陜西省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)三科(西安710068)
陳 麗 郭興志 種 莉 任雪芝 劉 玥 劉 鵬 唐 鵬 李曉青 李 銳△
過度活化的小膠質(zhì)細胞與神經(jīng)變性疾病關(guān)系密切,前期研究表明:綠茶的一種多酚類單體-表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)具有強大的抑制小膠質(zhì)細胞活化效應(yīng)[1]。神經(jīng)變性疾病是危害中老年人群的疾病,包括阿爾茨海默病及帕金森病等,隨著人們對神經(jīng)變性疾病認識加深,小膠質(zhì)細胞的活化釋放炎癥因子在神經(jīng)變性疾病的各個環(huán)節(jié)備受關(guān)注[2]。有研究顯示:在阿爾茨海默病患者的腦中活化的小膠質(zhì)細胞與β淀粉樣蛋白的沉積相隨[3]。Daisuke等研究表明:67KDa層粘連蛋白(67KDa laminin receptor,67LR)存在于腫瘤細胞膜表面且EGCG作為一種抗癌藥物可抑制67LR的活性[4]。本研究應(yīng)用免疫熒光細胞雙標染色及Western blot半定量觀察小膠質(zhì)細胞上是否存在67LR,以及給予干預(yù)后67LR的表達量的變化,旨在為神經(jīng)變性疾病提供新的思路。
1 實驗材料 24~48h的Spraque Dawley(SD)新生大鼠由西安交通大學驗動物中心提供;低糖DMEM培養(yǎng)基,胎牛血清,0.25%胰酶,0.25% /0.02%EDTA胰酶,購于 HyClone公司;小鼠抗大鼠CD11b抗體購于Millipore公司;兔抗大鼠67LR抗體購于Abcam公司;山羊抗小鼠熒光二抗(PE),山羊抗兔熒光二抗(FITC),山羊抗兔(HRP)二抗,B-actin內(nèi)參購于北京博奧森公司,脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)、EGCG購自美國Sigma公司;山羊封閉血清購于Sigma公司;DAB顯色液購于博奧森公司。預(yù)染蛋白Mark,BCA蛋白定量盒,蛋白裂解液RIPA,蛋白酶抑制劑均購于碧云天公司。
2 實驗方法
2.1 神經(jīng)細胞-小膠質(zhì)細胞混合培養(yǎng),LPS刺激觀察細胞變化:SD大鼠,剪碎大腦皮質(zhì)后胰酶消化,接種于培養(yǎng)瓶中,加入10%胎牛血清及DMEM,培養(yǎng)箱37℃中培養(yǎng),當細胞完全匯合后,分為對照組,LPS組,EGCG+LPS組,24h后使用溫和消化法[5]分離純化小膠質(zhì)細胞,特異性抗體CD11b鑒定細胞純度,分別進行免疫熒光細胞雙標及 Western blot。
2.2 免疫熒光細胞雙標證明67LR存在小膠質(zhì)細胞上,并觀察小膠質(zhì)細胞的變化及67LR表達的變化:分離純化小膠質(zhì)細胞后,4%多聚甲醛固定30min,用山羊血清封閉液進行封閉,加入特異性抗體CD11b,特異性抗體67LR,4℃冰箱過夜,加入熒光二抗PE和熒光二抗FITC,室溫下40min,甘油封片后熒光顯微鏡下觀察小膠質(zhì)細胞數(shù)目及形態(tài)學改變及67LR的表達。
2.3 Western blot半定量觀察67LR的表達量的變化:將培養(yǎng)分離純化的小膠質(zhì)細胞加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取膜蛋白,BCA蛋白定量法定量蛋白濃度,加入40μg上樣,加緩沖液電泳。轉(zhuǎn)膜,在室溫下?lián)u床2h,加入67LR一抗,4℃冰箱過夜。加入HRP二抗。孵育1h后DAB顯色,用β-actin做內(nèi)參對照。
3 統(tǒng)計學方法 測定結(jié)果用圖像處理軟件,用SPSS17.0分析處理。
1 LPS刺激對混合培養(yǎng)小膠質(zhì)細胞數(shù)量的影響每瓶(75cm2)神經(jīng)元/小膠質(zhì)細胞靜息狀態(tài)可得到(4.05±0.30)×106個細胞;而LPS刺激后可獲得(16±0.15)×106個細胞,為前者的3.95倍。
2 小膠質(zhì)細胞67LR不同狀態(tài)的變化 見附圖。在靜息狀態(tài)下的小膠質(zhì)細胞數(shù)量較少,CD11b、67LR、CD11b/67LR雙標顯示細胞胞體細小且呈分枝狀、67LR的表達較少;給予LPS刺激后的小膠質(zhì)細胞數(shù)量較靜息時明顯增多,雙標顯示細胞胞體變大,呈阿米巴樣,67LR的總量增加,提示LPS刺激后小膠質(zhì)細胞的數(shù)量增多,形態(tài)改變;另一組提前半小時給予EGCG干預(yù)后細胞數(shù)量明顯減少,胞體呈分枝狀,67LR的總量減少,提示EGCG有抑制小膠質(zhì)細胞活化作用。
3 小膠質(zhì)細胞67LR表達變化的免疫印跡分析Western blot半定量觀察小膠質(zhì)細胞上的67LR的表達量的變化,67LR行密度掃描半定量分析顯示:給予LPS刺激后小膠質(zhì)細胞67LR是β-actin1.8±0.52倍;提前加入0.5μM EGCG后67LR的表達是β-actin1.25±0.5倍;加入5μM EGCG后67LR的表達是β-actin的0.91倍,提示EGCG對小膠質(zhì)細胞上的67LR具有抑制作用。
小膠質(zhì)細胞約占膠質(zhì)細胞的10%左右,廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng),小膠質(zhì)細胞的存在方式有靜息和活化兩種狀態(tài),并且易受微環(huán)境影響而從靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)為活化狀態(tài),這是小膠質(zhì)細胞的特性之一[6]。在正常情況下,小膠質(zhì)細胞呈分支狀或桿狀,對神經(jīng)元起著重要的支持、修復(fù)作用,在神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)系統(tǒng)中扮演重要角色[7]。而當中樞神經(jīng)系統(tǒng)遭受感染、外傷等,靜息的小膠質(zhì)細胞迅速被激活,形態(tài)發(fā)生改變,表面的突起,增粗,由分枝狀的轉(zhuǎn)變成阿米巴樣巨噬細胞,同時釋放各種炎癥因子,并出現(xiàn)增殖、趨化吞噬等功能[8]。Aβ沉積是AD神經(jīng)炎性老年斑的重要病理特征,如前所述在阿爾茨海默病患者的腦中活化的小膠質(zhì)細胞與β淀粉樣蛋白的沉積相隨[3],因此小膠質(zhì)細胞在AD的病理改變具有極其重要的地位,所以抑制小膠質(zhì)細胞過度活化,減少炎性因子的釋放,成為改善AD發(fā)生的新策略。67LR已經(jīng)被證明存在于許多種腫瘤細胞膜上。有研究顯示:小膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元混合培養(yǎng),加入外源性層粘連蛋白(LPS)后激活小膠質(zhì)細胞的同時還可損傷神經(jīng)元,提示67LR對小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的神經(jīng)元死亡具有重要意義[9,10]。前期研究表明:EGCG對小膠質(zhì)細胞的活化反應(yīng)有直接的抑制作用[1],本實驗通神經(jīng)細胞-小膠質(zhì)細胞混合培養(yǎng),觀察靜息狀態(tài)小膠質(zhì)細胞的形態(tài),給予LPS這一強大的小膠質(zhì)細胞活化劑,小膠質(zhì)細胞由靜息變?yōu)榛罨癄顟B(tài)后數(shù)量及形態(tài)變化,通過特異性抗體67LR免疫熒光標記確證小膠質(zhì)細胞膜上存在67LR及67LR的表達增加,給予EGCG干預(yù)后小膠質(zhì)細胞的形態(tài)、數(shù)量及67LR的表達減少,進一步用Western blot半定量觀察67LR的表達量的變化,提示67LR在小膠質(zhì)細胞的活化中扮演重要角色,可能介導(dǎo)了EGCG的藥理學作用。本研究結(jié)果為神經(jīng)變性疾病治療提供重要的理論基礎(chǔ)。
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