分子標(biāo)記技術(shù)在辣椒種子純度檢測(cè)中的應(yīng)用

楊中周

摘要：種子的純度是種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，其對(duì)產(chǎn)量及品質(zhì)均有直接而明顯的影響。辣椒種子純度鑒定技術(shù)也由傳統(tǒng)的主要依賴形態(tài)鑒定逐步發(fā)展形成集形態(tài)學(xué)鑒定、細(xì)胞學(xué)鑒定、蛋白及同工酶電泳鑒定和遺傳標(biāo)記鑒定等技術(shù)的鑒定技術(shù)體系，特別是基于DNA水平的分子標(biāo)記技術(shù)為種子純度鑒定提供了一個(gè)新的途徑。對(duì)用于辣椒純度鑒定的幾種分子標(biāo)記技術(shù)的基本原理及應(yīng)用進(jìn)行了概述，并全面闡述了各自的優(yōu)缺點(diǎn)，主要包括RFLP、RAPD、SCAR、SSR、ISSR、SRAP、SNP，旨在為辣椒分子純度鑒定提供參考。

關(guān)鍵詞：辣椒；純度檢測(cè)；SSR；ISSR；SNP

近年我國(guó)辣椒種植面積有130萬(wàn)hm²之多，僅次于白菜類蔬菜；每年辣椒產(chǎn)量高達(dá)2800萬(wàn)t，總產(chǎn)值居蔬菜之首。在當(dāng)今辣椒生產(chǎn)中廣泛使用雜交種，而在實(shí)際的制種過(guò)程中，由于父母本混雜、母本自交、外來(lái)花粉干擾等均影響到種子純度進(jìn)而影響辣椒的品質(zhì)與產(chǎn)量。傳統(tǒng)的種子純度鑒定主要以田間植株的葉形、長(zhǎng)勢(shì)、幼果鑒定為主，輔以苗期真葉POD同工酶電泳等方式。前者耗時(shí)較長(zhǎng)，投入成本較高，而且還常受天氣等因素制約；后者雖然受外界因素影響小，鑒定準(zhǔn)確可靠，但其譜帶少，差異有限，不能夠顯示出不同品種基因型間的差異。自1974年，Grodzicker等發(fā)明了RFLP（Re—striction Fragment Length Polymorphism，限帶性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性）技術(shù)以來(lái)，迄今已有20多種分子標(biāo)記技術(shù)相繼問(wèn)世，部分已應(yīng)用于農(nóng)作物純度的檢測(cè)中。

1.限制性酶結(jié)合使用分子雜交技術(shù)的標(biāo)記

1.1RELP（Restriction fragment length polymor-phism，限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性）技術(shù)

這種基于酶切最早用于品種鑒定的第一代分子標(biāo)記技術(shù)，主要通過(guò)DNA提取、限制性內(nèi)切酶切割、瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳、southerri印跡雜交、放射自顯影、與標(biāo)準(zhǔn)RFLP指紋比較分析等幾個(gè)步驟對(duì)品種進(jìn)行驗(yàn)雜。RFLP標(biāo)記大多為共顯性標(biāo)記，具有特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)。Livneh等認(rèn)為，RFLP技術(shù)可用于鑒別辣椒雜交種及其親本的種子和幼苗形態(tài)（而同工酶不能鑒別），如利用Hind III/Riho探針43可將雜種Capsicum annuum及其親本鑒別開(kāi)來(lái)。然而其技術(shù)操作繁瑣、難度較大、耗費(fèi)高，不適合大規(guī)模的商業(yè)鑒定，因此2年后Livneh等又將其改造成一個(gè)簡(jiǎn)單適用的PCR反應(yīng)。該項(xiàng)技術(shù)的諸多缺點(diǎn)極大地限制了其在種子純度鑒定中的應(yīng)用。

2.經(jīng)PCR擴(kuò)增的標(biāo)記

2.1RAPD標(biāo)記（Randomly Amplified Polymor-phic DNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA）

該技術(shù)是以PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）為基礎(chǔ)，以長(zhǎng)度為9～10bp隨機(jī)寡聚核苷酸為引物對(duì)模板DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，后經(jīng)瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳、溴化乙錠（EB）或銀染鑒定多態(tài)性。該技術(shù)在辣椒雜種鑒定中的研究較為普遍，詹玉絲等研究PCR反應(yīng)的主要影響因子，建立適合辣椒RAPD分析的PCR反應(yīng)體系，并用40個(gè)引物對(duì)‘豫椒968及其親本進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，篩選出S5、S149、S187等3個(gè)有特異性的引物。在對(duì)以上3個(gè)引物進(jìn)行重復(fù)篩選后，確定S149能用于此辣椒品種純度鑒定，用該引物擴(kuò)增、電泳鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果完全吻合。柳李旺等用91個(gè)寡核苷隨機(jī)引物擴(kuò)增‘02-16及其親本，但親本與雜交后代間差異不明顯，但通過(guò)引入外來(lái)品種，發(fā)現(xiàn)外來(lái)種與‘02-16有明顯區(qū)別，確定此類引物可以鑒定外來(lái)品種引起的機(jī)械混雜。經(jīng)篩選引物N5能在父母本之間擴(kuò)增出的特異帶存在著明顯區(qū)別，認(rèn)為該引物可用于鑒定真雜種和由于母本自交引起的假雜種及外來(lái)品種的機(jī)械混雜。用該引物對(duì)代純度鑒定與田間鑒定、種子貯藏蛋白質(zhì)鑒定、苗期真葉POD同工酶分析結(jié)果基本一致。李智軍等針對(duì)‘廣椒6號(hào)及親本，從340個(gè)RAPD隨機(jī)引物中篩選出用于反交種的純度鑒定的偏母型引物5個(gè)，用于正交種鑒定的偏父型引物4個(gè)，可用于正反交種兩者純度檢測(cè)的互補(bǔ)型引物6個(gè)。利用偏父型引物F05、105和互補(bǔ)型引物F15進(jìn)行純度檢測(cè)，3個(gè)引物的檢測(cè)結(jié)果不但一致，而且與田間形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果吻合。黃三文等篩選出12個(gè)可用于‘中椒系列雜交種純度鑒定的RAPD標(biāo)記。Hulya的研究也證實(shí)RAPD標(biāo)記在辣椒純度鑒定中的可行性。但由于RAPD受條件影響大，重復(fù)性差，而且一般只表現(xiàn)顯性遺傳，不能有效區(qū)分顯性純合和雜合基因型等缺點(diǎn)，直接限制了其的發(fā)展。

2.2SSR標(biāo)記（Simple Sequence Repeat或Micro-satellite DNA，微衛(wèi)星DNA）

它是由多為1～6個(gè)核苷酸串聯(lián)重復(fù)成100bp以內(nèi)大小的DNA片段。由于微衛(wèi)星位點(diǎn)兩側(cè)的堿基序列較為保守，便于設(shè)計(jì)特定的引物，經(jīng)體外擴(kuò)增后的產(chǎn)物通過(guò)電泳技術(shù)進(jìn)行分離，進(jìn)而獲取這些重復(fù)序列的多態(tài)性信息。SSR標(biāo)記多態(tài)性高、結(jié)果重演性和穩(wěn)定性好、操作高度自動(dòng)化、不受環(huán)境影響、每個(gè)位點(diǎn)均有許多等位形式，且呈共顯性遺傳，與顯性遺傳相比，它可分辨出雜交種子的雜合體和純合體，是目前應(yīng)用最為廣泛的分子標(biāo)記技術(shù)，同時(shí)也是被普遍認(rèn)為是最接近理想化的品種鑒定技術(shù)。特別是自2010年我國(guó)應(yīng)用SSR分子標(biāo)記開(kāi)展品種真實(shí)性監(jiān)督抽查以來(lái)，越來(lái)越多的仲裁機(jī)構(gòu)依靠該技術(shù)進(jìn)行純度檢測(cè)，這也促使許多企業(yè)爭(zhēng)相效仿。

劉子記等從辣椒85對(duì)SSR引物中篩選出10對(duì)位于不同染色體上、能在‘熱辣3號(hào)親本間能擴(kuò)增出互補(bǔ)特異性條帶的引物，且均為共顯性標(biāo)記；然后用分別位于2、10、11號(hào)染色體上的多態(tài)性標(biāo)記SSR27、SSR70、SSR76對(duì)196株‘熱辣3號(hào)單株及其親本材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從擴(kuò)增結(jié)果檢測(cè)其純度。該檢測(cè)結(jié)果與田間表型鑒定結(jié)果高度一致，表明SSR分子標(biāo)記可用于‘熱辣3號(hào)雜交種純度的快速鑒定。張曼利用21對(duì)SSR引物對(duì)辣椒代及其雙親進(jìn)行PCR擴(kuò)增篩選，發(fā)現(xiàn)引物CA885在雙親和F₁代中存在多態(tài)性。且該引物擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定。利用CA885分別對(duì)2份辣椒品種F₁雜交種的96株單株進(jìn)行純度檢測(cè)，結(jié)果分別為90.6%和86.0%。與田間純度檢測(cè)結(jié)果（分別為90.6%和91.3%）相近或稍低。

2.3SCAR（Sequence Characterized Amplified Regions，特定性片段擴(kuò)增區(qū)域）標(biāo)記

該技術(shù)于1993年由Paran和Michelmore在RAPD基礎(chǔ)上提出，其穩(wěn)定性和可重復(fù)性顯著提高，還具有快速、準(zhǔn)確、成本低的特點(diǎn)，為品種分類與鑒定、假種辨別提供技術(shù)依據(jù)。陳靈芝等利用150條隨機(jī)引物對(duì)‘隴椒5號(hào)及其親本基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，篩選出R520和R780兩條特異性引物，前者為父本和F₁特有標(biāo)記，后者為母本和F₁特有標(biāo)記。對(duì)可鑒別母本和F₁的R520擴(kuò)增片段進(jìn)行回收、克隆、測(cè)序，設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物對(duì)試材進(jìn)行擴(kuò)增，鑒定出無(wú)條帶的母本或雜株。

2.4ISSR（Inter Simple Sequence Repeat，簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性）分子標(biāo)記技術(shù)

該技術(shù)是由Zietkeiwitcz等于1994年基于SSR開(kāi)發(fā)的、利用引物（SSR序列的3'端或5'端錨定1至數(shù)個(gè)隨機(jī)核苷酸）對(duì)位于反向排列、間隔不太大的重復(fù)序列間的基因組節(jié)段進(jìn)行PCR擴(kuò)增的一種分子標(biāo)記。該技術(shù)遺傳多態(tài)性高、重復(fù)性好、DNA用量少、無(wú)需知道兩端的堿基序列，引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、呈孟德?tīng)栠z傳，已被廣泛應(yīng)用于種質(zhì)鑒定，然而其在辣椒上的研究鮮有報(bào)道。徐杰從15條引物中篩選出10條重復(fù)性好、條帶清晰、多態(tài)性好的引物，并利用優(yōu)化后的ISSR-PCR反應(yīng)體系對(duì)辣椒F₁代種子的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，電泳圖譜結(jié)果表明，ISSR可以有效地從F₁種中分離出機(jī)械混雜或人工混雜的種子。然而該試驗(yàn)未對(duì)F₁的親本DNA同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增分析，也未對(duì)結(jié)果進(jìn)行后續(xù)田間驗(yàn)證，因而未區(qū)分出真假雜交種和驗(yàn)證結(jié)果的真實(shí)性。

2.5SRAP標(biāo)記（Sequence-Related AmplifiedPolymorphism，相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性）

該技術(shù)由美國(guó)加州大學(xué)Li博士等于2001年開(kāi)發(fā)出的基于PCR對(duì)基因的ORFs（0pen Readinz Frames，開(kāi)放閱讀框）的特定區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增的一種顯性分子標(biāo)記技術(shù)。SRAP的一組由17個(gè)堿基組成的正向引物中使用“CCGG”序列，其目的是使之特異結(jié)合可譯框（ORFS）區(qū)域中的外顯子；SRAP中使用的由18個(gè)堿基組成的反向引物的3'端含有核心AATT，以特異結(jié)合富含AT區(qū)，比如啟動(dòng)子和內(nèi)含子等。這就使得內(nèi)含子與外顯子有可能得到擴(kuò)增。SRAP具有多態(tài)性豐富、引物可以通用等特點(diǎn)，與SSR相比其辨別能力更高、鑒定結(jié)果更接近田間種質(zhì)鑒定，是一種高效的作物品種尤其是雜交種鑒定技術(shù)。扈新民等對(duì)SRAP分子標(biāo)記反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)體系，并以‘杭椒4號(hào)及其父母本為供試材料檢測(cè)雜種一代純度，結(jié)果與田間農(nóng)藝性狀調(diào)查驗(yàn)證結(jié)果非常接近。

3.基于單核苷酸多態(tài)性（Single Nugle-otide PolymorphiSill，SNP）的分子標(biāo)記

自1996年Lande首次將SNP作為一種新型分子標(biāo)記提出，該技術(shù)越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視，目前已經(jīng)成為最具應(yīng)用前景的分子標(biāo)記。SNP標(biāo)記主要是由單堿基的插入、缺失、轉(zhuǎn)換及調(diào)換等引起的基因組核苷酸序列多態(tài)性，具有二態(tài)性、等位基因性、密度高、遺傳穩(wěn)定、易實(shí)現(xiàn)分析的自動(dòng)化等特點(diǎn)。Jung等篩選出可以用于辣椒品種鑒定的40個(gè)AS-PCR SNP標(biāo)記，從而將81個(gè)商品種中的79個(gè)區(qū)分開(kāi)來(lái)，同時(shí)也能完全區(qū)分出供試的17個(gè)甜椒品種。Jeong等俐用SNP-HRM技術(shù)對(duì)辣椒屬6個(gè)種的31個(gè)成員進(jìn)行辣椒種質(zhì)資源研究，發(fā)現(xiàn)通過(guò)對(duì)6種COSII標(biāo)記曲線的結(jié)合比較分析可有效將他們歸到其所屬的種，這與當(dāng)今的分類系統(tǒng)完全吻合，從而表明該項(xiàng)技術(shù)可快速鑒別新種質(zhì)。這些科研成果對(duì)鑒定外來(lái)品種的機(jī)械混雜具有一定的借鑒意義，然而應(yīng)用該項(xiàng)技術(shù)對(duì)辣椒真雜種和由于母本自交引起的假雜種的鑒定鮮有報(bào)道。國(guó)內(nèi)外該項(xiàng)技術(shù)的研究雖僅限于西瓜、甜瓜與黃瓜，然而這些寶貴的經(jīng)驗(yàn)卻為判斷辣椒種子是否存在親本污染，進(jìn)而測(cè)試出供試品種的種子純度的相關(guān)研究創(chuàng)造了條件。

4.應(yīng)用前景與展望

理想的純度檢測(cè)方法應(yīng)具備穩(wěn)定性好、技術(shù)簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)、便于標(biāo)準(zhǔn)化操作等特點(diǎn)。而就目前常用的幾種分子標(biāo)記而言，RFLP操作復(fù)雜，對(duì)DNA質(zhì)量要求高，費(fèi)用較高，放射性同位素對(duì)人體有害；RAPD結(jié)果重復(fù)性較差；SSR引物開(kāi)發(fā)費(fèi)用高；SNP存在專利問(wèn)題，對(duì)遺傳統(tǒng)計(jì)的方法及工具要求高，開(kāi)發(fā)、檢測(cè)費(fèi)用大等。均未達(dá)到理想的檢測(cè)方法的要求。

2014年1月韓國(guó)首爾大學(xué)的Kim等對(duì)墨西哥一個(gè)辣椒栽培變種的全基因組序列和裝配進(jìn)行了報(bào)道，并報(bào)道了2個(gè)栽培辣椒基因序列及一個(gè)野生黃燈籠椒從頭測(cè)序序列；在此基礎(chǔ)上獲得首個(gè)高質(zhì)量的參考基因組，并鎖定了負(fù)責(zé)產(chǎn)生辣椒素的基因。同年3月Qin等報(bào)道了遵義市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院選育的品種‘遵辣1號(hào)和一個(gè)墨西哥野生種的全基因組序列。這些在辣椒領(lǐng)域的科研進(jìn)展將會(huì)促使SSR引物開(kāi)發(fā)費(fèi)用逐漸降低。就ISSR標(biāo)記而言，其引物具有良好通用性，引物設(shè)計(jì)費(fèi)用低。此外，兩者兼具操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，使其基本滿足辣椒純度檢測(cè)的要求。

近年來(lái)，公共序列數(shù)據(jù)庫(kù)（NCBI）中大量快速增長(zhǎng)的EST（Expressed Sequence Tags，表達(dá)序列標(biāo)簽）序列資源與辣椒多態(tài)性EST-SSR標(biāo)記的位點(diǎn)鑒定及引物研究為SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)提供了新途徑。目前EST-SSR分子標(biāo)記技術(shù)已在南瓜、黃瓜、大白菜等作物純度鑒定上成功應(yīng)用。該項(xiàng)技術(shù)具有過(guò)程簡(jiǎn)單、成本低、在相關(guān)物種間具有較高的可轉(zhuǎn)移性等特點(diǎn)，再加上SSR位點(diǎn)在轉(zhuǎn)錄區(qū)的發(fā)生頻率遠(yuǎn)高于非轉(zhuǎn)錄區(qū)的優(yōu)勢(shì)，使得該項(xiàng)技術(shù)更高效，有較好的應(yīng)用前景。同時(shí)隨著高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，海量SNP數(shù)據(jù)被提交至數(shù)據(jù)庫(kù)并共享，為建立精確、快速、高通量和高度自動(dòng)化的辣椒種子純度SNP鑒定體系創(chuàng)造了條件。

在實(shí)際工作中，往往要等到供試材料長(zhǎng)出葉片后再進(jìn)行提取，而且采用不同的方法（商業(yè)DNA提取試劑盒、CTAB法、SDS法以及其改良后的一些方法）提取的速度及質(zhì)量也略有差異。這些都是制約鑒定效率的重要因素。如果能從干辣椒種子中快速提取DNA并形成標(biāo)準(zhǔn)化的操作流程和技術(shù)體系，這將大大縮短鑒定所需時(shí)間，提高工作效率。