三個(gè)擬南芥NAC同源基因突變體的ABA響應(yīng)及下游基因表達(dá)分析

盧嘉寶 李曉云 劉旭 李曉玲 李逸豪 李玲

摘要：在獲得擬南芥NAC同源基因（NAC019、NAC055和/VAC072）雙突變體和三突變體純系的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析它們對(duì)ABA響應(yīng)的生理差異及其ABA誘導(dǎo)相關(guān)下游基因的表達(dá)變化，深入探討它們與ABA響應(yīng)的關(guān)系。結(jié)果表明，在種子綠胚建成的過程中，NAC055和NAC072基因與ABA響應(yīng)相關(guān)；在根生長(zhǎng)方面，三者在ABA響應(yīng)中作用不明顯。經(jīng)ABA處理后，突變體nac072和nac055n，cac072與野生型比較，RAB18、RD29A和RD29B基因表達(dá)上調(diào)顯著，推測(cè)在ABA響應(yīng)的基因表達(dá)調(diào)控過程中，MC072和NAC055起負(fù)調(diào)控協(xié)同作用，而NAC019則發(fā)揮拮抗作用。關(guān)鍵詞：NAC；擬南芥；突變體；ABA響應(yīng)中圖分類號(hào)：Q786

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-7847（2015）02-0114-05Study on the Response to Applying ABA and Expression Changes of ABA Induced Relative Genes in Arabidopsis Mutants of Three NAC Homologous GenesLU Jia-bao1， LI Xiao-yun1*， LIU Xu2， LI Xiao-lin1， LI Yi-hao1， LI Ling1College of Life Science，South China Normal University， Guangzhou 510631， Guangdong， China； 2. South China Botanical Garden， Chinese Academy of Science， Guangzhou 510650， Guangdong， China）Abstract ： The double and triple mutants of three Arabidopsis NAC homologous genes （NA CO 19， A^4 C055 and NA C072） have been obtained previously. To reveal the relationship between the NAC genes and ABA response， the response to ABA and downstream genes were further analyzed in NAC mutants. In the process of seed cotyledon greening， the NA C055 and NA C072 genes were found associated with ABA response. In terms of seedling root elongation， three NAC genes were seen not associated with the ABA response. Compared with the wild type， the gene expression of RABIS， RD29A and RD29B increased significantly in nac072 and nac055nac072 mutants after ABA treatment. These results suggested that NA C072 and NA C055 negative regulated synergistically in the process of expression regulation of ABA response genes， whereas NACO 19 antagonized NAC072 and NAC055.（Life Science Research， 2015，19（2）： 114?118）

NAC（ NAM， ATAF，CUC）轉(zhuǎn)錄因子是特異存在于植物中，具有多種生物功能的一類新型轉(zhuǎn)錄因子。NAC轉(zhuǎn)錄因子的N端含有高度保守的NAC結(jié)構(gòu)域，用于結(jié)合DNA，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性，C端是高度變異轉(zhuǎn)錄激活區(qū)[1]。NAC轉(zhuǎn)錄因子具有諸多方面的功能，如參與植物次生生長(zhǎng)、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，以及在與生物脅迫和非生物逆境中發(fā)揮作用[2，3]。從擬南芥中分離到3個(gè)不同的NAC基因NAC019、NAC055和NAC072，干旱誘導(dǎo)其表達(dá)，能與NACRE（NAC response elements）的核心元件CACC和MYC-Like元件CATCT的DNA體外結(jié)合[4]。NAC072被報(bào)道參與ABA介導(dǎo)的逆境信號(hào)傳導(dǎo)途徑，超量表達(dá)顯著增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株ABA敏感性，瞬時(shí)表達(dá)激活多CACC元件啟動(dòng)子活性[5]。NAC019在ABA信號(hào)傳導(dǎo)中也起正向的調(diào)節(jié)作用[6]；NAC019和NAC055在JA和ABA的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之間存在交叉對(duì)話[7]。擬南芥NAC072（RD26），NAC019和NAC055編碼蛋白氨基酸序列同源性高，且其表達(dá)模式和遺傳功能類似。目前這3個(gè)脅迫相關(guān)NAC亞類基因之間關(guān)系不清楚。本文構(gòu)建突變株NAC019、NAC055、NAC072的雙突變和三突變植株，通過不同突變植株的ABA生理響應(yīng)和ABA信號(hào)途徑相關(guān)基因表達(dá)變化，分析三者之間的功能關(guān)系及其參與ABA信號(hào)的可能角色。為揭示ABA介導(dǎo)下，NAC轉(zhuǎn)錄因子與ABA信號(hào)的關(guān)系，及認(rèn)識(shí)ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中轉(zhuǎn)錄因子可能的調(diào)節(jié)機(jī)制提供依據(jù)。1材料與方法1.1植物材料野生型擬南芥Col由實(shí)驗(yàn)室保存，純種單基因突變體nac055、nac019和nac072種子購(gòu)于擬南芥資源中心（Arabidopsis Biological Resource Center），由本實(shí)驗(yàn)室篩選與保存。1.2方法1.2.1植物培養(yǎng)擬南芥種子用75%的乙醇溶液（含0.5% TritonX-100）浸泡2min，用無水乙醇快速漂洗后，撒到1/2MS培養(yǎng)基上。4℃放置2d，然后在光照培養(yǎng)箱中（晝夜溫度為22℃/20℃，光照周期為16h/8h，平均濕度為40%～60%）培養(yǎng)6d。將其移栽到由泥炭土、珍珠巖按3：1（V/V）比例拌勻的培養(yǎng)土中培養(yǎng)。培養(yǎng)土預(yù)先用營(yíng)養(yǎng)液（1/4MS）澆透待用。用鑷子將幼苗移栽到濕潤(rùn)的土上，蓋上一層保鮮膜，培養(yǎng)2-3d幼苗，揭開保鮮膜。在植株抽苔及抽苔后1-2周，以1/4MS營(yíng)養(yǎng)液澆透培養(yǎng)土。培養(yǎng)過程中視情況適當(dāng)澆水。1.2.2擬南芥突變體雜交按照表l，分別將開花的突變體（作為父本）與未開花且雄蕊未成熟的突變體（作為母本）雜交，經(jīng)兩次種植分離并PCR鑒定后，獲得nac019nac055、nac019nac072和nac055nac072雙雜交純合體。同理，將開花的nac072與未開花且雄蕊未成熟的擬南芥nac019nac055進(jìn)行雜交。待莢果成熟后單獨(dú)收種子，經(jīng)3次種植分離并PCR鑒定后，獲得三突變體nac019nac055nac072。1.2.3雜交株鑒定

利用三引物PCR法篩選純合體，RT-PCR分別對(duì)擬南芥突變體（nac055nac072、nac019nac072、nac019nac055和nac019nac055nac072）純合子進(jìn)行基因表達(dá)鑒定。所用的特異性引物組合為：N019-ORF-F和N019-ORF-R，LBal和N019-ORF-R，N055-ORF-F和N055-ORF-R，N055-ORF-F和LBal，RD26-F和RD26-R，RD26-F和LBal（表2）；PCR程序：94℃變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸70s（有LBal時(shí)：70s；若全長(zhǎng)R+F：1 min 40 s），38個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min：1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。1.2.4基因表達(dá)檢測(cè)按照文獻(xiàn)[8]方法從Col和純合文變體植株提取總RNA。用TaKaRa RTase M-MLV反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，參考TaKaRa公司RTase M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑使用說明，利用特異引物（表2），通過PCR和DNA凝膠電泳檢測(cè)相應(yīng)的cDNA。1.2.5種子綠胚統(tǒng)計(jì)種子經(jīng)常規(guī)消毒后，分別點(diǎn)種在含有0.05、1、2μmol/L， ABA的1/2 MS固體培養(yǎng)基上（不含0.8%的蔗糖），放于光照培養(yǎng)箱中4℃春化4d。然后在22℃培養(yǎng)第7d，開始統(tǒng)計(jì)綠胚率，以綠胚長(zhǎng)出綠色子葉為準(zhǔn)。重復(fù)3次。1.2.6根生長(zhǎng)統(tǒng)計(jì)種子消毒后播種于1/2 MS培養(yǎng)基，4℃放置4d后，放于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。長(zhǎng)出兩片子葉（約3d）后，移至分別含有0、15、30 μmol/L ABA的1/2 MS固體培養(yǎng)基上（含0.8%的蔗糖），平板垂直培養(yǎng)7d，測(cè)量幼苗的主根長(zhǎng)度。用SonyF116數(shù)碼相機(jī)拍攝主根的生長(zhǎng)，計(jì)算主根增長(zhǎng)率：主根伸長(zhǎng)率（%）=處理的主根長(zhǎng)/對(duì)照的主根長(zhǎng)×100%。1.2.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)結(jié)果通過Spss 13.0分析。2結(jié)果與分析2.1雜交雙突變體和三突變體的篩選與檢測(cè)通過RT-PCR方法，對(duì)擬南芥野生型Col和NAC突變體nac019、nac055、nac072、nac055nac072、nac019nac072、nac019nac055和nac019nac055nac072進(jìn)行鑒定，根據(jù)突變體植株中不能表達(dá)所缺失的相應(yīng)突變基因，確認(rèn)三者的單基因突變體nac019、nac055、nac072以及三者的雜交突變體nac019nac055、nac055nac072、nac055nac072和nac019nac055nac072（圖1）為純合突變體，可用于進(jìn)行后續(xù)的生理實(shí)驗(yàn)以及基因表達(dá)量的檢測(cè)。2.2NAC突變體的ABA生理響應(yīng)

野生型（對(duì)照）和用0.5 μmol/LABA濃度處理的突變株系的種子在培養(yǎng)7d正常萌發(fā)，經(jīng)1μmol/L和2μmol/LABA處理的種子萌發(fā)7d，大部分缺乏綠胚，沒有出現(xiàn)綠葉（圖2）、經(jīng)0.5μmol/LABA處理后，突變體nac055、nac055nac072、nac019nac055的種子綠胚率比野生型高16%—22%，其中nac055種子的綠胚率最高（圖2），說明NAC055在種子萌發(fā)過程中對(duì)外源ABA響應(yīng)較強(qiáng)，缺失NAC055基因突變體植株（如nac055、nac055nac072、nac019nac055）的ABA敏感性較弱。從ABA處理對(duì)根生長(zhǎng)影響的來看，發(fā)現(xiàn)各突變體對(duì)ABA敏感性均沒有顯著性差異，推測(cè)它們?cè)诟L(zhǎng)對(duì)ABA響應(yīng)中的作用不明顯。2.3NAC突變體的ABA相關(guān)下游基因表達(dá)檢測(cè)RD29A、RAB18、RD29B基因皆是ABA介導(dǎo)的信號(hào)途徑中的重要關(guān)鍵基因。為了認(rèn)識(shí)NAC轉(zhuǎn)錄因子成員參于ABA介導(dǎo)的信號(hào)途徑情況，我們分析ABA處理后的NAC突變體體內(nèi)RD29A、RAB18、RD29B的表達(dá)變化。結(jié)果表明，經(jīng)ABA處理后野生型和NAC突變植株的RD29A、RAB18和RD29B表達(dá)量顯著上調(diào)（圖5）。但在突變體中的3個(gè)基因表達(dá)模式大致相同，即NAC三突變體nac019nac055nac072以及NAC雙突變nac019nac072、nac019nac055植株中RD29A、RAB18和RD29B的誘導(dǎo)表達(dá)與野生型無顯著差異，而單突變體nac072和雙突變體nac055nac072比野生型顯著上升，雙突變體nr055nac072的表達(dá)變化最顯著，推測(cè)NAC072和NAC055在人ABA響應(yīng)下游基因調(diào)控中可能發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)作用，NAC072的作用更大，而NAC019可能拮抗前兩者。3討論

NAC轉(zhuǎn)錄因子是特異性存在于植物中的一類轉(zhuǎn)錄因廣，家族成員多，模式植物擬南芥含有110多個(gè)NAC家族成員，單子葉植物水稻中存在120多個(gè)NAC同源基因[9]。NAC轉(zhuǎn)錄因子在不同發(fā)育時(shí)期和多種環(huán)境因素誘導(dǎo)下，激活特定目的蛋白發(fā)揮著各種重要生物功能，主要涉及對(duì)植物體生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控和環(huán)境脅迫影響[1]。本文的研究結(jié)果表明，nac055、nac055nac072、nac019nac055突變體在0.5μmol/LABA處理后，萌發(fā)率高于野牛型，其中nac055萌發(fā)率最高，如nac055、nac055nac072和nac019nac055突變體ABA敏感性弱。推測(cè)NAC055在種子萌發(fā)過程中對(duì)ABA響應(yīng)發(fā)揮重要作用，缺失NAC055的突變體，已知NAC055擬南芥過表達(dá)植株存在較強(qiáng)的抗旱性，為ABA、鹽和干旱顯著誘導(dǎo)[4]，其可能與NAC019共同作用JA途徑[7]。目前關(guān)于NAC055參與ABA種子萌發(fā)具體機(jī)制并不清楚，與其他兩個(gè)成員相比，可能與其特殊的組織表達(dá)模式和調(diào)控方式相關(guān)，需要進(jìn)一步深入研究。但其單突變體的生理報(bào)道缺乏。ABA處理擬南芥根生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各突變休與野生型相比在ABA敏感性方面均存在顯著差異，說明三者在根生長(zhǎng)的ABA響應(yīng)中不發(fā)揮主要作用。

RD29A、RD29B、RAB18基因是最常選擇的擬南芥脅迫相關(guān)下游Maker基因，它們快速響應(yīng)各種非生物脅迫和ABA的誘導(dǎo)作用[10、11]，反映植物在脅迫條件下基因表達(dá)的響應(yīng)強(qiáng)度。RD29A是不依賴型ABA的相關(guān)下游基因[10]。其在無內(nèi)源ABA時(shí)亦應(yīng)答干旱等非生物脅迫，ABA處理可誘導(dǎo)該基因大量表達(dá)，能快速反應(yīng)脅迫處理的強(qiáng)度；RD29B是經(jīng)典的擬南芥ABA依賴型下游誘導(dǎo)基因，其啟動(dòng)子具有兩個(gè)重要的ABA應(yīng)答順式作用原件ABRE，在無內(nèi)源ABA時(shí)，不能或顯著減弱對(duì)脅迫應(yīng)答的誘導(dǎo)表達(dá)[11]，其表達(dá)差異準(zhǔn)確反應(yīng)ABA信號(hào)的強(qiáng)度，是研究ABA誘導(dǎo)基因表達(dá)的必需下游Maker基因。擬南芥RAB18是富含Gly（33%）的脫水相關(guān)蛋白，ABA處理可以誘導(dǎo)該基因大量表達(dá)[11]一般情況下，ABA處理后RAB18基因表達(dá)變化與RD29A和RD29B變化趨勢(shì)相同，三者共同反成ABA響應(yīng)的下游基因表達(dá)強(qiáng)度。

對(duì)突變體ABA相關(guān)下游基因表達(dá)分析的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比野生型和其他突變體植株，nac055nac072在ABA處理后，RD29A、RD29B和RAB18誘導(dǎo)表達(dá)量上升趨勢(shì)最明顯，而nac072次之，ABA處理下NAC072對(duì)RD29B和RAB18表達(dá)抑制貢獻(xiàn)最大，當(dāng)其與NAC055同時(shí)缺失后，下游基因的誘導(dǎo)上升趨勢(shì)變化最大。這說明NAC072和NAC055可能在對(duì)RD29B和RAB18基因響應(yīng)ABA誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)節(jié)中發(fā)揮協(xié)同作用，對(duì)基因表達(dá)都起抑制作用。已知NAC072（也稱為RD26）參與ABA的信號(hào)途徑，NAC072和NAC055都為ABA誘導(dǎo)顯著上調(diào)，其過表達(dá)擬南芥植株對(duì)ABA超敏感[5]。說明NAC072是一個(gè)ABA信號(hào)正調(diào)控者的角色，但在本研究中，其單雙缺失突變體都表現(xiàn)出對(duì)ABA誘導(dǎo)下游基因的抑制作用，可能預(yù)示著其參與ABA信號(hào)的復(fù)雜形式。另外，NAC三突變體nac019nac055nac072以及雙突變nac019nac072、nac019nac055植株中RD29A、RAB18和RD29B的誘導(dǎo)表達(dá)與野生型無明顯差異，在多突變體影響ABA誘導(dǎo)下游基因表達(dá)中NAC019的作用與NAC072和NAC055相反。其可能拮抗NAC072和NAC055對(duì)ABA誘導(dǎo)下游基因的抑制作用。已知NAC019和NAC055轉(zhuǎn)錄因子在JA信號(hào)途徑中相互協(xié)同[7]，而三者基因的過表達(dá)擬南芥均表現(xiàn)出相同的抗性增強(qiáng)表型[4]，說明三者在脅迫條件下可能發(fā)生基因功能冗余并協(xié)同作用，但也并不排除特定條件下同源蛋白間拮抗作用的發(fā)生，如同源基因間的競(jìng)爭(zhēng)性蛋白互作和DNA結(jié)合等[12]。目前關(guān)于三者如何參ABA下游基因表達(dá)調(diào)控研究還處于起步階段，很多問題懸而未決，還需大量研究證實(shí)。[1]劉旭，李玲.植物NAC轉(zhuǎn)錄因子的研究進(jìn)展[J].生命科學(xué)研究（The research progress of NAC tracscriptipn factors in plant）， 2008， 12（4）： 297-302.[2]LI X L， YANG X， HU Y X，et d. A novel NAC transcription factor from Suaeda liaotungensis K. enhanced transgenic Arabidopsis drought， salt， and cold stress tolerance[J]. Plant Cell Repots， 2014，33（5）： 767-778.[3]LIU X， HONG L， LI X， et al. Improved drought and salt tolerance in transgenic Arabidopsis over-expressing a NAC transcriptional factor from Arcxhis hypogaea L[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry， 2011， 75（3）： 100614-100618.[4]TRAN LSP， NAKASHIMA K， SAKUMA Y， et al. Isolation and functional analysis of Arabidopsis stress-inducible NAC tran-scription factors that bind to a drought-responsive cise lement in the early responsive to dehydration stress 1 promotei[J]. Plant Cell， 2004， 16（9）：2481-2498：[5]FUJITA M， FUJITA Y， MARUYAMA K， et al. A dehydration- induced NAC protein， RD26， is involved in a novel A BA-de-pendent stress-signaling pathway[J]. Plant Journal， 2004，39（6）：863-876.[6]JENSEN M K， KJAERSGAARD T， NIELSEN M M， et al. The Arabidopsis thaliana NAC transcription factor family： structure-function relationships and determinants of AtNAC019 stress signaling[J]. Biochemical Journal，2010，426（2）：183-196.[7]JIANG H， LI H， BU Q， et al. The RHA2a-interacting proteins AtNAC019 and AtNAC055 may play a dual role in regulating ABA response and jasmonate response[J]. Plant Signaling&Be-havior，2009，4（5）：464-466.[8]CHEN Y， LI L ， HU P， et， al. Relationship between drought re-sistance and AhNCED 1 expression in peanut varieties from four provinces in China[J]. Journal of Food， Agriculture&En-vironment，2014，12（2）：509-514.[9]OOKA H， SATHO K， DOI K， et al. Comprehensive analysis of NAC family genes in Oryza saliva and Arabidopsis thaliana[J]. DNA Research，2003，10（6）：239-247.[10]XIONG L， LEE H， ISHITANI M， et al. Regulation of osmotic stress-responsive gene expression by the LOS6/A BA 1 locus in Arabidopsis [J]. The Journal of Biological Chemistry，2002，277（10）：8588-8596.[11]HALLOUIN M， GHELIS T， BRAULT M， el al. Plasmalemma abscisic acid perception leads to 7M518 expression via phos-pholipase D activation in Arabidopsis suspension cells[J].Plant Physiology，2002，130（1）：265-272.[12]SONG S， QI T， WASTERN AC K C， et al. Jasmonate signaling and crosstalk with gibberellin and ethylene[J]. Current Opinion in Plant Biology.2014，24（7）：112-119.