抗番鴨細小病毒卵黃抗體的制備

趙瑞宏等

摘要[目的]有效預(yù)防和治療番鴨細小病毒病。[方法]用番鴨細小病毒連續(xù)免疫產(chǎn)蛋母雞3次，收集雞蛋，并制備出高免卵黃抗體。通過瓊脂擴散試驗對制備的卵黃抗體進行效價測定，用雛番鴨進行中和與治療試驗。[結(jié)果]制備的卵黃抗體瓊擴效價達到1∶32，能有效中和番鴨細小病毒對雛番鴨的致病性，對發(fā)病的雛番鴨有很好的治療作用。[結(jié)論]該研究為番鴨細小病毒的預(yù)防和治療提供了一種有效的生物制品。

關(guān)鍵詞番鴨細小病毒；卵黃抗體；制備

中圖分類號S858.32文獻標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2015）29-062-03

番鴨細小病毒（Muscovy duck parvovirus，MDPV）為細小病毒科、細小病毒屬的成員，病毒直徑20～24 nm，無囊膜，呈二十面體對稱，基因組大小約5 kb。主要引起1～3周齡雛番鴨發(fā)病，以腹瀉、軟腳、喘氣為特征，發(fā)病率為27%～62%，病死率為22%～43%，且病愈鴨大部分成為僵鴨。隨著安徽省番鴨養(yǎng)殖量的增加，番鴨細小病毒病也時有發(fā)生。研究表明，IgY是一種高效、特異的抗體，且方便、廉價。為了有效防治番鴨細小病毒病，筆者制備了抗番鴨細小病毒卵黃抗體，通過試驗發(fā)現(xiàn)其對番鴨細小病毒病起到了明顯的預(yù)防和治療作用。

1材料與方法

1.1試驗材料

番鴨細小病毒AH株，由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所分離、鑒定并保存。番鴨胚和雛番鴨，從非疫區(qū)購回番鴨種蛋，自行孵化。高產(chǎn)蛋雞為購自安徽省肥西縣某雞場飼養(yǎng)的200日齡、健康的京紅1號商品代蛋雞。營養(yǎng)瓊脂和血瓊脂培養(yǎng)基，均購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；氯仿、瓊脂糖、氯化鈉均為國產(chǎn)分析純。

1.2試驗方法

1.2.1病毒培養(yǎng)。

將MDPV AH株病毒液經(jīng)尿囊腔接種12日齡番鴨胚，0.1 ml/胚，37 ℃下孵育，每天觀察2次至第5天，棄去24 h內(nèi)的死胚，收集24～120 h內(nèi)死亡的鴨胚尿囊液，置于-80 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2病毒ELD50測定。

將病毒用生理鹽水進行連續(xù)10倍系列稀釋，每個稀釋度接種4枚12日齡番鴨胚，0.1 ml/胚，37 ℃條件下孵化，棄去24 h內(nèi)的死胚，每天照蛋2次，連續(xù)觀察5 d，采用ReedMuench法計算ELD50。

1.2.3產(chǎn)蛋雞免疫。

取100只非免疫產(chǎn)蛋雞隔離飼養(yǎng)，用實驗室保存的MDPV AH 株病毒液（ELD50為10-5.5/0.1 ml），每只雞胸肌注射 0.2 ml 進行首免；14 d后進行2次免疫，每只雞胸肌注射 0.5 ml；28 d進行第3次免疫，每只雞胸肌注射 1.0 ml。三免后14 d收集雞蛋。免疫期間，統(tǒng)計免疫前后的產(chǎn)蛋率。

1.2.4高免卵黃抗體的制備與純化。

參照文獻

方法，取高免雞蛋洗凈并消毒，取出卵黃，收集卵黃液。將卵黃液用滅菌生理鹽水按1∶5的比例稀釋、混合、攪拌均勻，加入等體積的氯仿，充分振蕩后5 000 r/min 離心10 min，收集上層水相，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5無菌檢驗。

分別取0.2 ml純化的卵黃抗體接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和血瓊脂培養(yǎng)基。將培養(yǎng)基置于37 ℃條件下培養(yǎng)觀察3～5 d。

1.2.6抗體安全性檢測。

取純化的卵黃抗體，分別經(jīng)肌肉注射和口服途徑接種3日齡雛番鴨各5只，接種劑量為1 ml/只，同時取5只3日齡雛番鴨接種生理鹽水作為對照。各組隔離飼養(yǎng)，觀察并記錄各組雛番鴨生產(chǎn)性能。

1.2.7瓊擴抗原的制備。

取MDPV AH株胚胎尿囊液20 ml，5 000 r/min離心10 min，取上清分裝于7 ml玻璃瓶中，每瓶2 ml進行凍干備用。

1.2.8瓊脂擴散效價的測定。

稱取1 g瓊脂糖置于100 ml 8%NaCl 溶液中，加熱融化后倒入玻璃培養(yǎng)皿中制成瓊脂擴散平板，冷卻后用打孔器打成梅花狀小孔，各孔用融化的瓊脂糖補底。置于 4 ℃下冷卻，取制備的凍干瓊擴抗原1瓶，用200 μl超純水溶解，取 50 μl加入中間孔，外周孔依次加入倍比稀釋的純化卵黃抗體50 μl。將加樣后的瓊脂擴散平板放入濕盒內(nèi)置37 ℃溫箱擴散24～48 h。

1.2.9中和與治療試驗。

將30只3日齡雛番鴨隨機分成3組，每組10只。取純化的卵黃抗體1 ml與等量病毒液（ELD50為10-5.5/0.1 ml）混勻，37 ℃下作用1 h，肌肉注射第1組雛番鴨，0.2 ml/只；取生理鹽水與等量病毒液混勻，37 ℃下作用1 h，肌肉注射第2組和第3組雛番鴨，0.2 ml/只；第3組雛番鴨在接毒后 96 h每只皮下注射純化的卵黃抗體0.5 ml。各組分開隔離飼養(yǎng)觀察10 d，記錄各組發(fā)病和死亡情況。

2結(jié)果與分析

2.1病毒的培養(yǎng)

12日齡番鴨胚經(jīng)尿囊腔接種MDPV AH株病毒液后于86～96 h死亡，死亡胚胎尿囊液澄清透明。

2.2病毒的ELD50

病毒進行連續(xù)10倍系列稀釋后接種番鴨胚，5 d內(nèi)番鴨胚死亡情況見表1。

采用ReedMuench法，d=（80-50）/（80-20）=0.5，ELD50的對數(shù)為-5+0.5×（-1）=-5.5，ELD50=10-5.5/01 ml。

2.3產(chǎn)蛋雞免疫

100只產(chǎn)蛋母雞接種后采食、產(chǎn)蛋正常，沒有不良反應(yīng)。

2.4無菌檢驗結(jié)果

接種卵黃抗體的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和血瓊脂培養(yǎng)基經(jīng)37 ℃培養(yǎng)5 d，取出觀察發(fā)現(xiàn)無細菌生長。

2.5抗體安全性檢測結(jié)果

3日齡雛番鴨經(jīng)肌肉注射和口服途徑接種的試驗組和接種生理鹽水的對照組雛番鴨的生產(chǎn)性能無明顯差異。

2.6瓊脂擴散效價的測定

24 h后取出瓊脂擴散平板觀察，在抗原抗體孔之間有明顯沉淀線，抗體效價達1∶32。

2.7中和與治療試驗

由表2可知，第1組接種卵黃抗體與病毒混合液的雛番鴨，未出現(xiàn)發(fā)病癥狀和死亡；第2組在接種后第4天出現(xiàn)發(fā)病癥狀，第5天死亡1只，至第9天接種的10只全部死亡；第3組在接毒后第4天出現(xiàn)發(fā)病癥狀，注射卵黃抗體后第2天死亡1只，其余9只恢復(fù)正常。

3小結(jié)與討論

（1）筆者成功制備出抗番鴨細小病毒卵黃抗體，卵黃抗體瓊脂擴散效價達1∶32，對發(fā)病的雛番鴨有明顯的治療作用，能有效中和番鴨細小病毒。

（2）番鴨細小病毒病與其他細小病毒一樣以體液免疫為主，通過母源抗體可使雛番鴨獲得被動保護，規(guī)?；唸龇N鴨使用MDPV疫苗，其子代雛番鴨可獲得母源抗體的保護而不發(fā)病，但一些養(yǎng)鴨場常出現(xiàn)疫苗免疫效果不甚理想或免疫失敗現(xiàn)象，用卵黃抗體可進行有效預(yù)防和治療，為番鴨細小病毒病的預(yù)防和治療提供了一種新藥物。

（3）在瓊脂擴散抗原的制備過程中，采用凍干的方法進行10倍濃縮，濃縮的抗原與抗體能特異性結(jié)合形成沉淀線，凍干的抗原也易于保存。

（4）在病毒培養(yǎng)和ELD50測定時，番鴨胚在接種MDPV AH株病毒液后86～96 h即發(fā)生死亡，說明分離毒株的毒力強。

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