狗食管下括約肌處射頻控溫?zé)崮g(shù)后病理學(xué)及神經(jīng)遞質(zhì)變化的研究

周曉丹王洪濤△劉義賓汪忠鎬

狗食管下括約肌處射頻控溫?zé)崮g(shù)后病理學(xué)及神經(jīng)遞質(zhì)變化的研究

周曉丹1王洪濤1△劉義賓1汪忠鎬2

目的探討射頻控溫?zé)崮g(shù)（RFT）對(duì)家狗食管下括約?。↙ES）處病理組織及神經(jīng)遞質(zhì)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（ChAT）、血管活性腸肽（VIP）和一氧化氮合酶（NOS）表達(dá)的影響及可能機(jī)制。方法15只家狗隨機(jī)分為3組：進(jìn)行胃鏡檢查并飼養(yǎng)3個(gè)月（Sham）組、RFT后飼養(yǎng)24 h（RFT+24 h）組、RFT后飼養(yǎng)3個(gè)月（RFT+3 m）組。取LES組織采用HE染色法觀察3組的病理組織學(xué)變化，免疫組化法觀察Sham組和RFT+3 m組ChAT、VIP和NOS的表達(dá)情況。結(jié)果HE染色結(jié)果顯示Sham組接近正常組織，RFT+24 h組黏膜出現(xiàn)急性炎癥反應(yīng)和結(jié)構(gòu)破壞，RFT+3 m組黏膜出現(xiàn)慢性炎性反應(yīng)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)；免疫組化結(jié)果顯示RFT+3 m組與Sham組相比，ChAT明顯升高，VIP、NOS明顯下降（均P＜0.01）。結(jié)論RFT可使狗的LES厚度和壓力增加，并造成局部組織內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)生表達(dá)變化。

胃食管反流；食管括約肌,下段；膽堿O-乙酰轉(zhuǎn)移酶；血管活性腸肽；一氧化氮合酶；狗；射頻控溫?zé)崮g(shù)；食管下括約?。荒憠A乙酰轉(zhuǎn)移酶

胃食管反流?。╣astroesophageal reflux disease, GERD）的內(nèi)鏡下射頻治療(Stretta)在國(guó)內(nèi)最早由劉建軍等報(bào)道[1]，其操作安全，并發(fā)癥少，可以重復(fù)治療，對(duì)于藥物治療無(wú)效的頑固性患者或伴隨食管外癥狀患者有其獨(dú)特療效，目前，在國(guó)內(nèi)應(yīng)用較為廣泛。射頻治療的作用機(jī)制主要為術(shù)后使食管下括約?。╨ower esophageal sphincter,LES）壓力增高和術(shù)后的一過(guò)性LES松弛（transit LES relaxation,tLESR）的頻率降低。術(shù)后LES的壓力增高可通過(guò)射頻后局部病理組織學(xué)變化和食管壓力的測(cè)定評(píng)估，然而，射頻治療降低tLESR的機(jī)制尚不明確。本研究通過(guò)觀察狗LES在射頻控溫?zé)崮g(shù)（radiofrequency thermocoagulation,RFT）后的病理組織學(xué)和部分神經(jīng)遞質(zhì)的表達(dá)變化，以期進(jìn)一步探討RFT在治療胃食管反流病方面的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物普通家狗15只，清潔級(jí)，體質(zhì)量（10±2）kg，雌雄不限，剔除妊娠狗，均購(gòu)自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司駐河南飼養(yǎng)動(dòng)物室（生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK魯20080002）。按隨機(jī)區(qū)組法將動(dòng)物隨機(jī)分為3組，每組5只，分別為：僅行胃鏡檢查并飼養(yǎng)3個(gè)月后處死(Sham組),行RFT并24 h后處死（RFT+24 h組）,行RFT并飼養(yǎng)3個(gè)月后處死（RFT+3 m組）。

1.2 主要試劑和儀器麻醉藥：速眠新Ⅱ號(hào)（吉林省敦化市圣達(dá)動(dòng)物藥品有限公司）；促蘇醒藥：蘇三號(hào)（吉林省敦化市圣達(dá)動(dòng)物藥品有限公司）；DFX-23D型電動(dòng)吸引器（上?？屏栳t(yī)療器械有限公司）；MER-200GA射頻控溫?zé)崮鳎ü枮I美頓醫(yī)療器械有限公司）；EPX-2200電子胃鏡（日本富士能株式會(huì)社）。兔抗人膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（ChAT）多克隆抗體、兔抗人血管活性腸肽（VIP）多克隆抗體、兔抗人一氧化氮合酶（NOS）多克隆抗體和SABC試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；DAB試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Biosens Digital Imaging System V1.6圖像分析軟件購(gòu)自上海山富科學(xué)儀器有限公司。

1.3 標(biāo)本制備（1）術(shù)前禁食24 h（不禁水），藥物促排糞便。（2）0.5 mL/kg速眠新Ⅱ號(hào)肌內(nèi)注射，麻醉成功后，固定于操作臺(tái)上，取左側(cè)臥位，開(kāi)口器固定。（3）Sham組插入胃鏡觀察食管、胃內(nèi)情況，測(cè)量門(mén)齒距胃食管連接處距離，拔出胃鏡。（4）RFT+24 h組和RFT+3 m組均于胃鏡觀察、測(cè)量門(mén)齒距胃食管連接處距離后，沿導(dǎo)絲插入治療導(dǎo)管，拔出胃鏡，自胃食管連接處向食管遠(yuǎn)心端選取3個(gè)層面、每個(gè)層面間隔0.5 cm。設(shè)定射頻控溫?zé)崮委熎鬏敵龉β? W，治療時(shí)間60 s。每個(gè)層面治療2次，每次4個(gè)治療點(diǎn)，共8個(gè)點(diǎn)。每次治療結(jié)束后，抽盡導(dǎo)管氣囊空氣，收回射頻電極，將導(dǎo)管插入胃腔，旋轉(zhuǎn)45°，再次置于治療層面，進(jìn)行第2次治療。每只動(dòng)物治療24個(gè)點(diǎn)。（5）待實(shí)驗(yàn)結(jié)束后切取所有動(dòng)物食管下段、齒狀線上3 cm食管組織常規(guī)固定、取材，石蠟包埋。

1.4 病理學(xué)觀察將標(biāo)本行連續(xù)的5μm切片，常規(guī)脫蠟并行HE染色，光鏡下觀察，按新悉尼系統(tǒng)病理積分將不同的炎癥反應(yīng)、組織結(jié)構(gòu)變性分為0～3分，共計(jì)15分。

1.5 神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)采用免疫組化SP法。所取標(biāo)本均經(jīng)10％中性福爾馬林固定，石蠟包埋，經(jīng)5μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟至水化，微波法抗原修復(fù)，3％過(guò)氧化氫孵育10 min滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，依次滴加正常山羊血清工作液封閉，滴加一抗工作液，滴加生物素化二抗工作液，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉素卵白素工作液，DAB顯色，蘇木素液復(fù)染，脫水、透明、封片。細(xì)胞膜、漿或細(xì)胞間隙呈棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞。半定量法結(jié)果判定：在400倍光鏡下隨機(jī)讀取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)每視野表皮100個(gè)有核細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取其平均數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法,2組獨(dú)立樣本的比較用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 病理學(xué)表現(xiàn)及積分比較Sham組接近正常組織，RFT+24 h組表面鱗狀上皮、固有層及部分黏液腺結(jié)構(gòu)缺損，中性粒細(xì)胞和部分淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)食管壁全層，黏膜出現(xiàn)不同程度的以急性為主的炎癥反應(yīng)和結(jié)構(gòu)破壞，RFT+3 m組可見(jiàn)伴有慢性炎性反應(yīng)的結(jié)構(gòu)重構(gòu)，主要表現(xiàn)為表面鱗狀上皮輕度增厚，固有層增厚，纖維結(jié)締組織增生，膠原變性，慢性炎細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖1。Sham組、RFT+24 h、RFT+3 m病理積分依次為1.00±0.31、3.00±0.31、6.20±0.66，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=32.250，P＜0.01），RFT+24 h組高于Sham組，RFT+3 m組高于RFT+24 h組（均P＜0.05）。

2.2Sham組和RFT+3 m組ChAT、VIP和NOS表達(dá)情況的比較與Sham組相比，RFT+3 m組ChAT的表達(dá)升高，VIP和NOS的表達(dá)下降（均P＜0.01），見(jiàn)圖2，表1。

Tab.1 Comparison of ChAT，VIP and NOS at LES between three groups表1 LES處Sham組和RFT+3 m組ChAT、VIP、NOS表達(dá)情況的比較（n=5,個(gè)/HP）

3 討論

射頻治療已廣泛應(yīng)用于臨床治療[2]。當(dāng)射頻電流經(jīng)過(guò)人體組織時(shí),因電阻損耗而轉(zhuǎn)化為熱能，使病變部位升溫，細(xì)胞內(nèi)外水分蒸發(fā)、干燥、固縮以至無(wú)菌壞死，從而達(dá)到治療目的。文獻(xiàn)報(bào)道射頻方法治療GERD的主要機(jī)制分為兩種[3]。第一，通過(guò)熱能引起LES的破壞、再生,誘導(dǎo)膠原組織收縮、重構(gòu)，從而增加LES厚度和壓力，增加抗反流屏障；第二，射頻治療能破壞食管肌層內(nèi)迷走神經(jīng)節(jié)，阻斷tLESR。本研究顯示射頻治療可引起LES的表面鱗狀上皮輕度增厚、固有層增厚、纖維結(jié)締組織增生、膠原變性以及慢性炎細(xì)胞浸潤(rùn)等變化，進(jìn)一步印證了射頻治療能夠通過(guò)增加LES的厚度和壓力來(lái)發(fā)揮抗反流屏障的作用。

然而，對(duì)于射頻治療可造成LES處的迷走神經(jīng)損傷，減少tLESR[4]這一說(shuō)法尚無(wú)明確的科學(xué)根據(jù)。有文獻(xiàn)報(bào)道，tLESR是由迷走-迷走神經(jīng)反射介導(dǎo)的[5]，而吞咽時(shí)誘發(fā)的LES松弛、胃張力減低和容受性舒張均是由迷走神經(jīng)介導(dǎo)的。又有文獻(xiàn)推測(cè)，胃擴(kuò)張誘發(fā)tLESR的神經(jīng)傳遞途徑為:胃壓力感受器→迷走神經(jīng)→孤束核→迷走神經(jīng)背核→迷走神經(jīng)→LES[6-7]。因此，從以上文獻(xiàn)可以推測(cè)，迷走神經(jīng)功能紊亂和tLESR增多是GERD發(fā)生的重要機(jī)制。

乙酰膽堿(Ach)是控制LES收縮的最主要的神經(jīng)遞質(zhì)[8]。近年來(lái)，免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的發(fā)展使人們能利用Ach的合成酶—ChAT來(lái)檢測(cè)和顯示組織中存在的Ach[9]；一氧化氮(NO)是胃腸道包括LES最主要的抑制性非膽堿能非腎上腺素能(NANC)神經(jīng)遞質(zhì)[10]，可通過(guò)激活蛋白激酶G(PKG)引起平滑肌的舒張[11]；VIP具有強(qiáng)烈的擴(kuò)張周?chē)皟?nèi)臟血管的作用，作為NANC神經(jīng)的主要遞質(zhì)，在消化道廣泛存在，對(duì)消化道運(yùn)動(dòng)起抑制性調(diào)節(jié)作用，VIP抗體能阻斷電刺激和迷走反射所引起的平滑肌收縮[12]。

本研究結(jié)果顯示，對(duì)狗LES處進(jìn)行RFT治療并飼養(yǎng)3個(gè)月后可造成ChAT增多，VIP和NOS減少，由此推測(cè)：臨床應(yīng)用RFT治療GERD，能夠刺激食管肌層內(nèi)迷走神經(jīng)節(jié),分別引起Ach釋放增多和VIP、NO的釋放減少，從而調(diào)整其功能紊亂，阻斷或減少tLESR，使GERD得以控制。

本次實(shí)驗(yàn)并未觀察RFT+24 h組ChAT、VIP和NOS的表達(dá)情況，因而不了解RFT后急性期神經(jīng)遞質(zhì)的表達(dá)變化，將會(huì)在后續(xù)研究中將此項(xiàng)內(nèi)容列入觀察范圍?？傊槍?duì)RFT通過(guò)調(diào)節(jié)迷走神經(jīng)功能紊亂來(lái)治療胃食管反流病的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

Fig.1 Pathological features of LES under light microscopy（HE,×100）圖1 各組病理切片LES光鏡下表現(xiàn)（HE,×100）

Fig.2 Expressions of ChAT，VIP and NOS at LES in two groups（SP，×400）圖2 LES處Sham組和RFT+3 m組ChAT、VIP、NOS的表達(dá)（SP，×400）

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（2013-10-21收稿2014-01-03修回）

（本文編輯李國(guó)琪）

Study on Pathology and Neurotransmitters of Esophageal Sphincter after Radiofrequency Thermocoagulation in Dogs

ZHOU Xiaodan1,WANG Hongtao1,LIU Yibin1，WANG Zhonggao2
1Department of Gastroenterology,The Fourth Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Henan 450000,China; 2Gastroesophageal Reflux Disease Center,The Second Artillery General Hospital
WANG Hongtao,E-mail:wht1962@yeah.net

ObjectiveTo investigate the effects of radiofrequency thermocoagulation(RFT)on pathological features and the expressions of choline acetyltransferase(ChAT),vasoactive intestinal peptide(VIP)and nitric oxide synthase(NOS) at lower esophageal sphincter(LES)in family dogs.MethodsA total of 15 dogs were randomly divided into three groups. Sham group underwent gastroscopy and was fed for 3 months(n=5).Dogs were given RFT and were fed for 24 h after RFT(n= 5,RFT+24 h group).Dogs were given RFT and were fed for 3 months after RFT(n=5,RFT+3m group).The pathological changes of LES were observed after HE staining in three groups.The expressions of ChAT,VIP and NOS were detected by immunohistochemical method in three groups.ResultsResultsof HE staining showed nearly the same tissues in Sham group and control group.There were active inflammatory reaction and structural damage in RFT+24 h group.The chronic inflammatory reaction and structural remodeling were found in RFT+3m group.Immunohistochemistry showed that ChAT was significantly increased in RFT+3m group compare than that of Sham group.Values of VIP and NOS were significantly decreased in RFT+3m group compare than that of Sham group(P＜0.01).ConclusionThe thickness and increased pressure of LES were found after RFT，which also caused changes in neurotransmitters of local tissues in dogs.

gastroesophageal reflux;esophageal sphincter,lower;choline O-acetyltransferase;vasoactive intestinal peptide;nitric oxide synthase;dogs;radiofrequency thermocoagulation;lower esophageal sphincter;choline acetyltransferase

R571

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.07.011

1鄭州大學(xué)第四附屬醫(yī)院消化內(nèi)科（郵編450000）；2第二炮兵總醫(yī)院胃食管反流病中心

△通訊作者E-mail:wht1962@yeah.net