牛CAPN1基因遺傳變異及其對(duì)胴體性狀的效應(yīng)分析

武秀香等

摘要[目的]探討鈣蛋白酶1（CAPN1）基因在中國(guó)黃牛不同群體中的變異以及CAPN1基因作為影響牛肉質(zhì)性狀候選基因的可能性，尋找與牛肉質(zhì)性狀相關(guān)的分子標(biāo)記。[方法]采用PCRSSCP對(duì)雷瓊牛、云南高峰牛、BMY牛與中國(guó)西門塔爾牛共367個(gè)個(gè)體CAPN1基因Exon11Exon16與Intron21遺傳變異檢測(cè)，運(yùn)用GLM模型分析檢測(cè)到的遺傳變異與中國(guó)西門塔爾牛部分肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)性。[結(jié)果] 發(fā)現(xiàn)CAPN1基因DNA序列中的2個(gè)突變位點(diǎn)A4558G和C4684T，分別檢測(cè)到AA/AG/GG和CC/CT/TT 3種基因型，優(yōu)勢(shì)基因分別為A和G。效應(yīng)分析結(jié)果表明， A4558G多態(tài)對(duì)骨重、胴體產(chǎn)肉率及肉骨比性狀效應(yīng)顯著（P<0.05），C4684T多態(tài)對(duì)宰前活重、凈肉重、胴體重、頭重、骨重、前蹄重、網(wǎng)膜油重及腸系膜油重性狀效應(yīng)顯著（P<0.05）。[結(jié)論]CAPN1基因可以作為肉牛胴體性狀的主效基因或與主效基因相連鎖的一個(gè)標(biāo)記。

關(guān)鍵詞鈣蛋白酶1基因；群體遺傳分析；胴體性狀；SNP

中圖分類號(hào)S813.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2015）29-054-03

鈣蛋白酶 （Calcium activated neutral protease，CAPN），是一種廣泛存在于動(dòng)物細(xì)胞中的蛋白水解酶，在機(jī)體發(fā)生與神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉生長(zhǎng)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與凋亡等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。CAPN首次發(fā)現(xiàn)于大鼠腦組織中，目前已對(duì)其結(jié)構(gòu)及表達(dá)進(jìn)行了大量研究。CAPN參與了肌肉中肌原纖維的水解過(guò)程，因此也直接參與了肌肉生長(zhǎng)和畜禽屠宰后嫩化的過(guò)程。鈣蛋白酶能降解肌原纖維蛋白，因此推測(cè)其可能通過(guò)對(duì)肌原纖維蛋白進(jìn)行特異的局部降解而對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行調(diào)控。Calpain是活體肌肉組織中導(dǎo)致肌纖維降解的關(guān)鍵因素。Doumit和Koohmaraie認(rèn)為鈣蛋白酶可能通過(guò)對(duì)肌原纖維蛋白進(jìn)行特異的局部降解。Richard認(rèn)為肌原纖維被鈣蛋白酶降解釋放出的粗肌絲和細(xì)肌絲可與母體或其他肌原纖維重新裝配，也可被胞質(zhì)蛋白酶或溶酶體降解。目前，有關(guān)CAPN1基因與牛肉肉質(zhì)（如IMF）的遺傳相關(guān)性已有大量研究，但關(guān)于這一基因?qū)θ馀ｋ伢w性狀的效應(yīng)則未見(jiàn)報(bào)道。基于此，筆者對(duì)CAPN1基因?qū)χ袊?guó)西門塔爾牛胴體性狀的效應(yīng)進(jìn)行了系統(tǒng)分析。筆者以分析CAPN1基因在中國(guó)西門塔爾牛、云南高峰牛、雷瓊牛和BMY牛等4個(gè)中國(guó)黃牛群體中的遺傳變異水平為手段，探討該基因?qū)χ袊?guó)西門塔爾牛胴體性狀的效應(yīng)，以期找出肉牛肉用性能的獨(dú)特遺傳標(biāo)記，為培育我國(guó)黃牛肉用新品系提新的供理論依據(jù)與支持。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1血樣采集與屠宰測(cè)定。共采集了黃牛血樣367份，頸靜脈采血8 ml，肝素鈉抗凝，-80 ℃條件下保存?zhèn)溆?。采集群體均為成年牛，其樣本采集地區(qū)與規(guī)模分別為：內(nèi)蒙古自治區(qū)的中國(guó)西門塔爾牛132頭，云南省草地動(dòng)物科學(xué)研究院育成中的BMY牛81頭，云南省思茅地區(qū)云南高峰牛80頭，海南省瓊中縣雷瓊牛保種場(chǎng)雷瓊牛74頭。另外，中國(guó)西門塔爾牛屠宰后經(jīng)排酸嫩化處理（4 ℃、24 h），根據(jù)文獻(xiàn)[12]的方法測(cè)定相關(guān)屠宰指標(biāo)。

1.1.2試驗(yàn)試劑。試驗(yàn)試劑均購(gòu)自TaKaRa 公司（大連）（除注明出處外）。

1.1.3引物設(shè)計(jì)。涉及的引物均參照文獻(xiàn)[8]。

1.2DNA提取采用常規(guī)酚氯仿提取法，依據(jù)文獻(xiàn)[13]中方法提取采集血液樣本中的基因組DNA，并依據(jù)測(cè)定濃度進(jìn)行濃度校正。

1.3PCR-SSCP與測(cè)序

PCR反應(yīng)體系：總體積20 μl，10×buffer 2.0 μl、dNTP（10 mmol/L）0.5 μl、Taq DNA 聚合酶（5 U/μl）0.3 μl、上下游引物各（10 pmol/μl）1.0 μl、模板DNA（100 ng/μl）1.0 μl、ddH2O 14.2 μl。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性，5 min；94 ℃變性 40 s，58 ℃復(fù)性 40 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。4 ℃，下保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠檢測(cè)后，取2 μl于滅菌離心管中，加入6 μl變性上樣緩沖液（95%去離子甲酰胺）、10 mmol/L EDTA（pH 8.0）、0.25%二甲苯青FF、0.25%溴酚藍(lán)，98 ℃ 變性10 min，冰浴至上樣時(shí)取出。10% Acr-bis（29∶1）聚丙烯酰胺凝膠電泳，120 V 14 h，銀染后判型。

SSCP分型后，每個(gè)基因型隨機(jī)挑選2個(gè)樣本，用DNA回收試劑盒（TaKaRa Agrose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0）純化后回收，正反向直接測(cè)序（上海生物工程技術(shù)有限公司）。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)處理使用SPSS17.0軟件，一般線性模型（General linear model，GLM）分析各基因型與測(cè)定胴體性狀指標(biāo)之間的相關(guān)性，采用以下模型：Yijk=μ+Markeri+Agej+eijk。其中，Yijk為個(gè)體表型記錄，μ為群體均值，Markeri為基因型效應(yīng)與基因型組合效應(yīng)，Agej為年齡效應(yīng)，eijk為隨機(jī)誤差。

2結(jié)果與分析

2.1CAPN1基因的SNP分型

分別對(duì)中國(guó)西門塔爾牛、雷瓊牛、云南高峰牛和BMY牛CAPN1基因進(jìn)行PCR-SSCP分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)（圖1）。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，選取帶型特征明顯的樣本，進(jìn)行測(cè)序分析，并與GenBank序列（登錄號(hào)為AF248054）進(jìn)行比對(duì)。經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，中國(guó)西門塔爾牛、雷瓊牛、云南高峰牛和BMY牛CAPN1基因分別在4 558 bp和4 684 bp處出現(xiàn)了C/T堿基突變與A/G堿基突變（圖2）。

2.2群體間基因分布由表1可知，CAPN1 A4558G位點(diǎn)優(yōu)勢(shì)基因?yàn)锳，優(yōu)勢(shì)基因型為AA型。CAPN1 C4684T位點(diǎn)優(yōu)勢(shì)基因?yàn)镃，但群體間基因分布情況不同，本地黃牛群體為CC型，培育群體為CT型。

2.3CAPN1基因與胴體性狀的關(guān)聯(lián)分析由表2可知，CAPN1的A4558G位點(diǎn)遺傳變異與骨重、胴體產(chǎn)肉率及肉骨比顯著相關(guān)，其中骨重性狀GG基因型顯著低于雜合型個(gè)體AG （P<0.05）。從胴體產(chǎn)肉率和肉骨比來(lái)看，GG型個(gè)體顯著高于AG型個(gè)體（P<0.05），與AA型個(gè)體差異不顯著（P>0.05）。CAPN1的C4684T位點(diǎn)遺傳變異與宰前活重、胴體重、骨重、凈肉重、頭重、前蹄重、胃重、腸系膜油重及網(wǎng)膜油重顯著相關(guān)，其中CT基因型個(gè)體宰前活重、胴體重、頭重及網(wǎng)膜油重的性狀顯著高于TT型個(gè)體（P<0.05）；凈肉重、骨重、胃重CT型高于CC型（P<0.05）；前蹄重CT型顯著高于CC和TT型（P<0.05）；腸系膜油重TT型顯著高于CC型（P<0.05）。

3討論

作為影響牛肉肉質(zhì)的主效基因之一，鈣蛋白酶在牛肉的成熟嫩化過(guò)程中是重要的內(nèi)源蛋白酶之一。長(zhǎng)期以來(lái)，CAPN1基因其遺傳變異對(duì)肉嫩度效應(yīng)的相關(guān)研究頗多。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)CAPN1基因的優(yōu)勢(shì)基因型組合對(duì)大理石花紋評(píng)分和剪切力2個(gè)性狀效應(yīng)低于其他基因型組合3.20%和15.22%（P<0.05），具有較高的培育潛力。然而，CAPN1與肌肉生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)分析的研究較少。筆者在前期試驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析了CAPN1基因2個(gè)SNP位點(diǎn)對(duì)中國(guó)西門塔爾牛主18個(gè)胴體性狀的遺傳效應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)A4558G位點(diǎn)的遺傳變異對(duì)胴體重與宰前活重等重要胴體性狀具有顯著效應(yīng)，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)腸系膜油與網(wǎng)膜油重等脂肪相關(guān)性狀也有特定效應(yīng)，說(shuō)明機(jī)體脂肪沉積過(guò)程中CAPN1基因發(fā)揮了一定作用，也從側(cè)面證實(shí)了CAPN1基因與肉質(zhì)性狀的關(guān)系，初步確定CAPN1基因可以作為調(diào)控我國(guó)肉牛部分屠宰性狀的主效應(yīng)基因或與主基因緊密連鎖。這些證據(jù)從另外一個(gè)角度證實(shí)了CAPN1基因?qū)θ馀Ｉa(chǎn)性狀的改良具有重要理論意義。

4結(jié)論

通過(guò)對(duì)牛CAPN1基因2個(gè)變異位點(diǎn)在中國(guó)北方南方黃牛群體中群體遺傳分析以及與中國(guó)西門塔爾牛肉質(zhì)性狀的效應(yīng)分析，進(jìn)一步證實(shí)CAPN1基因作為牛肉用性能的遺傳標(biāo)記具有重要的理論意義。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2015年

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