隱匿性乙型肝炎病毒感染的研究進展

王成偉， 咸建春

(南通大學第五附屬醫(yī)院肝病科， 江蘇 泰州 225300)

乙型肝炎病毒(HBV)感染是全球重大的公共衛(wèi)生問題，全球大約有20億人感染過HBV，其中約有2.57億慢性HBV感染者[1]。最新版歐洲指南將慢性HBV感染的自然史劃分為5個期，即：①HBeAg陽性慢性HBV感染、②HBeAg陽性CHB、③HBeAg陰性性慢性HBV感染、④HBeAg陰性CHB、⑤HBsAg陰性期，其中第5期也被稱作：隱匿性HBV感染(occult HBV infection，OBI )。上個世紀70年代末，在HBsAg陰性、抗-HBc陽性的供血者中發(fā)現(xiàn)其具有傳播HBV的風險，并由此提出了OBI。數(shù)十年來，隨著科學技術(shù)的發(fā)展，我們對OBI的認識也日趨完善。本文就OBI的定義、分型、起源、流行病學、發(fā)病機制、臨床意義、診斷進行綜述。

1 OBI的定義及分型

1.1OBI定義的基本構(gòu)架：血清中HBsAg陰性、HBV DNA陽性或陰性，肝組織中的HBV DNA陽性。但各文章對OBI的定義有著細微而重要的區(qū)別，主要在于：①and/or、with/without的關(guān)系(肝組織中HBV DNA陽性伴/不伴(和/或)血清中HBV DNA陽性)，②血清及肝組織中的HBV DNA的具體水平，即：是否對HBV DNA水平進行定量描述，③肝組織中的DNA具體是哪種DNA，即：是否對肝組織中的HBV DNA進行定性描述[1～3]。2018年意大利舉辦的“關(guān)于OBI的陶爾米納專家共識會議”將OBI定義為：根據(jù)現(xiàn)有的檢測方法，血清乙肝表面抗原(HBsAg)檢測呈陰性，肝組織中可以檢測到具有復制能力的HBV DNA(即cccDNA)和/或血清中HBV DNA陽性，這種狀態(tài)被稱為OBI[2]。在OBI群體中，由于宿主免疫及表觀遺傳調(diào)控，肝組織中的cccDNA處于低復制狀態(tài)。因此，當血清中HBV DNA被檢測到時，往往處于低載量(<200IU/mL)，并且只能被間歇檢測到[2]。

1.2OBI的分型：根據(jù)血清學檢測結(jié)果，OBI可以分為血清學陽性及血清學陰性兩類。其中，血清學陽性的OBI(Seropositive OBI)占比80%，其血清學特征表現(xiàn)為：抗-HBs(hepatitis B surface antibody，抗-HBs)和/或抗-HBc(hepatitis B core antibody，抗-HBs)陽性；血清學陰性的OBI(Seronegative OBI)占比1～20%,其血清學特征表現(xiàn)為：抗-HBs及抗-HBc陰性，其中，感染初期即表現(xiàn)為血清學陰性的OBI(primary OBI)即原發(fā)性O(shè)BI已在土撥鼠動物模型中得到證實[2]。

2 OBI的起源

OBI主要起源于獲得HBsAg清除的CHB群體，其次為急性自限性乙型肝炎(Self-limiting acute hepatitis B)群體，上述二者往往表現(xiàn)為血清陽性的OBI，但是隨著時間進展，也可轉(zhuǎn)化為血清學陰性的OBI[2]。除原發(fā)性O(shè)BI外，還有一種特殊類型的OBI為嬰兒免疫阻斷后OBI，具體表現(xiàn)為：一些HBsAg陽性的孕婦所生嬰兒經(jīng)過免疫阻斷(單用疫苗或聯(lián)合乙肝免疫球蛋白)后，雖然血清中HBsAg陰性、抗-HBsAg陽性(提示免疫阻斷成功)，但血清中可以檢測到HBV DNA，提示這些嬰兒免疫阻斷成功后仍可能存在OBI[2]。由于對免疫功能的消耗存在差異，上述4個來源不同的OBI的傳染性及相關(guān)并發(fā)癥(如肝硬化、HCC、HBV再激活)的風險也不同，其中獲得HBsAg清除的CHB群體的傳染性及相關(guān)并發(fā)癥的風險比急性自限性乙型肝炎及嬰兒免疫阻斷后OBI群體要高[2]。

3 OBI的流行率

目前對于OBI流行病學的調(diào)查仍然比較棘手，主要有下列幾個原因：①檢測方法的靈敏度及特異性；②HBV暴露的危險因素；③人群中的HBV流行率；④是否合并基礎(chǔ)肝病及其嚴重度；⑤OBI的定義。由于上述原因的存在，無法對相關(guān)數(shù)據(jù)進行分析及對比。OBI在不同地區(qū)、不同人群中的流行率差異極大，可以低至<1%，也可以高至87%，但這需要謹慎解讀，因為有上述多種因素可以影響OBI的流行率。目前，OBI的流行率主要是在供血人群及肝病人群中進行調(diào)查，但在供血人群中很少篩查出OBI，HBsAg陰性供血人群的HBV DNA檢出率通常低于0.5%[2,4]。OBI的流行率與該區(qū)域及研究群體中顯性HBV感染率相關(guān)，其中在亞洲地區(qū)有著較高的流行率[2,3]。OBI在慢性肝病患者中流行率較高，有研究表明：在HCV感染群體中達到15～33%，在隱源性肝硬化群體中達到32%，而在HCC患者中可能高達62%。OBI在有HBV感染危險因素的群體中的流行率表較高，詳見表1[2](表1為參考文獻中提及的數(shù)據(jù))，對這部分群體需要進行定期篩查及監(jiān)管[2]。由于方法學的限制，OBI在一般人群中流行率尚不明確。

表1 OBI在有HBV感染危險因素的群體中的流行率

4 OBI的發(fā)病機制

目前OBI的發(fā)病機制尚未完全闡明，大部分學者認為是多因素共同作用的結(jié)果。主要包括：病毒因素、宿主因素、其他因素。其中病毒因素包括：基因突變、病毒載量低、表觀遺傳調(diào)控、免疫復合物的形成；宿主因素包括：免疫及遺傳因素；其他因素為：合并其他病毒感染[3,5]。

4.1病毒因素：①在OBI群體中，HBV基因組中4個開放閱讀框(open reading frame)均可以發(fā)生突變，目前研究最廣泛的是PreS/S突變。PreS/S突變可以通過：影響HBsAg的抗原性、免疫原性，引起HBsAg蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，導致其不能被常用的商業(yè)試劑檢測到，其中部分突變?nèi)后w血清中的HBV水平與顯性感染者相當，這部分群體被認為是“假OBI(False OBI)”；抑制HBV的復制及分泌，進而抑制HBsAg的表達及分泌，從而使得血清中HBsAg水平低于檢測下限而導致其無法檢出。但是，PreS/S突變的特異性并不高，有研究表明部分OBI群體中檢測不到上述突變，同時部分顯性HBV感染群體中可以檢測到上述突變。②相比于HBV顯性感染者，OBI群體血清中的HBV水平較低(<200IU/mL)。同時，也有研究表明OBI群體肝組織中的cccDNA水平也比HBV顯性感染者低。因此，認為病毒載量低也與OBI相關(guān)。③表觀遺傳調(diào)控包括：HBV CpG島發(fā)生甲基化，從而抑制HBV復制；通過乙?；痗ccDNA上的H3/H4組蛋白可以調(diào)控HBV表達。④血清中抗-HBs與HBsAg形成免疫復合物，導致HBsAg檢測不出。

4.2宿主因素：宿主免疫控制：①一系列長期持久的特異性T cell免疫可以抑制HBV復制。②OBI群體中，部分使用CD20單抗治療的患者可以出現(xiàn)HBV再激活，因此認為體液免疫在OBI中也有重要作用[6]。③在土撥鼠模型中發(fā)現(xiàn)固有免疫在OBI中也有相應(yīng)作用[7]。宿主遺傳因素：①HLA(human leukocyte antigen，HLA)在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，有研究表明HLA的多態(tài)性是決定HBV感染預后的重要因素。②宿主表觀遺傳修飾也可能與OBI有關(guān)。宿主細胞中的microRNAs可以調(diào)節(jié)某些宿主基因的表達，來影響HBV的復制和表達。

4.3合并其他病毒感染：合并HCV感染：①存在于同一肝細胞的HCV會抑制HBV的復制；②HCV核心蛋白通過與HBx蛋白之間相互作用抑制HBV DNA復制；③HCV非結(jié)構(gòu)蛋白2(nonstructural protein 2，NS2)及5A(nonstructural protein 5A，NS5A)也會干擾HBV的復制[3,5]。合并HIV感染：有研究表明OBI合并HIV感染的群體通過HLA及其多態(tài)性，宿主表觀遺傳修飾來影響HBV的復制和表達[5]。

體外試驗表明：從OBI群體中提取的HBV DNA在體外完全具體有復制能力，且能通過輸血及器官移植傳播。此外，在免疫功能低下的OBI群體中(如：接受腫瘤化療或其他免疫抑制治療)能觀察到HBV再激活。上述證據(jù)支持：相比于病毒因素及其他因素，宿主免疫控制因素可能在OBI的形成中起到更加重要的作用[2]。

5 OBI的臨床意義

OBI的潛在危害包括：傳播(輸血、器官移植、母嬰傳播)風險、引起和/或加重相關(guān)肝臟疾病以及HBV再激活的風險(再激活應(yīng)DBI的相關(guān)治療部分具體闡述)。

5.1傳播風險：OBI是乙型肝炎傳播鏈上不可忽視的傳染源，患者可以通過輸血、肝移植或者母嬰傳播的方式進行傳播，使受者感染HBV[2,3]。在一些低收入國家(尚未實施NAT(nuclei acid testing，NAT)及抗-HBc檢測)，OBI供血人群通過輸血傳播HBV仍然是一重要的衛(wèi)生問題。即便在發(fā)達國家，也存在OBI供血者通過輸血傳播HBV的風險，因為導致HBV感染的最低病毒載量仍低于當前NAT的下限值[4]。有研究證實：即便在使用檢測下限為5～20IU/mL的NAT進行HBV DNA篩查時，仍會遺漏部分OBI供血人群，并導致輸血傳播HBV[4]。盡管在供血人群中很少篩查出OBI，但是OBI供血者輸血相關(guān)的HBV傳播的發(fā)生率很可能被低估了，因為：①供血者的血清中不能或只能間歇檢測到HBV DNA；②難以對受血者進行隨訪調(diào)查；③供血者的血清樣本量有限；④輸注OBI供者血液致HBV感染的受者往往無明顯的急性肝炎的臨床表現(xiàn)，容易被忽視及遺漏，這也可能代表了大多數(shù)的OBI供血者通過輸血傳播HBV的病例。值得慶幸的是，輸血前受者體內(nèi)存在抗-HBs可顯著降低HBV感染風險。

即使在血清HBsAg清除后，HBV DNA仍可長期持續(xù)存在于HBV感染者的肝組織中。因此，OBI肝臟供者可將HBV傳播給HBsAg陰性、抗-HBc陰性和抗-HBs陰性的受者，受者感染HBV后有進展為肝炎的風險，因此建議受者使用NUCs(ETV或TAF/TDF)進行長期的預防性抗病毒治療。然而，盡管預防性抗病毒治療能夠防治肝炎的發(fā)生，卻可能無法完全預防OBI的發(fā)生。

HBsAg陽性的母親所生新生兒免疫阻斷后，盡管部分嬰幼兒在第18周時血清學檢測結(jié)果提示母嬰阻斷成功(即嬰兒HBsAg陰性且抗-HBs陽性)，但血清中仍可檢測到HBV DNA，建議連續(xù)隨訪至少至24月齡，若HBV DNA持續(xù)陽性，可考慮發(fā)生OBI[8,9]。

5.2OBI與肝臟疾?。篊HB群體在獲得HBsAg清除后通常都能獲得良好的預后，但仍有一部分人會發(fā)生HCC，尤其是HBsAg清除發(fā)生50歲以上的男性及已經(jīng)形成肝硬化的群體[3]。據(jù)推測，對于HBsAg血清學清除的CHB患者，若存在OBI，其HCC發(fā)生的風險并未消除，但可能會降低。在一項研究中，2.34%(7/298)的HBsAg血清學清除患者在9年的中位隨訪中發(fā)生HCC，其發(fā)生率取決于性別和HBsAg血清學清除發(fā)生的年齡[2]。目前多數(shù)學者認為：OBI在肝硬化和HCC的進展中起著重要作用。例如，在多項涉及隱源性HCC患者的回顧性研究中，發(fā)現(xiàn)60%～70%的患者合并有OBI[2,10]。在日本的一項涉及82例隱源性肝硬化患者的前瞻性研究中，HCC 10年累積病發(fā)生率為：合并OBI組為100%，未合并OBI組為17.6%(p = 0.008)，多變量分析證實，在這項前瞻性研究中，OBI是隱源性肝硬化中HCC發(fā)生的獨立危險因素[2]。多項前瞻性研究的結(jié)果顯示：OBI合并HCV感染患者的HCC發(fā)生率是單純HCV感染的2倍以上[2]。同時，對土撥鼠動物模型的研究證實：在土撥鼠肝炎病毒(woodchuck hepatitis virus,WHV)表面抗原清除后(起源自急性自限性感染)，肝組織中仍能持續(xù)檢測到WHV DNA，肝組織病理學表現(xiàn)為：持續(xù)輕度的壞死性炎癥，并且伴有較高的肝癌發(fā)生率[2]。

一系列證據(jù)表明：OBI保留了顯性HBV感染的致癌機制，包括直接和間接機制，直接機制為：①HBV DNA整合到宿主基因上，②產(chǎn)生致癌蛋白；間接機制為：肝組織中形成長期持續(xù)輕度的壞死性炎癥，促進肝組織往肝硬化的方向發(fā)展，進而再形成HCC[2,3]。OBI患者的HBV能整合到宿主的基因組中，使宿主基因組或者HBV自身發(fā)生改變，有著直接的致癌作用。HBV DNA整合到宿主基因上，形成插入突變，破壞染色體的穩(wěn)定性，引起宿主基因功能改變，引起原癌基因表達上調(diào)或者抑癌基因表達下調(diào)，最終導致腫瘤的發(fā)生，也可以導致自身的功能發(fā)生變化，產(chǎn)生致癌蛋白：HBx、PreS/S,這些蛋白可能會擾亂宿主基因的表達調(diào)控機制或者激活致癌信號通路，從而導致腫瘤的發(fā)生[2,3,5,11]。

OBI是否會導致肝損害及加速基礎(chǔ)肝病肝硬化的進展目前仍有很大爭議[2]。有部分學者發(fā)現(xiàn)：起源自急性自限性乙型肝炎的OBI群體肝組織中存在著長期持續(xù)的輕微的壞死性炎癥，這些群體往往無肝功能受損的臨床及生化學表現(xiàn)，這與在土撥鼠模型中觀察到的情況一致。同時也有研究表明：OBI群體血清中的HBV DNA載量具有波動性，HBV DNA可能被間歇檢測到，當HBV DNA復制能力一過性增強時，往往伴隨著丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine transaminase，ALT)水平的升高[2]。因為在OBI群體中對于HBV的抑制不是永恒持久的，隨著時間的推移，會出現(xiàn)短暫的HBV再激活進而引起肝損害[2]；另一方面，少量病毒蛋白持續(xù)刺激誘導大量的特異性的細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)釋放從而導致肝損害[2]。

6 OBI的診斷和相關(guān)治療

OBI的診斷主要依賴于血清學及病毒學檢查，其中檢測方法的敏感性及特異性尤為重要，這將影響到OBI診斷準確率(防止誤診及漏診)及對危險人群的篩查及監(jiān)管。首先，OBI的定義要求血清中HBsAg陰性，目前多數(shù)商用HBsAg檢測方法的檢測下限是0.05 IU/mL。然而，有研究表明：使用上述方法檢測出的陰性樣本中，有1%～48%的樣本在高靈敏的HBsAg檢測方法(檢測下限為0.005 IU/mL)中呈陽性[12,13]。通過上述高靈敏的檢測方法，可以發(fā)現(xiàn)更多的HBV顯性感染，防止誤診為OBI。除了靈敏度外，商用HBsAg測定方法在檢測S-逃逸變異體(S-escape variants)的能力上也存在差異[14]。因此，所有HBsAg檢測應(yīng)強制使用針對HBsAg多個表位的抗-HBs探針，以確保檢測到HBV S變異體，因為其中存在部分“假OBI(False OBI)”。

OBI的診斷是基于在HBsAg陰性個體血清中檢測到HBV DNA或肝組織中檢測到具有復制能力的HBV DNA，即cccDNA。結(jié)合OBI的定義，可以發(fā)現(xiàn)檢測肝組織中的cccDNA是一個最直接的方式，但由于肝穿刺難以大規(guī)模推廣以及目前國內(nèi)外尚無標準化的檢測方法[7]，因此，檢測血清中的HBV DNA是一種更加常用的方法，包括：實時PCR(real-time polymerase chain reaction，real-time PCR)及巢式PCR(nested polymerase chain reaction，nested PCR)。其中，至少包括S、C和X三個以上基因片段的引物作PCR檢測陽性才能診斷為OBI。整合的HBV DNA不能作為OBI診斷標準，因為其不具有復制能力。目前多數(shù)商用HBV DNA檢測方法的檢測下限是5～20 IU/mL，但有研究發(fā)現(xiàn)使用此下限值的NAT仍會漏診部分OBI，且其具有輸血傳播HBV的風險[4]。因此，對于血液制品的檢測，其核酸檢測(nuclei acid testing，NAT)的特異性需達到99%(如：Procleix-Ultrio Elite assay )，下限值通常在2～4 IU/mL，這樣才能有效阻斷OBI群體輸血傳播HBV[4]。OBI群體血清中的HBV DNA通常處于低載量(<200IU/mL)，同時因其載量的波動性可能被間歇檢測到，因此建議每次采集(血漿)量≥1mL，必要時可以多次取樣，以防止漏診OBI。

檢測血清中的抗-HBc常作為一種替代標志物?？?HBc陽性通常代表著既往HBV感染，由于血清學陽性的OBI占80%，因此，抗-HBc陽性可以指定一部分群體來進行核酸檢測進而診斷或排除OBI，這有利于流行病學的研究及高危人群的初步篩查。同樣地，血清學抗-HBc陰性也不能完全排除OBI。

當OBI群體接受腫瘤化療或其他免疫抑制治療時，他們可能會發(fā)生HBV再激活，但OBI群體HBV再激活發(fā)生率低于慢性HBV感染群體[2,3,15]。OBI群體在不同條件下的HBV再激活率差異較大，詳見表2，可據(jù)此對OBI群體進行風險分層，并制定相應(yīng)策略，詳見表3。其中有一類特殊群體需單獨闡述，即：OBI合并HIV(human immunodeficiency virus，HIV)感染，鑒于HIV和HBV有共同的傳播途徑，以及HIV破壞免疫系統(tǒng)，HBV再激活在OBI合并HIV感染的群體中也有大量報道。然而，伴隨著強效的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的廣泛使用，包括兼顧有抗HBV活性的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的廣泛使用，在接受恰當治療的艾滋病群體中(合并OBI)，HBV再激活的風險已經(jīng)變得微不足道。但是，值得關(guān)注的是：當調(diào)整抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療方案(如：停用抗HBV藥物時)，合并HIV感染的OBI群體也可能會發(fā)生HBV再激活。

表2 OBI群體在不同條件下的HBV再激活率

表3 OBI群體HBV再激活風險分級及防治策略

7 小 結(jié)

OBI是一個普遍存在但容易被忽視的問題。過去數(shù)十年間，隨著血清學及病毒學檢測技術(shù)的發(fā)展，對OBI的認識日趨完善。然而仍有疑惑未得到解決：①尚無標準化檢測方法，不同研究不能進行對比及組合；②需要高靈敏的檢測方法來協(xié)助診治；③不同地區(qū)不同人群的OBI流行率尚不明確；④OBI是否會、如何、在什么情況下導致和/或加重肝臟疾病尚不明確；⑤需進一步明確OBI的傳播風險；⑥對于OBI群體的HBV再激活尚無通用的指南；⑦對于OBI的發(fā)生機制，仍需要進一步的研究。因此，對于OBI的研究依然任重而道遠。