斑馬魚TATA結(jié)合蛋白的生物信息學(xué)分析

楊少斌 馮婧文 趙文鋮 王兆松 許世磊

摘要：斑馬魚TATA結(jié)合蛋白（TBP）是轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的重要起始因子。利用生物信息學(xué)方法對(duì)斑馬魚TBP的理化性質(zhì)、物種間同源性、保守結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)、親水性/疏水性，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)相互作用進(jìn)行預(yù)測(cè)分析 分析表明，斑馬魚TBP全長(zhǎng)302個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)9.8，屬于TATA結(jié)合蛋白超家族，不含跨膜區(qū).屬于親水蛋白；二級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)則卷曲為主，含5個(gè)α螺旋區(qū)和8個(gè)β折疊區(qū)，三維建?？臻g結(jié)構(gòu)可信度98.9%，進(jìn)一步分析建模結(jié)果可靠：與斑馬魚TBP相互作用的蛋白質(zhì)均為轉(zhuǎn)錄因子或TFⅡD復(fù)合物組分。分析結(jié)果對(duì)于深入研究斑馬魚TBP在基因轉(zhuǎn)錄中的作用具有一定的理論指導(dǎo)意義。關(guān)鍵詞：斑馬魚；TATA結(jié)合蛋白；生物信息學(xué)中圖分類號(hào)：Q811.4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-7847（2015）02-0119-05Bioinformatic Analysis of TATA-binding Protein of ZebrafishYANG Shao-bin， FENG Jing-wen， ZHAO Wen-cheng， WANG Zhao-song， XU Shi-lei*（Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital， National Clinical Research Center for Cancer， Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy， Tianjin 300060， China）Abstract ： TATA-binding protein （TBP） is important in the process of transcription initiation in zebrafish. By means of bioinformatic methods， TBP of zebrafish is illustrated and analyzed by physicochemical property， sequence homology among different species， conserved domains， transmembrane structures， hydrophilici ty/hydrophobicity， protein secondary structure， protein tertiary structure， as well as protein-protein interactions. The results showed that zebrafish TBP consists of 302 amino acids， with isoelectric point of 9.8. This protein belongs to the TBP superfamily without transmembrane structure， and it is a hydrophilic protein. The secondary structure analysis showed that it contained 5 a. helices and 8 f3 sheets and random coil was the major structure element. The reliability of predicted three-dimensional structure of zebrafish TBP was up to 98.9%. Further analysis proved that the predicted protein structure was stable. It showed that the 10 most relevant interaction proteins with the zebrafish TBP were all transcription factors or TF II D complex members. Therefore， the results provided great information about zebrafish TBP in transcription regulation for further research.Key words： zebrafish； TATA-binding protein； bioinformatics（Life Science Research， 2015，19（2）： 119?123）

TATA結(jié)合蛋白（TATA-binding protein，TBP）址一種特異性結(jié)合DNA序列上TATA框的轉(zhuǎn)錄因子。TATA序列存在于真核細(xì)胞基因啟動(dòng)子中轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游30個(gè)bp左右[1]。TBP與其他一些TBP相關(guān)蛋白共同組成廠TFⅡD復(fù)合物，TFⅡD是一種常見(jiàn)的轉(zhuǎn)錄因子，它是RNA聚合酶Ⅱ起始復(fù)合體的組成部分。TBP能夠幫助RNA聚合酶Ⅱ跨過(guò)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。TBP在DNA雙鏈解鏈（double strand separation）的過(guò)程中也起到一定的作用，這是通過(guò)其能夠使DNA彎曲80°來(lái)實(shí)現(xiàn)[2-4]。TBP的另一個(gè)特點(diǎn)是含有一長(zhǎng)串谷氨酰胺氨基酸殘基。這個(gè)區(qū)域調(diào)節(jié)TBP的C端和DNA的結(jié)合能力、轉(zhuǎn)錄復(fù)合體形成的比率以及轉(zhuǎn)錄的起始。斑馬魚屬于鯉科，鯉目。由于再生能力強(qiáng)的特性，斑馬魚經(jīng)常被當(dāng)作研究脊椎動(dòng)物的生物模型[5]。分析研究斑馬魚TBP有助于更好地理解斑馬魚基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程。到目前為止，對(duì)斑馬魚TBP的生物學(xué)研究已經(jīng)有一定的進(jìn)展，但是對(duì)其生物信息學(xué)分析還未見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究采用生物信息學(xué)方法，對(duì)斑馬魚TBP的理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)、親水性/疏水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、與其他物種親緣關(guān)系等進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，為其后續(xù)研究奠定全面的理論基礎(chǔ)。1材料與方法1.1材料數(shù)據(jù)資料來(lái)源于UniProt網(wǎng)站已經(jīng)注冊(cè)的TBP氨基酸序列。其中TBP：斑馬魚zebrafish（Q7SXL3）、非洲爪蛙Xenopus laevis（ P27633）、小鼠Mouse（ P29037）、牛Bos taurus （Q2HJ52）、人Human（ P20226）。1.2方法利用ProtParam分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)；蛋白序列同源性、多序列比對(duì)及序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分別由NCBI protein blast .ClustalX2.0、njplot等軟件實(shí)現(xiàn)；利用TMHMM、ProtScale分析蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)和疏水性；NCBI Conserved Domains數(shù)據(jù)庫(kù)用來(lái)分析保守區(qū)域；Jpred、Swiss-Model和Structural Analysis and Verification Server分別預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)及其合理性。String則用來(lái)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的相互作用。各軟件、數(shù)據(jù)庫(kù)的相關(guān)信息如表1。2結(jié)果與分析2.1斑馬魚TBP的理化性質(zhì)預(yù)測(cè)和分析使用ProtParam蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測(cè)網(wǎng)站對(duì)5種TBP進(jìn)行理化性質(zhì)預(yù)測(cè)，得到結(jié)果如表2。結(jié)果顯示，TBP基因在5個(gè)不同物種中編碼的氨基酸個(gè)數(shù)在297～339之間；相對(duì)分子質(zhì)量在32702.8～37698.1之間；各物種TBP等電點(diǎn)差異其微，均在9.8附近，說(shuō)明TBP是堿性蛋白質(zhì)；TBP在5個(gè)物種中的半衰期均達(dá)到了30h；5種蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)均大于40，表明它們不是穩(wěn)定蛋白；各TBP的脂肪族系數(shù)在76.58～88.65之間；5種蛋白的平均疏水性均為負(fù)值，表明它們都是親水蛋白質(zhì)。2.2斑馬魚TBP的同源性預(yù)測(cè)和分析

使用Protein Blast軟件對(duì)斑馬魚TBP進(jìn)行同源性分析，數(shù)據(jù)顯示，非洲爪蛙、小鼠、牛、人TBP與斑馬魚TBP進(jìn)行比較時(shí)，比對(duì)序列覆蓋范圍（Query cover）分別是100%、100%、100%、75%；在此基礎(chǔ)上的序列相似性（Identity）分別為88%、86%、85%、93%，；利用ClustalX2.1程序?qū)Π唏R魚TBP與非洲爪蛙、小鼠、牛、人TBP序列進(jìn)行多重比對(duì)，發(fā)現(xiàn)各物種問(wèn)多聚谷氨酰胺區(qū)如圖1。結(jié)果顯示，由低等物種到高等物種，TBP多聚谷氨酰胺區(qū)谷氨酰胺氨基酸殘基數(shù)量在進(jìn)化過(guò)程中不斷增加，推測(cè)谷氨酰胺區(qū)的長(zhǎng)度與TBP的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)能力呈正相關(guān)。

同時(shí)在斑馬魚、非洲爪蛙、小鼠、牛、人的TBP比對(duì)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)一個(gè)長(zhǎng)保守區(qū)，該保守區(qū)位于斑馬魚TBP肽鏈的C端（114-281aa），其序列為：PATPASESSGIVPQLQNIVSTVNLGCKLDLKTIALRARNAEYNPKRFAAVIMRIREPRTTALIFSSGKMVCTGAKSEEQSRLAARKYARVVQKLGFPAKFLDFKIQNMVGSCDVKFPIRLEGLVLTHQQFSSYEPELFPGLIYRMIKPRIVLLIFVSGKVVLTGAKVR。使用njplot軟件對(duì)Clusta1X2.1比對(duì)結(jié)果產(chǎn)生的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行可視化分析，結(jié)果如圖2。結(jié)果顯示小鼠、牛、人之間進(jìn)化距離小于0.012，它們與非洲爪蛙和斑馬魚的進(jìn)化距離分別為0.043和0.049。2.3斑馬魚TBP保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)和分析使用NCBI提供的蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析數(shù)據(jù)庫(kù)（Conserved domains database）對(duì)斑馬魚TBP進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果如圖3。結(jié)果表明斑馬魚TBP屬于TATA結(jié)合蛋白超家族，只含有一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域（125-298aa），此結(jié)構(gòu)域用于識(shí)別轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)DNA的TATA框，并且此保守結(jié)構(gòu)域與ClustalX2.1分析得到的保守區(qū)位置基本一致（114-281aa）。2.4斑馬魚TBP跨膜區(qū)預(yù)測(cè)和分析使用在線蛋白質(zhì)跨膜區(qū)分析工具TMHMM軟件對(duì)斑馬魚TBP進(jìn)行跨膜區(qū)分析（圖4） 結(jié)果顯示，斑馬魚TBP不含跨膜區(qū)，說(shuō)明斑馬魚TBP不是跨膜蛋白質(zhì)。TBP蛋白家族是在DNA轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程中發(fā)揮作用，屬于細(xì)胞核定位，而非膜蛋白，預(yù)測(cè)結(jié)果與這一描述相符。2.5斑馬魚TBP親水性/疏水性預(yù)測(cè)和分析利用蛋白質(zhì)親水性/疏水性在線預(yù)測(cè)工具ProtScale對(duì)斑馬魚TBP進(jìn)行親水性/疏水性分析（圖5）。結(jié)果顯示，斑馬魚TBP親水性最強(qiáng)位點(diǎn)出現(xiàn)在57、58、59三個(gè)連續(xù)的位點(diǎn)，分值為-3.611，這3個(gè)位點(diǎn)的氨基酸分別是精氨酸（Arginine，R）、谷氨酰胺（Glutamine，Q）、谷氨酰胺（Glutamine，Q）；斑馬魚TBP疏水性最強(qiáng)位點(diǎn)出現(xiàn)存267位，分值為2.956，這個(gè)位置的氨基酸是異亮氨酸（Isoleucine，I）。ProtParam對(duì)斑馬魚TBP的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示其平均疏水性（GRAVY）為-0.177，ProtScale的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示斑馬魚TBP的泉水肽鏈分布在整個(gè)氨基酸序列中，且明顯多于疏水肽鏈，兩個(gè)預(yù)測(cè)結(jié)果均證明TBp是親水蛋白質(zhì)，是一種水溶性蛋白質(zhì)：2.6斑馬魚TBP二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和分析

Jpred由Barton Group創(chuàng)建于1998年，現(xiàn)在版本為3.0。Jpred采用Jnnet神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法來(lái)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，平均準(zhǔn)確率大于81% 使用Jpred3在線預(yù)測(cè)軟件對(duì)斑馬魚TBP的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖6。結(jié)果顯示，斑馬魚TBP含有5個(gè)α螺旋區(qū)和8個(gè)β折疊區(qū)。α螺旋區(qū)和β折疊區(qū)氨基酸比率分別占到19.2%e和19.8%，說(shuō)明斑馬魚TBP絕大部分氨基酸（71.0%）處于無(wú)規(guī)則卷曲狀態(tài)。2.7斑馬魚TBP三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和分析蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析對(duì)了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能之間的相關(guān)性至關(guān)重要，也對(duì)理解該蛋白質(zhì)與其他分子的相互作用機(jī)理及位點(diǎn)大有幫助。Swiss-Model是一款采用同源建模的方法預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的在線軟件，此外它還能夠預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)電荷分布、原子間距離和角度等。將斑馬魚TBP的氨基酸序列提交到Swiss-Model，網(wǎng)站給出了3個(gè)預(yù)測(cè)結(jié)果，結(jié)果如圖7。結(jié)果顯示A、B、C3個(gè)結(jié)果之間的差異非常微小，與模型蛋白比對(duì)覆蓋率A～C依次為分別為98.90%，98.90%，97.83%。分析斑馬魚TBP氨基酸序列與同源建模蛋白相似性波形圖，結(jié)果顯示，預(yù)測(cè)結(jié)果A的波形更加穩(wěn)定并趨近于最高值。表明預(yù)測(cè)模型A更趨近于真實(shí)情況。為了進(jìn)一步驗(yàn)證模型A的可靠性，采用拉曼圖（Ramachandranplot）的方法分析A模型中蛋白質(zhì)各氨基酸殘基二面角角和$角的合理性。使用美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（NIH）提供的拉曼圖分析網(wǎng)站StructuralAnalysisandVerificationServer對(duì)模型A進(jìn)行拉曼圖分析，結(jié)果如圖8。結(jié)果顯示，預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)殘基二面角位于黃色核心區(qū)域，表明該蛋白空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，所以Swiss-Model的預(yù)測(cè)結(jié)果A可靠。2.8斑馬魚TBP相互作用蛋白預(yù)測(cè)和分析使用Strmg蛋白質(zhì)相互作用預(yù)測(cè)網(wǎng)站對(duì)斑馬魚TBP進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖9。與斑馬魚TBP相互作用最緊密的10個(gè)蛋白質(zhì)及預(yù)測(cè)結(jié)果得分（可靠性）見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，與與斑馬魚TBP相互作用最緊密的10個(gè)蛋白質(zhì)均為DNA轉(zhuǎn)錄因子[6-8]或TFⅡD的組成部分[9-12]，這與斑馬魚TBP參與轉(zhuǎn)錄起始的事實(shí)相符合。3討論TBP蛋白主要在DNA轉(zhuǎn)錄的起始階段發(fā)揮作用，一方面它幫助DNA雙鏈解旋，另一方面它結(jié)合到TATA框，并與后續(xù)轉(zhuǎn)錄因子相互作用形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，由于斑馬魚身體透明、繁殖能力強(qiáng)、養(yǎng)殖費(fèi)用低等特點(diǎn)，斑馬魚被認(rèn)定為是研究脊椎動(dòng)物的理想生物模型。本研究主要從生物信息學(xué)角度解析了斑馬魚TBP的部分信息。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚TBP全長(zhǎng)302個(gè)氨基酸，屬于TATA結(jié)合蛋白超家族，不含跨膜區(qū)。其N端保守性相對(duì)較低，氨基酸序列在各物種之間變化明顯，在靠近N端的位置存在一個(gè)多聚谷氨酰胺重復(fù)區(qū)，能夠調(diào)節(jié)C端保守區(qū)域結(jié)合DNA的能力，這種對(duì)自身與DNA結(jié)合能力的調(diào)節(jié)能夠影響轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成，并目.多聚谷氨酰胺區(qū)谷氨酰胺的數(shù)量增加脊髓小腦的共濟(jì)失調(diào)等疾病相關(guān)113]；在不同物種間，多聚谷氨酰胺區(qū)的長(zhǎng)度不同，其基本規(guī)律遵循由低等動(dòng)物到高等動(dòng)物多聚谷氨酰胺區(qū)不斷增長(zhǎng)的特點(diǎn)斑馬魚TBP的C端保守性較高，它含有兩個(gè)長(zhǎng)77個(gè)氨基酸的重復(fù)序列，組成一個(gè)馬鞍狀維結(jié)構(gòu)跨坐在DNA鏈上，這個(gè)區(qū)域與DNA相互作用并結(jié)合其他轉(zhuǎn)錄因子，突變將導(dǎo)致其對(duì)轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)能力的喪失114]。數(shù)據(jù)顯示，斑馬魚TBP與DNA相互作用的保守區(qū)（114-281aa）堿性氨基酸（精氨酸+賴氨酸）數(shù)量高達(dá)26個(gè)，而酸性氨基酸（谷氨酸+天冬氨酸）數(shù)量只有11個(gè)，這種特點(diǎn)可能促進(jìn)其自身與DNA鏈酸性核苷酸的結(jié)合有關(guān)，具體作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。分析斑馬魚TBP的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，兩種分析結(jié)果中a螺旋和yS折疊的數(shù)量及出現(xiàn)位置基本一致，拉曼圖分析進(jìn)一步驗(yàn)證了三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型的穩(wěn)定性，說(shuō)明建模結(jié)果可靠，分析結(jié)果有助于闡明斑馬魚TBP與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用的空間結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)「在斑馬魚TBP與其他蛋白的相互作用結(jié)果中，研究發(fā)現(xiàn)與斑馬魚TBP相互作用的蛋均為轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物和轉(zhuǎn)錄因子，其預(yù)測(cè)結(jié)果全部有文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫(kù)兩方面的證據(jù)，結(jié)果真實(shí)可靠：本研究的分析結(jié)果對(duì)于深入研究斑馬魚TBP在轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程中的作用具有一定的指導(dǎo)意義。參考文獻(xiàn)（References）：[1J KORNBERG R D. 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