粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物抑菌效果研究

黃駒輝，黃其春，楊彩麗，檀新珠，何 茜，趙成成

(1.龍巖學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，福建 龍巖 364012；2.福建農(nóng)林大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

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粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物抑菌效果研究

黃駒輝1,2，黃其春1*，楊彩麗1，檀新珠1，何 茜1，趙成成1

(1.龍巖學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，福建 龍巖 364012；2.福建農(nóng)林大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

目的：研究粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物的抑菌效果。方法：以80%乙醇為浸提溶劑，研究粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果。結(jié)果：粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物的最佳提取條件為料液比1∶10，提取時間為1.5h，提取溫度為70℃，在此條件下進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌具有明顯的抑菌效果，其抑菌圈直徑分別為15.50mm、15.82mm和16.48mm，最低抑菌濃度分別為100mg/mL、50mg/mL和50mg/mL。結(jié)論：粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌均具有明顯的抑菌效果。

粗葉懸鉤子葉子；提取物；抑菌效果

粗葉懸鉤子(RubusaleaefoliusPoir.)為薔薇科(Rosaceae)樹莓屬(RubusL.)植物，又名懸鉤子屬植物，分布廣泛，具有較高的營養(yǎng)和藥物價值[1-2]。在民間，粗葉懸鉤子的根、葉均可入藥，具有活血化瘀、祛風(fēng)祛濕、清熱解毒、止血止痛、固腎澀精等功效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，懸鉤子屬植物具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抗過敏、保肝、鎮(zhèn)痛等多種作用[2-3]。目前，有關(guān)粗葉懸鉤子的藥理活性研究僅有零星報(bào)道，主要集中在抗肝損傷方面[4]，而有關(guān)粗葉懸鉤子的抗菌作用研究還未見報(bào)道。為此，本實(shí)驗(yàn)擬以80%乙醇為浸提溶劑，研究粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物的抑菌效果，旨在為粗葉懸鉤子的開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 粗葉懸鉤子葉子 采自福建省永定縣，曬干備用。

1.1.2 供試菌株 大腸桿菌(Escherichia coli)、沙門氏菌(Salmonella sp)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aurreus)，由龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 培養(yǎng)基 大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

1.1.4 主要儀器設(shè)備 FW80高速萬能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)、DK-S24型電熱恒溫水浴鍋(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、2XZ-2型旋片式真空泵(臨海市譚氏真空設(shè)備有限公司)、D2F-6020真空干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)、SW-CJ-1FD型單人雙面凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)、SHP-150生化培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物提取條件研究 粗葉懸鉤子葉子經(jīng)粉碎后過篩，取一定質(zhì)量粉末，以80%乙醇為浸提溶劑，在前期單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取料液比、提取時間、提取溫度三個因素的最優(yōu)試驗(yàn)范圍，以提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑大小作為指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)確定最佳提取條件。提取液經(jīng)過濾除渣、棄濾液沉淀物后，置于真空度為0.09MPa(60℃)的真空干燥箱中濃縮，制得粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物浸膏，4℃保藏備用。正交試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

1.2.2 粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物抑菌效果測定 采用紙片法[5]，取直徑7mm滅菌濾紙片，放入由最佳提取條件制得的粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物的浸膏中浸泡12h備用。挑取各供試菌種進(jìn)行斜面活化后，挑取部分菌落于無菌生理鹽水中，制成菌懸液(菌體溶度約為104～105CFU/mL)。取各供試菌懸液0.2mL，涂布于相應(yīng)的平板中，放置15min后，將已風(fēng)干的濾紙片貼在平板上，每個平板貼3片，并以生理鹽水為對照，每種供試菌重復(fù)3次。各供試菌在培養(yǎng)一段時間后，測定濾紙片抑菌圈直徑大小(mm)，并參考NCCLS推薦的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷[6]。以抑菌圈直徑>20mm為極敏；抑菌圈直徑在15～20mm之間為高敏；抑菌圈直徑在10～14mm之間為中敏；抑菌圈直徑<10mm為低敏；無抑菌圈為耐藥。

1.2.3 粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物最低抑菌濃度測定 采用瓊脂稀釋法[7]，制備粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物終濃度分別為200、100、50、25、12.5g/mL的平板。取各供試菌懸液100μL，涂布于相應(yīng)的平板中，放置15min后，培養(yǎng)、觀察其生長情況。每個濃度重復(fù)3次。另取同一濃度系列，不接種任何菌作為空白對照，以無菌落生長的最低濃度為最低抑菌濃度[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物提取條件

正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析見表3。由表2和表3可知，A(料液比)、B(提取時間)、C(提取溫度)三個因素對粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物抑菌效果的影響順序從主到次依次為A(料液比)>B(提取時間)>提取溫度(C)。由表2中的極差數(shù)據(jù)R可見，A1值在A內(nèi)較大，B1值在B內(nèi)較大，C2值在C內(nèi)較大，理論上最優(yōu)水平為A1B1C2。由于A1B1C2不存在于正交試驗(yàn)組合中，需要補(bǔ)做試驗(yàn)，通過3次重復(fù)試驗(yàn)測得抑菌圈直徑為16.48mm，此結(jié)果與正交試驗(yàn)中的A1B2C2(16.26mm)的結(jié)果非常接近，因此將粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物的最佳提取條件確定為A1B2C2，即料液比為1︰10(g/mL)、提取時間為1.5h、提取溫度為70℃，此時粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為16.26mm。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

注：F0.05(2,2)=19.00，F(xiàn)0.01(2,2)=99.00。

2.2 粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物抑菌效果

粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物對供試菌的抑菌效果見表4。由表4可知，該提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，其次是沙門氏菌、大腸桿菌，抑菌圈分別為16.48mm、15.82mm、15.50mm。

表4 粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物對供試菌的抑菌效果和最低抑菌濃度

2.3 粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物最低抑菌濃度

粗葉懸鉤子乙醇提取物對供試菌的最低抑菌濃度見表4。由表4可知，該提取物對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度分別為100mg/mL、50mg/mL和50mg/mL。

3 討論

粗葉懸鉤子具有較高的營養(yǎng)和藥用價值，在我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥中應(yīng)用廣泛。目前，有關(guān)粗葉懸鉤子的藥理活性研究僅有零星報(bào)道，主要集中在抗肝損傷方面[4]，而有關(guān)粗葉懸鉤子的抗菌作用研究還未見報(bào)道。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，粗葉懸鉤子葉子的化學(xué)成分復(fù)雜，其活性成分主要包括三萜、黃酮、鞣質(zhì)、甾醇等化合物[4]，而且這些化合物具有抗菌、殺菌作用[9]。本試驗(yàn)以80%乙醇為浸提溶劑，研究了粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑大小作為指標(biāo)，粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物的最佳提取條件為料液比1∶10、提取時間1.5h、提取溫度70℃。在此條件下進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌具有明顯的抑菌效果，其抑菌圈直徑分別為15.50mm、15.82mm和16.48mm，最低抑菌濃度分別為100mg/mL、50mg/mL和50mg/mL。因試驗(yàn)選用的菌種較少，有關(guān)粗葉懸鉤子的抗菌作用還有待于深入研究。

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(責(zé)任編輯：尹晨茹)

2015-01-16

2013年度龍巖學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目

黃駒輝(1990-)，男，龍巖學(xué)院碩士研究生，研究方向?yàn)轭A(yù)防醫(yī)學(xué)。

黃其春(1969-)，男，博士，龍巖學(xué)院教授，研究方向?yàn)闋I養(yǎng)和免疫。

R285

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1673-2197(2015)10-0036-02

10.11954/ytctyy.201510015