早期自然流產(chǎn)絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞VEGF 的表達(dá)及意義

楊倩 盧麗莉 梁珊 畢秀霞 韓彥潔 宋春紅 劉洋

在妊娠早期，滋養(yǎng)細(xì)胞發(fā)育和分化為構(gòu)成絨毛的滋養(yǎng)細(xì)胞(合體滋養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞)及絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞(extravillous trophoblast，EVT)。EVT 增殖侵入蛻膜組織，具有類似腫瘤的增殖浸潤(rùn)能力［1］。其中，浸入子宮蛻膜間質(zhì)甚至淺肌層的稱絨毛外中間滋養(yǎng)細(xì)胞(interstitial extravillous trophoblast，IET)，侵入母體血管的絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞稱為血管滋養(yǎng)細(xì)胞(endovascular extravillous trophoblast，ET)。EVT 以旁分泌，自分泌的方式受滋養(yǎng)細(xì)胞及子宮分泌的多種激素及細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，對(duì)母體-胎兒血液循環(huán)的建立和維持正常妊娠起著至關(guān)重要的作用。研究顯示，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是高效的促有絲分裂因子，除了促進(jìn)子宮內(nèi)膜和蛻膜組織中血管形成和發(fā)育的重要作用［2，3］外，VEGF 還具有增加體外培養(yǎng)的EVT 增殖力的作用［4］。關(guān)于流產(chǎn)時(shí)外周血及絨毛VEGF 的表達(dá)研究［5，6］較多，但絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞VEGF 的表達(dá)是否發(fā)生變化筆者在國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察自然流產(chǎn)絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞VEGF 表達(dá)的變化探討早期自然流產(chǎn)可能的發(fā)生機(jī)制，為早期自然流產(chǎn)時(shí)VEGF 的表達(dá)改變提供佐證，探討自然流產(chǎn)治療的新方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料 流產(chǎn)組:2013 年3 月至2014 年3 月期間在石家莊市第四醫(yī)院門診或住院患者，妊娠7 ～9 周，選擇經(jīng)B 超檢查診斷為胚胎在宮內(nèi)死亡尚未自然排出且病因不明(夫妻雙方與流產(chǎn)有關(guān)的檢查均正常)者，共20 例。對(duì)照組:同期在我院門診自愿要求行人工流產(chǎn)的健康女性20 例，均無(wú)死胎、死產(chǎn)、自然流產(chǎn)史，本次妊娠期間無(wú)先兆流產(chǎn)的癥狀和體征，B 超檢查提示胚胎發(fā)育正常，無(wú)用藥、病毒感染以及X 線接觸史。2 組年齡及孕周均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。

1.2 標(biāo)本的采集及處理 2 組均采用可視人工流產(chǎn)手術(shù)，從刮出物中取絨毛及絨毛種植部位蛻膜組織(底蛻膜)，0.9%氯化鈉溶液漂洗后，置于10%中性甲醛溶液中固定6 ～12 h，梯度乙醇脫水后石蠟包埋，5 μm切片。

1.3 HE 染色及底蛻膜的辨別 在HE 染色切片下觀察底蛻膜組織中的絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞是無(wú)清晰邊界的多角形細(xì)胞，含豐富的雙染性胞質(zhì)，核深染，不規(guī)則，具有輕度多形性。蛻膜細(xì)胞具有清晰的細(xì)胞膜，輕度嗜伊紅的胞質(zhì)和卵圓形的細(xì)胞核。當(dāng)兩者鑒別困難時(shí)，加用免疫組化染色CK 和HPL 加以鑒別。選取有底蛻膜成分的臘塊，切片進(jìn)行免疫組化檢測(cè)。

1.4 免疫組織化學(xué)染色 所用一抗為兔抗人VEGF多克隆抗體購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司，運(yùn)用SP 法檢測(cè)兩組底蛻膜及絨毛組織VEGF 的表達(dá)。免疫組化檢測(cè)試劑盒(SP-9001)和DAB 酶底物顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。操作嚴(yán)格按免疫組化檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書要求進(jìn)行，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染。陰性對(duì)照以PBS 代替一抗進(jìn)行。

1.5 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) 采用雙盲法在顯微鏡下(10 ×10)觀察中間滋養(yǎng)細(xì)胞及血管內(nèi)著色情況，以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為VEGF 表達(dá)陽(yáng)性，每張切片隨機(jī)觀察10 個(gè)視野。免疫組化染色結(jié)果采用半定量“Quickscore”法［7］判讀，細(xì)胞染色強(qiáng)度:0 =陰性;1 =弱陽(yáng)性;2 =中等程度陽(yáng)性;3 =強(qiáng)陽(yáng)性;細(xì)胞染色密度:1 =0 ～25%;2 ＞ =25 ～50%;3 ＞ = 50 ～75%;4 ＞ =75 ～100%。細(xì)胞染色強(qiáng)度和密度的得分相乘再相加得到0 ～12 分的變化范圍。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以± s 表示，進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)和t 檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

自然流產(chǎn)組VEGF 表達(dá)較對(duì)照組降低，表現(xiàn)為免疫反應(yīng)積分(IRS)明顯減少(P ＜0.05)。見(jiàn)表1。

3 討論

成功的妊娠是子宮內(nèi)膜蛻膜化、胎盤形成和胚胎發(fā)育三方面協(xié)同作用的結(jié)果。胎盤著床及胎盤絨毛的正常發(fā)育對(duì)于母體－胎兒循環(huán)的建立至關(guān)重要，胚胎的EVT 侵入母體的蛻膜組織是影響胎盤著床及發(fā)育的重要環(huán)節(jié)之一［1］，EVT 在妊娠早期主要位于胎盤著床部位，為提供足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣給胎盤及胎兒，EVT 侵入子宮蛻膜組織和淺肌層形成中間滋養(yǎng)細(xì)胞，還有一部分EVT 侵入子宮螺旋動(dòng)脈，引起螺旋動(dòng)脈管壁結(jié)構(gòu)改建［3］(管腔擴(kuò)張，管壁通透性增高，管壁肌性結(jié)構(gòu)消失及纖維蛋白沉積等)，使子宮動(dòng)脈壓力降低并富于血運(yùn)，從而供應(yīng)日益增長(zhǎng)的胎盤及胎兒的營(yíng)養(yǎng)需要。EVT 增殖，遷移及侵入蛻膜及血管的過(guò)程受很多局部信號(hào)分子的調(diào)節(jié)，包括各種亞型的VEGF、血管緊張素家族(Ang-1，Ang-2)，TGF-b，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子及干擾素等。其中，VEGF 是最強(qiáng)的血管生成促進(jìn)因子，它具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂，誘導(dǎo)新生毛細(xì)血管形成及增加血管通透性等重要作用［2，3］，因此廣泛參與了胚胎發(fā)育、器官形成、腫瘤發(fā)生等一系列生理病理過(guò)程［3，8，9］。研究表明，生理妊娠時(shí)，VEGF 廣泛表達(dá)于蛻膜、絨毛組織及子宮內(nèi)膜腺體［5，10］，表明VEGF 在生理妊娠及胚胎發(fā)育中發(fā)揮了重要作用［1，5］。Schiessl等［5］的研究表明，妊娠早期EVT 存在VEGF 及其受體flt-1 的表達(dá)。我們的研究顯示，人工流產(chǎn)女性(對(duì)照組)絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞VEGF 免疫組化染色陽(yáng)性，即EVT 表達(dá)VEGF，與Schiessl 等［5］的研究結(jié)果是一致的。造成這種差異的原因可能與妊娠不同時(shí)相表達(dá)VEGF 亞型不同和所用的VEGF 免疫組化抗體的不同有關(guān)，Schiessl 發(fā)現(xiàn)，VEGF 存在不同的亞型(VEGF-A，C，D)。隨妊娠周數(shù)的增加，EVT 表達(dá)的VEGF 亞型也發(fā)生變化［5］?？赡苡捎谒玫牟煌庖呖贵w針對(duì)亞型抗原決定簇的不同，使得在妊娠早期EVT 表達(dá)VEGF 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)了差異。

表1 IRS 比較 n =20， ± s

表1 IRS 比較 n =20， ± s

注:與對(duì)照組比較，* P ＜0.05

IRS對(duì)照組組別7.75 ±2.25自然流產(chǎn)組 5.25 ±1.98*

自然流產(chǎn)發(fā)生率較高，是婦產(chǎn)科常見(jiàn)的病理性妊娠之一，其病因涉及染色體、內(nèi)分泌和免疫異常等諸多因素，尚有部分自然流產(chǎn)病因不清。自然流產(chǎn)及復(fù)發(fā)性流產(chǎn)時(shí)，患者血清及絨毛組織VEGF 表達(dá)水平的研究較多［6，11］，且研究結(jié)果存在較大差異，造成這種差異的原因不明，而早期自然流產(chǎn)時(shí)底蛻膜組織中絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞VEGF 的表達(dá)國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組化染色法發(fā)現(xiàn)，自然流產(chǎn)患者底蛻膜組織EVT(包括中間滋養(yǎng)細(xì)胞和血管滋養(yǎng)細(xì)胞)VEGF 表達(dá)與正常對(duì)照組相比是降低的，可能通過(guò)如下機(jī)制參與了自然流產(chǎn)的發(fā)生:(1)正常對(duì)照組EVT 表達(dá)VEGF及Flt-1 的表達(dá)模式說(shuō)明IET 通過(guò)旁分泌和自分泌VEGF 的方式受到VEGF 作用，研究表明，VEGF 具有增加培養(yǎng)的絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞增殖力的作用［4］，EVT 表達(dá)VEGF 減少，可能抑制了EVT 的增殖活性，使發(fā)育中的EVT 數(shù)量不同程度減少，胎盤對(duì)子宮內(nèi)膜的錨定作用和營(yíng)養(yǎng)吸收功能減弱;(2)ET 分泌VEGF 減少，ET 向螺旋小動(dòng)脈侵入的過(guò)程受挫，抑制了子宮螺旋動(dòng)脈的生理性轉(zhuǎn)化，子宮螺旋動(dòng)脈不能適時(shí)擴(kuò)張，子宮血循環(huán)壓力未能及時(shí)下降，影響了母胎交界的營(yíng)養(yǎng)交換;(3)自然流產(chǎn)時(shí)，子宮處在相對(duì)缺氧的環(huán)境中，VEGF在體外的絨毛膜癌細(xì)胞系BeWo 通過(guò)激活Nrf2 途徑減少氧化損傷，VEGF 的表達(dá)下降，使得EVT 耐受缺氧應(yīng)激的能力下降，EVT 結(jié)構(gòu)和功能受損;當(dāng)上述機(jī)制累積到一定程度最終使得流產(chǎn)難免發(fā)生。綜上所述，EVT 表達(dá)VEGF 水平的下降可能促進(jìn)了自然流產(chǎn)的發(fā)生。在妊娠早期，如能選擇性的增加VEGF 的表達(dá)或開發(fā)激活EVT 的藥物，可能為自然流產(chǎn)的治療提供新的途徑。

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