一種簡(jiǎn)單的甜瓜白粉茵單孢子分離方法

郭麗霞 張永兵 李寐華 張學(xué)軍

摘要：為了建立一種新的甜瓜白粉病病原菌單孢子分離方法，采用眉毛挑針挑取法，即在實(shí)體解剖鏡下，在水瓊脂培養(yǎng)基上直接挑取單個(gè)孢子進(jìn)行活體分離純培養(yǎng).結(jié)果表明，此方法簡(jiǎn)單快速、操作方便、易于掌握，非常適用丁孢子較大且活體寄生的病原菌。首次建立了甜瓜白粉病單個(gè)孢子活體分離純培養(yǎng)的方法，為甜瓜白粉病生理小種及相關(guān)育種研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：甜瓜；白粉??；單孢分離

甜瓜（Cucumi.s m.elo L.）為葫蘆科（CuCurbitace-ae）甜瓜屬（Cucumi.s Linn）一年生草本植物，是國(guó)內(nèi)外重要的園藝作物和經(jīng)濟(jì)作物。甜瓜白粉病是一種廣泛發(fā)生的世界性病害，在瓜類作物上均可嚴(yán)重發(fā)牛，甜瓜白粉病可導(dǎo)致植株冠層減少，單株坐果率降低，從而造成減產(chǎn)，且易使果實(shí)變小，導(dǎo)致商品價(jià)值降低，世界各國(guó)都十分重視甜瓜白粉病抗病育種工作。就目前所知，危害瓜類的白粉病菌有3個(gè)屬6個(gè)種，其中最主要的危害來(lái)自甜瓜白粉病瓜單囊殼白粉菌Poclosphaera xanthzi（原稱Sphaerothe-（ca fuliginea）和二孢白粉菌Golovinamyces cichora-cearum（原稱Erysiphc cichoracearum）；瓜類白粉病的生理小種多、分化快，僅單囊殼白粉菌就包含很多生理小種，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的有11個(gè)生理小種，分別是小種0、1、2U.S、2France、3、4、5、Nl、N2、N3和N4；二孢白粉菌有2個(gè)生理小種，分別是小種0和。甜瓜白粉病是一種專性活體寄生菌，不能在人工培養(yǎng)基上分離培養(yǎng)，只能活體保存 至今還沒(méi)有關(guān)于甜瓜白粉病單孢子分離的研究報(bào)告，日.傳統(tǒng)保存方法不嚴(yán)謹(jǐn)，一般僅可保存菌種1個(gè)月，還容易造成小種交叉污染，這對(duì)生理小種眾多的甜瓜白粉病研究及抗病育種來(lái)說(shuō)無(wú)疑是致命的，因而探索出一種合適的甜瓜白粉病菌單孢子分離方法，對(duì)病原菌長(zhǎng)期保存、病原菌問(wèn)互作及遺傳多樣性分析和分子標(biāo)記輔助育種等至關(guān)重要。本文在借鑒前人在其他病原菌單孢分離的基礎(chǔ)上，采用眉毛挑針挑取法獲得了甜瓜白粉病單孢分離的純培養(yǎng)，

l 材料與方法

1.1材料

新鮮的白粉菌，解剖鏡，眉毛，牙簽若干，透明膠布一卷，剪刀，解剖刀，解剖針，鑷子，培養(yǎng)皿，吸水紙，移液器，記號(hào)筆，瓊脂粉，甘露醇，苯并咪唑，去離子水，75%乙醇（后同），硫酸霉素。供試甜瓜品種為‘伽師瓜。

1.2方法

1.2.1 水瓊脂（WA）的制備稱取12 g瓊脂粉，加入1 000 mL去離子水，121℃高壓滅菌20min，冷卻到45℃加入醫(yī)用硫酸霉素至終質(zhì)量濃度50μg'mL-1.

1.2.2甘露醇培養(yǎng)基的制備稱取10g甘露醇、9g瓊脂粉、30mg苯并咪唑，加入1000mL去離子水，121℃高壓滅菌20mins，冷卻到45℃加入醫(yī)用硫酸霉素至終質(zhì)量濃度50μg·mL-1。

1.2.3 眉毛挑針的制備拔取眉毛1～2根，用透明膠帶把眉毛粘到牙簽上，再用剪刀剪去前端0.5cm長(zhǎng)度，注意，一定要用剪刀剪去眉毛前端，有利挑取分生孢子一

1.2.4 白粉病菌單孢子挑取方法營(yíng)養(yǎng)缽中播種‘伽師瓜種子，室溫育苗?！煿厦玳L(zhǎng)出后的6～10d，田間采集白粉病葉，放在冰盒中，帶回實(shí)驗(yàn)室處理.葉表面噴撒無(wú)菌水，4℃冰箱中過(guò)夜。將實(shí)驗(yàn)需要的材料放在無(wú)菌操作臺(tái)中，紫外燈滅菌。然后把帶有白粉病菌葉片在超凈工作臺(tái)邊緣用洗耳球吹入水瓊脂平板上，蓋上蓋，放解剖鏡下；取若干‘伽師瓜苗子葉，用75%的乙醇表面消毒.子葉吹十后，放入甘露醇培養(yǎng)基中；調(diào)整目鏡和物鏡距離，直到找到無(wú)色透明的白粉病菌孢子，眉毛挑針挑取單個(gè)白粉病菌分生孢子放在子葉上面，標(biāo)記日期及實(shí)驗(yàn)內(nèi)容二放入培養(yǎng)箱，白天22℃，夜晚18℃，12h光周期培養(yǎng)。7d以后開(kāi)始觀察，記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

如圖1所示，菌落單一，生長(zhǎng)良好，已經(jīng)獲得白粉菌單孢子純培養(yǎng)。培養(yǎng)7d（圖1-A）病原菌已經(jīng)侵染顯現(xiàn)出病癥；培養(yǎng)10d病原菌緩慢生長(zhǎng)，孢子堆逐漸變大（圖l-B）；培養(yǎng)14d病原菌生長(zhǎng)快速，已近開(kāi)始影響子葉，子葉開(kāi)始變黃（圖1-C）。

3 討論與結(jié)論

關(guān)于病原菌單孢子分離培養(yǎng)的研究取得了一定進(jìn)展，但是主要是集中在其他作物上的能在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)的一些病原菌。孫廣宇等針對(duì)黑粉菌的病原菌鏈隔孢在解剖鏡下進(jìn)行單孢子分離取得了很好的效果；林代福用眉毛挑針?lè)▽?duì)水稻稻瘟病單孢子分離簡(jiǎn)單、易行、無(wú)污染；張昊等用平板稀釋劃線法解決了體積小、顏色淡等鐮刀菌類型的單孢子分離技術(shù)。甜瓜白粉病是活體寄生，病原菌單孢子分離技術(shù)一直處于空白，本文首次報(bào)道了甜瓜白粉菌單孢子分離方法，方法簡(jiǎn)單易行，準(zhǔn)確無(wú)誤。

由于甜瓜白粉菌單孢子眉毛挑針?lè)蛛x方法是把分生孢子吹到水瓊脂上迸行挑取，很難保證每次挑取的單孢子都具有活性，需要挑取大量的單孢子，工作量相應(yīng)會(huì)增加，如何能夠保證每次都能挑取有活力的白粉菌分生孢子需要進(jìn)一步研究。

甜瓜白粉病菌單孢子分離的成功運(yùn)用對(duì)今后甜瓜白粉病菌毒性變異及寄主病原互作的各類相關(guān)研究、病原菌遺傳多樣性分析、甜瓜抗病育種分子標(biāo)記、聚合育種及甜瓜抗性基因定位、克隆等研究具有重大意義，同時(shí)該方法對(duì)其他作物白粉病單孢子分離具有借鑒指導(dǎo)意義。