬瘟；病毒

非洲豬瘟病毒（African Swine Fever Virus，ASFV）于2007年傳播入格魯吉亞，之后繼續(xù)向東歐國(guó)家蔓延。ASF病毒屬于有囊膜的DNA大病毒，是非洲豬瘟病毒屬非洲豬瘟病毒科中的唯一成員，能夠自然地感染家豬和野豬。非洲豬瘟（African Swine Fever，ASF）的特征性癥狀是受感染豬出現(xiàn)發(fā)熱、出血和高病死率，給發(fā)病區(qū)域的養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于尚未建立有效的治療措施和疫苗，所以該病只能通過(guò)采用嚴(yán)格的檢疫限制和撲殺措施來(lái)控制。ASF病毒主要的傳播方式是感染豬與易感家豬之間的直接接觸和通過(guò)與受ASF病毒污染的豬肉、人群、車輛和污染物的間接接觸進(jìn)行傳播。在東非國(guó)家，ASF病毒還可通過(guò)蜱進(jìn)行傳播，但蜱在該病的流行病學(xué)中所起的作用還尚未有報(bào)道。歐洲大陸將存在ASF病毒在整個(gè)大陸中發(fā)生進(jìn)一步傳播的風(fēng)險(xiǎn)，因此更好地了解ASF病毒在豬場(chǎng)中帶毒和排毒（shedding and excretion）的模式是非常重要的，以便能夠正確地確定疾病的傳播參數(shù)，并隨后將這些參數(shù)用于建立疾病傳播的動(dòng)力學(xué)模型。這將使人們能夠評(píng)估ASF各類控制策略的潛在作用。

病毒的孵育期（從感染到出現(xiàn)癥狀之間的間隔時(shí)間）、潛伏期（從感染到出現(xiàn)傳染性的間隔時(shí)間）、傳染期（從出現(xiàn)傳染性到死亡或機(jī)體康復(fù)之間的間隔時(shí)間）是用于闡述傳染病帶毒和排毒動(dòng)力學(xué)的流行病學(xué)參數(shù)。強(qiáng)毒力的ASF病毒格魯吉亞2007/1毒株的流行病學(xué)參數(shù)還沒有通過(guò)試驗(yàn)進(jìn)行定量。至今為止，尚無(wú)證據(jù)表明該毒株的毒力有變化和病毒的傳染能繼續(xù)產(chǎn)生急性型疾病，且尚未有家豬在感染后可康復(fù)或長(zhǎng)期帶毒的報(bào)道。孵育期、潛伏期和傳染期取決于兩個(gè)因素，即病毒從感染中細(xì)胞排出的數(shù)量和向體外排毒的途徑；這兩個(gè)因素反過(guò)來(lái)又取決于病毒的感染量和所感染的毒株。最近利用美國(guó)ASF病毒毒株進(jìn)行的感染研究集中于用野豬做實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。野豬在攻毒后，經(jīng)過(guò)3 d～4 d的孵育期開始產(chǎn)生臨床癥狀，經(jīng)過(guò)2 d～6 d的潛伏期病毒排出，在攻毒后（days post-inoculation）7 d～9 d （7 dpi～9 dpi）全部死亡。在從東歐ASF病毒感染區(qū)的家豬和野豬上采集的血清和器官樣本中很難檢測(cè)到特異性抗體，這驗(yàn)證了急性病例感染豬在出現(xiàn)可檢測(cè)到的抗體之前已發(fā)病死亡的觀點(diǎn)。其他實(shí)驗(yàn)性感染主要是研究家豬對(duì)在非洲流行的ASF病毒毒株的易感性：家豬在感染后，通常經(jīng)過(guò)1 d～7 d的潛伏期，病毒開始排入血液。部分感染ASF病毒低毒毒株的家豬，能在感染70 d后保持持續(xù)的傳染性。在此傳染期中，這些感染豬通過(guò)口途徑而不是鼻和直腸途徑排出高水平的ASF病毒。

據(jù)我們所知，目前尚沒有有關(guān)在東歐國(guó)家家豬中流行的ASF病毒毒株帶毒和排毒動(dòng)力學(xué)資料，因此我們?cè)谝粋€(gè)可控的環(huán)境中，利用ASF病毒格魯吉亞2007/1毒株經(jīng)肌內(nèi)接種感染和接觸感染，研究家豬的臨床癥狀、病毒血癥和病毒排毒模式，并討論ASF檢測(cè)和傳播參數(shù)的重要意義。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物和場(chǎng)所

本試驗(yàn)以40頭來(lái)自英國(guó)同一家豬場(chǎng)的7周齡SPF大白豬（家豬）為研究對(duì)象，每頭豬都進(jìn)行個(gè)體鑒定，并隨機(jī)分配入位于英國(guó)薩里郡的Pirbright研究所中防護(hù)等級(jí)為4級(jí)的4個(gè)獨(dú)立隔離豬欄中（寬×長(zhǎng)：385 cm～423 cm×550 cm）。試驗(yàn)豬每天由飼養(yǎng)員飼喂兩次，自由飲水。我們計(jì)算可產(chǎn)生高傳染效率（0.95）的最少配對(duì)傳染/接觸感染豬數(shù)，以檢測(cè)試驗(yàn)組和對(duì)照組在病毒傳播上的顯著性差異（0.05）?；诖擞?jì)算結(jié)果，每個(gè)試驗(yàn)組的傳染概率P=R0/（R0+2），其中RO作為最基本的增值數(shù)（在一個(gè)易感豬群中，一頭有傳染性的豬在其傳染期中引發(fā)新的受感染病例的平均數(shù)）?；赗0-對(duì)照組=6.9和 R0-試驗(yàn)組=0.5，至少需要4對(duì)有傳染性的/接觸的豬。計(jì)算通過(guò)R統(tǒng)計(jì)軟件包中的“epi.studysize”方法執(zhí)行。因此，豬欄A放入10頭豬，豬欄B和豬欄C各飼養(yǎng)12頭豬，在豬欄B和豬欄C中，用高80 cm的隔離物將其分隔成2個(gè)區(qū)域：一個(gè)區(qū)域飼養(yǎng)8頭豬，另一區(qū)域飼養(yǎng)4頭豬；通過(guò)這種方式豬欄間的傳播可以進(jìn)行定量分析。鑒于可用的試驗(yàn)豬數(shù)量有限和隔離間空間的局限，豬欄D的樣本量進(jìn)行了輕微的調(diào)整，因此豬欄D僅飼養(yǎng)6頭豬。

1.2 病毒毒株

ASF病毒格魯吉亞2007/1強(qiáng)毒株首次分離到是于2007年從格魯吉亞西部伊梅列季州的一頭感染豬上。該毒株與在外高加索地區(qū)和俄羅斯豬群中流行的ASF病毒毒株在遺傳學(xué)上有很近的親緣關(guān)系。試驗(yàn)用病毒來(lái)自受感染豬的脾臟組織，試驗(yàn)豬接種1 mL含量為102 HAD50的病毒液。選擇102 HAD50的病毒接種量是因?yàn)榇藙┝吭缦纫延醒芯框?yàn)證其經(jīng)肌內(nèi)注射后可以有效地引發(fā)感染。

1.3 實(shí)驗(yàn)性感染和傳播

試驗(yàn)用家豬經(jīng)過(guò)5 d的適應(yīng)期后通過(guò)肌內(nèi)注射以上劑量的病毒進(jìn)行感染。雖然肌內(nèi)注射感染不能代表自然感染的方式，但卻是最可靠的攻毒途徑，因?yàn)榭梢援a(chǎn)生較高的感染率，且能控制感染劑量和攻毒時(shí)間。接種物通過(guò)返滴定以確定感染量，表1列出了每個(gè)豬欄的肌肉接種感染和接觸感染豬數(shù)，豬欄A的10頭中5頭進(jìn)行了接種感染，豬欄B和豬欄C的12頭豬中4頭進(jìn)行了接種感染，豬欄D的6頭豬有3頭進(jìn)行了接種感染。未接種感染的豬如在同一豬欄中，則作為同一豬欄內(nèi)的接觸感染豬；如果在相鄰的豬欄中，則作為豬欄與豬欄間的接觸感染豬。

1.4 臨床檢查和尸體剖檢

試驗(yàn)豬每天檢查臨床癥狀，為了評(píng)估疾病的嚴(yán)重程度，指定10個(gè)臨床癥狀并利用臨床癥狀評(píng)分（Clinical Score，CS）系統(tǒng)進(jìn)行定量。動(dòng)物試驗(yàn)在Pirbright研究所完成，直腸溫度連續(xù)3 d超過(guò)40.5 ℃或者出現(xiàn)3個(gè)ASF臨床癥狀的試驗(yàn)豬執(zhí)行安樂死。每頭試驗(yàn)豬都進(jìn)行剖檢并采集組織（扁桃體、脾臟、肝臟、肺臟、心臟、淋巴結(jié)）樣本，依據(jù)ASF病毒感染的標(biāo)準(zhǔn)化病理學(xué)構(gòu)架檢測(cè)組織中的眼觀病變類型。

1.5 采樣步驟

在樣本采集的過(guò)程中，為了避免發(fā)生污染，每頭試驗(yàn)豬都需遠(yuǎn)離豬欄進(jìn)行采樣。小豬采用背部躺臥式進(jìn)行保定，而大豬則采用站立式鼻套法保定。在進(jìn)行連續(xù)取樣時(shí)，每一次都要采集血液樣本，衣物、鞋類、手套和地板都需清洗并消毒。血液和血清樣本從接種感染后第3天開始到試驗(yàn)結(jié)束每2 d采集一次。口腔、鼻腔和直腸分泌物樣本從接種感染后第2天開始每天用棉拭進(jìn)行采樣，采集后的棉拭浸泡在1 mL的PBS中。陰性對(duì)照樣本在接種當(dāng)天采集?？谇幻奘迷诿骖a和臼齒部采集。所有的棉拭經(jīng)渦旋后收集液體并保存。同時(shí)在每間豬欄中掛一根繩子，讓試驗(yàn)豬咀嚼后再收集唾液樣本。所有的樣本都儲(chǔ)存在-80 ℃下備用，之后進(jìn)行病毒滴定（Virus Titration，VT）和實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）。

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）

樣本利用qPCR法檢測(cè)ASF病毒基因組拷貝量，qPCR法參照 King等創(chuàng)立的檢測(cè)方法且進(jìn)行了微調(diào)。病毒DNA利用英國(guó)Qiagen公司的仿生自動(dòng)機(jī)，并用Qiagen公司的核酸提取試劑盒（QIAamp? All Nucleic Acid Kit MDx Kit ）提取。DNA提取完成后，開始進(jìn)行qPCR，靶基因?yàn)锳SF病毒的保守序列p72基因片段。引物：5′-CTG CTC ATG GTA TCA ATC TTA TCG

A-3′和5′-GAT ACC ACA AGA TC（AG）GCC GT-3′。通過(guò)MxPro軟件分析數(shù)據(jù)，qPCR程序如下：高溫變性（95 ℃）、低溫退火（58 ℃）和延長(zhǎng)（72 ℃）。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算ASF病毒基因組拷貝量，單位是拷貝數(shù)/mL。

1.7 病毒滴定（VT）

樣本通過(guò)病毒滴定法檢測(cè)傳染性ASF病毒的含量，初級(jí)豬骨髓細(xì)胞接種在96孔板上，放置于5 %CO2環(huán)境下培養(yǎng)。3 d后，倒去培養(yǎng)基，加入新鮮EMEM培養(yǎng)基[含10 %豬血清，1︰250 HEPES和2 %抗生素溶液（青霉素、鏈霉素、兩性霉素、卡那霉素）]。樣本加入平板中，用稀釋倍數(shù)為10-1～10-8的病毒溶液進(jìn)行滴定，重復(fù)3次。3 d后，通過(guò)鑒定代表紅細(xì)胞吸附作用（受感染細(xì)胞周圍吸附著紅細(xì)胞）的特征性玫瑰花環(huán)結(jié)構(gòu)來(lái)測(cè)定ASF病毒的數(shù)量。ASF病毒的滴度數(shù)據(jù)用斯皮爾曼-卡勃方法計(jì)算，單位是劑量/mL（HAD50/mL）。

1.8 ASF病毒特異性抗體檢測(cè)

血清樣本用西班牙馬德里Ingenasa公司的試劑盒（Ingezim PPA Compac kit）檢測(cè)ASF病毒特異性抗體，根據(jù)說(shuō)明書操作，檢測(cè)針對(duì)VP72（或VP73衣殼蛋白）的抗體水平，同時(shí)計(jì)算了陰性和陽(yáng)性的臨界值便于結(jié)果判定。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

所有記錄的臨床癥狀和病毒模式，根據(jù)每天收集到的單頭豬數(shù)據(jù)，3個(gè)試驗(yàn)組（接種感染豬、同欄內(nèi)接觸感染豬和相鄰欄接觸感染豬）都計(jì)算“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。對(duì)于接種感染豬，我們計(jì)算了潛伏期和孵育期的平均持續(xù)時(shí)間。因?yàn)楦腥井?dāng)天的數(shù)據(jù)不適用于接觸感染豬，所以我們計(jì)算了接觸感染豬從曝露到開始出現(xiàn)臨床癥狀的平均持續(xù)時(shí)間。對(duì)于所有試驗(yàn)豬，我們計(jì)算了傳染期的平均持續(xù)時(shí)間。用單因素方差法分析了試驗(yàn)組之間的每個(gè)不同時(shí)間段的平均持續(xù)時(shí)間，用t檢驗(yàn)法比較了各試驗(yàn)組從出現(xiàn)臨床癥狀到病毒排出的持續(xù)時(shí)間，用單因素方差法比較了各試驗(yàn)組的剖檢組織病變類型。用線性混合效應(yīng)模型分析了試驗(yàn)組之間的臨床評(píng)分和帶毒的數(shù)值，所有的統(tǒng)計(jì)分析和圖表都用R統(tǒng)計(jì)分析軟件。程序包“epi.studysize”、“l(fā)me4”、“l(fā)merTest”、“l(fā)atticeExtra”和P<0.05 用于計(jì)算統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 孵育和傳播

所有試驗(yàn)豬都對(duì)ASF病毒格魯吉亞 2007/1毒株易感，因此所有的接種和接觸感染豬都感染ASF病毒（表1）。除一頭接種感染豬在接種后12 d進(jìn)行安樂死外，其余接種感染豬都在接種后第9天實(shí)行安樂死。所有同欄內(nèi)和相鄰欄間的接觸感染豬分別在曝露后第14和18天實(shí)行安樂死。

2.2 眼觀病變

圖1是3個(gè)試驗(yàn)組最常見的尸體剖檢時(shí)觀察到的眼觀病變。試驗(yàn)組之間的眼觀病變沒有顯著差異。觀察到腫大和出血的淋巴結(jié)（下頜下、腸系膜、氣管支氣管、肝胃），腫大和出血的脾臟，肺臟、腎臟和肝臟上多病灶的皮層出血，以及心包腔累積的流體（心包積液）。

2.3 臨床癥狀和孵育期

大多數(shù)豬出現(xiàn)發(fā)熱（連續(xù)2 d以上體溫超過(guò)40 ℃）、食欲減退、嗜睡和痢疾。表2列出了接種感染豬的孵育期和接觸感染豬到開始出現(xiàn)臨床癥狀的平均持續(xù)時(shí)間。3個(gè)試驗(yàn)組在到開始出現(xiàn)臨床癥狀的時(shí)間上有顯著的差異：接種感染豬為（4.4±1.0） dpi，同欄內(nèi)的接觸感染豬為（9.9±1.6） dpe（曝露后天數(shù)，days post-exposure），相鄰欄的接觸感染豬是（12.7±2.0） dpe。試驗(yàn)組之間在每天臨床癥狀評(píng)分?jǐn)?shù)值的增長(zhǎng)上有顯著差異，且往往接種感染豬的增長(zhǎng)值分別高于同欄內(nèi)和相鄰欄間的接觸感染豬的增長(zhǎng)值（0.5±0.1）分/d和（0.3±0.1）分/d。

2.4 潛伏期和到出現(xiàn)傳染性的時(shí)間

表2列出了接種感染豬潛伏期和接觸感染豬到出現(xiàn)傳染性時(shí)的平均持續(xù)時(shí)間，血液、口液、鼻液、腸液樣本檢測(cè)出ASF病毒基因組或傳染性ASF病毒，3個(gè)試驗(yàn)組在血液里出現(xiàn)ASF病毒基因組的時(shí)間上有顯著差異，但在血液中出現(xiàn)傳染性ASF病毒的時(shí)間上沒有顯著差異。接種感染豬血液中分離到傳染性ASF病毒的時(shí)間是（3.6±1.0） dpi，而從棉拭上分離到傳染性ASF病毒的時(shí)間通常比前者的時(shí)間晚2 d。同欄內(nèi)接觸感染豬從血液中分離到傳染性ASF病毒的時(shí)間是（10.4±1.4） dpe，但在棉拭中檢測(cè)到ASF病毒基因組的時(shí)間要早幾天。相鄰欄接觸感染豬從血液中分離到傳染性ASF病毒的時(shí)間是（13.1±3.0） dpe，但在棉拭中檢測(cè)到ASF病毒基因組的時(shí)間也要早幾天。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)差，同欄內(nèi)接觸感染豬到開始出現(xiàn)病毒血癥的時(shí)間值比接種感染豬的時(shí)間值有更大的范圍；同欄內(nèi)接觸感染豬血液中出現(xiàn)傳染性ASF病毒的時(shí)間和臨床癥狀沒有顯著差異，但接種的感染豬有顯著差異。3個(gè)試驗(yàn)組的豬都偶爾能在鼻棉拭和直腸棉拭中分離到傳染性ASF病毒，但在口腔棉拭上都未分離到。通過(guò)繩索收集到的唾液樣本，經(jīng)ASF病毒基因檢測(cè)，豬欄A在第5天開始檢測(cè)到，豬欄C在第13天開始檢測(cè)到，但在這些樣本中都未檢測(cè)到活的傳染性ASF病毒；只在一頭接種感染豬中于12 dpi檢測(cè)到ASF病毒特異性抗體。

2.5 ASF病毒基因組和傳染性ASF病毒檢測(cè)

圖2列出了3個(gè)試驗(yàn)組在血液、口腔棉拭、鼻棉拭和直腸棉拭中檢測(cè)出的ASF病毒基因組和傳染性ASF病毒的平均值以及臨床癥狀評(píng)分的平均值。血液中的ASF病毒滴度最高，從（106～108） HAD50/mL不等（圖2A）。鼻棉拭和直腸棉拭偶爾能檢測(cè)出到少量的ASF病毒，病毒滴度范圍從（102～104） HAD50/mL不等（圖2C和圖2E）。3個(gè)試驗(yàn)組的試驗(yàn)豬血液中ASF病毒的每天滴度增長(zhǎng)率有顯著差異，接種感染的豬與同欄內(nèi)接觸感染的豬和相鄰欄接觸感染的豬相比，分別高出（0.5±0.1）log10 HAD50/（mL·d）和（0.3±0.1）log10 HAD50/（mL·d）。鑒于標(biāo)準(zhǔn)差，同欄內(nèi)接觸感染的試驗(yàn)組與接種感染的試驗(yàn)組相比，血液中的ASF病毒滴度范圍更大（圖2A）。鼻液和腸液樣本雖能檢測(cè)到高ASF病毒基因組拷貝數(shù)，但僅能偶爾分離到傳染性ASF病毒（圖2D和圖2F）?？谝簶颖倦m能檢測(cè)到ASF病毒基因組拷貝數(shù)，但未分離到傳染性ASF病毒（圖2H）。

2.6 傳染期

表3列出了3個(gè)試驗(yàn)組在傳染期，血液、口腔棉拭、鼻棉拭和直腸棉拭中檢測(cè)出的ASF病毒基因組和傳染性ASF病毒的平均持續(xù)時(shí)間。3個(gè)試驗(yàn)組在傳染期持續(xù)時(shí)間上有顯著差異。接種感染的豬血液內(nèi)ASF病毒基因組和傳染性ASF病毒的持續(xù)時(shí)間顯著高于接觸感染豬的相應(yīng)值。接種感染豬的口腔棉拭、鼻棉拭和直腸棉拭中ASF病毒基因組和傳染性ASF病毒的持續(xù)時(shí)間顯著低于接觸感染豬的相應(yīng)值。

3 討論

本項(xiàng)研究的目的是提供家豬感染ASF病毒格魯吉亞2007/1毒株后機(jī)體帶毒和排毒的動(dòng)力學(xué)機(jī)理的定量數(shù)據(jù)。結(jié)果證實(shí)家豬對(duì)這一個(gè)在東歐國(guó)家流行的ASF病毒毒株易感，直接和間接感染都會(huì)引發(fā)急性疾病。雖然有一頭接種感染豬存活了12 d，但其他接種感染的試驗(yàn)豬都在第9天實(shí)行了安樂死。同欄內(nèi)接觸感染豬和相鄰欄接觸感染豬分別在第14和第18天實(shí)行安樂死。試驗(yàn)結(jié)果表明在可控環(huán)境中，ASF病毒格魯吉亞2007/1毒株能引起持續(xù)感染的可能性有限，家豬和野豬一樣，可成為該毒株的攜帶者。所有試驗(yàn)豬都表現(xiàn)出溫和型非特異性的臨床癥狀。最近的文獻(xiàn)報(bào)道了在用相似的ASF病毒毒株進(jìn)行動(dòng)物感染試驗(yàn)時(shí)以及在ASF病毒感染區(qū)域家豬暴發(fā)ASF時(shí)，家豬和野豬都能出現(xiàn)與本試驗(yàn)相似的臨床癥狀和眼觀病變。接種感染豬一般在3 dpi表現(xiàn)出臨床癥狀，意味著在豬場(chǎng)中造成ASF病毒感染到發(fā)生疾病期間出現(xiàn)嚴(yán)重延誤是有可能的。由于臨床癥狀相似，可能會(huì)被誤診為其他出血性疾?。ㄈ缲i瘟和豬皮炎與腎病綜合征），這會(huì)導(dǎo)致疾病不能上報(bào)和ASF病毒的延遲診斷。因此當(dāng)豬在豬場(chǎng)、市場(chǎng)和屠宰場(chǎng)的運(yùn)輸過(guò)程中，ASF病毒可以快速傳播，但豬農(nóng)往往未察覺且并不能上報(bào)疫情。

本項(xiàng)研究也表明了家豬通過(guò)血液接觸可以傳播ASF病毒，野豬亦是如此。根據(jù)血液樣本的檢測(cè)結(jié)果，接種感染豬、同欄內(nèi)接觸感染豬和相鄰欄接觸感染豬的潛伏期/出現(xiàn)傳染性的平均期限分別是（3.6±1.0） d、（10.4±1.4） d和（13.1±3.0） d。相鄰欄接觸感染豬出現(xiàn)病毒血癥的時(shí)間顯著比同欄內(nèi)接觸感染豬的更遲，這說(shuō)明豬場(chǎng)的一些基礎(chǔ)設(shè)施，如圍墻，可以延遲該疾病的傳播。3個(gè)組的試驗(yàn)豬血液樣本ASF病毒滴度范圍是（106～108） HAD50/mL，比棉拭樣本中的高。最近在關(guān)于動(dòng)物行為學(xué)的一篇研究報(bào)道中，提到了豬平常的社群接觸，如飼喂和配種，通常會(huì)引起皮膚損傷，如果有流血會(huì)出現(xiàn)更多的舔舐行為和咬傷情況。因此，尤其是同欄內(nèi)的傳播，血液更容易污染環(huán)境。血液中檢測(cè)到的傳染性ASF病毒含量和qPCR法檢測(cè)到的ASF病毒基因組拷貝數(shù)相當(dāng)，說(shuō)明這個(gè)檢測(cè)方法可用于該疾病控制。盡管如此，在接種感染豬的一部分血樣中，病毒滴度法檢測(cè)到的潛伏期比qPCR法檢測(cè)到的更短，造成兩者間有差異的原因還未知。用OIE的ASF病毒qPCR法檢測(cè)了222份血液樣本，其中僅有8份樣本有誤診，說(shuō)明本試驗(yàn)的qPCR檢測(cè)方法有一致的敏感性。接觸感染豬的病毒血癥的起始時(shí)間和臨床癥狀沒有顯著的差異，說(shuō)明自然傳播大多數(shù)在出現(xiàn)ASF癥狀時(shí)同步發(fā)生。這也說(shuō)明基于臨床癥狀的早期診斷并不是控制ASF病毒的有效手段，雖然其他疾病可通過(guò)此方法成功地得到根除。

此外，試驗(yàn)結(jié)果也表明ASF病毒可以通過(guò)口液、鼻液、直腸液傳播，家豬的一些探究行為可以輕易地將病毒排到環(huán)境中，導(dǎo)致ASF病毒傳播存在較高的可能性，尤其是相鄰欄間的傳播。同欄內(nèi)接觸感染豬和相鄰欄接觸感染豬在產(chǎn)生病毒血癥前，通過(guò)鼻腔和口腔的樣本檢測(cè)就已經(jīng)能檢測(cè)到出現(xiàn)傳染性的時(shí)間，但與血液中的傳染性ASF病毒含量相比，通過(guò)這兩種途徑檢測(cè)到的病毒含量更低，范圍介于102 HAD50/mL到 104 HAD50/mL間。而且在直腸棉拭和鼻棉拭中很難分離到ASF病毒。與其他研究報(bào)道相矛盾的是，未在口腔棉拭或咀嚼過(guò)的繩索中分離到ASF病毒，雖然不能排除qPCR檢測(cè)污染造成的假陽(yáng)性因素，但這些現(xiàn)象表明可能是因?yàn)橥僖褐锌赡艽嬖诘目贵w降低了ASF病毒存活率，或者是因?yàn)闃颖局械腁SF病毒迅速失去活性，不適合通過(guò)病毒滴定法測(cè)定。接觸感染豬通常在產(chǎn)生病毒血癥之前就能在口腔和鼻腔樣本中檢測(cè)到ASF病毒基因組，ASF病毒在靠近最初感染部位的淋巴結(jié)中的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中開始病毒復(fù)制的這一事實(shí)也解釋了這一點(diǎn)。因此，家豬通過(guò)接觸途徑感染ASF病毒時(shí)，可能在口咽區(qū)最早開始病毒復(fù)制，導(dǎo)致鼻腔和口腔排出傳染性病毒早于病毒的全身擴(kuò)散，這也預(yù)示ASF病毒可以跟典型豬瘟病毒一樣，通過(guò)檢測(cè)口鼻棉拭中的病毒基因組來(lái)做到早期診斷。

本項(xiàng)試驗(yàn)的多個(gè)因素闡明了因ASF病毒的感染途徑不同而致ASF發(fā)病機(jī)制不同。接種感染豬最早在血液中檢測(cè)到ASF病毒基因組，而接觸感染豬最早在口鼻棉拭中檢測(cè)到ASF病毒基因組，說(shuō)明肌內(nèi)接種能夠更早地引起全身擴(kuò)散。而且，3個(gè)試驗(yàn)組的試驗(yàn)豬血液中ASF病毒滴度的每天增長(zhǎng)速度是顯著不同的，接種感染豬的增長(zhǎng)明顯更快，表示肌內(nèi)接種感染的疾病發(fā)展進(jìn)程更快。雖然3個(gè)試驗(yàn)組的試驗(yàn)豬在臨床癥狀類型上沒有差異，但接種感染豬的臨床癥狀評(píng)分值增長(zhǎng)速度也更快。接種感染豬雖然感染的標(biāo)準(zhǔn)差更小，但根據(jù)觀察到的排毒模式，表明肌內(nèi)接種感染減少了自然感染的異質(zhì)性。最后，雖然3個(gè)試驗(yàn)組所有試驗(yàn)豬都在自然死亡前實(shí)行了安樂死，但傳染期的時(shí)間范圍還存在顯著差異。發(fā)病機(jī)制的不同，取決于肌內(nèi)接種和自然感染途徑在病毒最開始復(fù)制部位的不同，影響了帶毒和排毒的動(dòng)力學(xué)過(guò)程。所以，接種感染豬的數(shù)據(jù)不能代表接觸感染豬ASF病毒感染的自然進(jìn)程。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明需要未來(lái)獲得更多的ASF病毒感染的數(shù)據(jù)。雖然其他感染途徑?jīng)]有接種感染有效，但也可以作為選擇，但同時(shí)需要額外地使用再次接觸感染或模式法進(jìn)行傳播試驗(yàn)。鑒于動(dòng)物福利的考慮，所有試驗(yàn)動(dòng)物在自然死亡前實(shí)行安樂死，這可能導(dǎo)致了觀測(cè)到的傳染期持續(xù)時(shí)間有偏差。盡管如此，先前已有研究，報(bào)道了相似的通常出現(xiàn)傳染性的時(shí)間間隔，即3 d～6 d。最后，雖然先前的報(bào)道表明抗體檢測(cè)對(duì)控制由ASF病毒弱毒株引發(fā)的疾病上具有重要作用，但本試驗(yàn)的血清學(xué)結(jié)果表明只有1頭接種感染豬在12 dpi檢測(cè)到ASF病毒特異性抗體。在東歐ASF病毒感染地區(qū)，目前豬發(fā)生急性型ASF，并且大多數(shù)感染豬在抗體產(chǎn)生之前的疾病進(jìn)程早期就已死亡。所以我們的試驗(yàn)結(jié)果表明，只要還是針對(duì)當(dāng)前流行的ASF病毒毒株，血清學(xué)檢測(cè)法不是該病可靠的監(jiān)控方法，除非毒株毒力發(fā)生了減弱后而出現(xiàn)了更長(zhǎng)時(shí)間的感染或者持續(xù)感染。

由于許多因素，包括病毒排出、曝露時(shí)間、病毒存活、樣本大小和其他實(shí)驗(yàn)條件會(huì)影響疾病傳播研究的結(jié)果，因此試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)該給予認(rèn)真考慮。例如，在接觸感染豬中觀察到的帶毒或出現(xiàn)傳染性的時(shí)間存在差異，可能是因?yàn)樨i對(duì)ASF病毒易感性上存在個(gè)體差異性或者傳染豬和易感豬之間接觸的類型不同決定了傳播的效力。盡管如此，相比于田間試驗(yàn)，此項(xiàng)試驗(yàn)的優(yōu)勢(shì)是只需要有限數(shù)量的豬，并能夠進(jìn)行頻繁的采樣和較田間試驗(yàn)更可控的環(huán)境。各組試驗(yàn)都實(shí)現(xiàn)了ASF病毒的傳播，表明在豬場(chǎng)中家豬可以迅速的傳播ASF。但是，田間觀察表明，在ASF暴發(fā)期間，豬的死亡率也可能很低，同時(shí)盡管ASF病毒格魯吉亞2007/1毒株有很高的毒力，在感染群體中也發(fā)現(xiàn)了健康豬。這也預(yù)示著因宿主特異性或者飼養(yǎng)方式的原因，該病可能會(huì)以不同的速度傳播?？偠灾?，這些結(jié)果首次提供了ASF病毒傳播參數(shù)的定量數(shù)據(jù)，建立了同群內(nèi)ASF病毒的動(dòng)態(tài)傳播模式，有助于為開發(fā)和執(zhí)行控制ASF傳播的策略提供有效的建議。