槐米及其不同成分對內(nèi)皮細胞損傷修復(fù)作用比較研究

安金蒙，楊中林*，鄭 琢，蕭 偉，王振中，黃文哲，丁 崗

(1.中國藥科大學 天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室，江蘇 南京 210009； 2.江蘇康緣藥業(yè)有限公司，江蘇 連云港 222002)

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槐米及其不同成分對內(nèi)皮細胞損傷修復(fù)作用比較研究

安金蒙1，楊中林1*，鄭 琢1，蕭 偉2，王振中2，黃文哲2，丁 崗2

(1.中國藥科大學 天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室，江蘇 南京 210009； 2.江蘇康緣藥業(yè)有限公司，江蘇 連云港 222002)

目的：比較研究蘆丁、槲皮素、槐米黃酮部位和槐米藥材提取物對高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞損傷的修復(fù)作用。方法：采用含有33mmol·L-1葡萄糖和1%FBS的DMEM低糖培養(yǎng)基處理人臍靜脈HUVEC內(nèi)皮細胞，建立細胞損傷模型，采用NO試劑盒檢測各樣品對模型內(nèi)皮細胞NO分泌量的影響；采用MTT法測定細胞活力。結(jié)果：蘆丁、槲皮素、槐米黃酮部位和槐米藥材提取物均可不同程度地升高模型HUVEC內(nèi)皮細胞NO分泌量，不同程度地增強細胞活力。結(jié)論：蘆丁和槲皮素可能為槐米修復(fù)內(nèi)皮細胞損傷的活性成分。

蘆?。婚纹に?；槐米黃酮部位；槐米藥材提取物；內(nèi)皮細胞損傷修復(fù)

槐米(Sophorae flos)為豆科植物槐SophoarjaponicaL.的干燥花蕾，性苦，微寒。歸肝、大腸經(jīng)，涼血止血，清肝瀉火，用于便血、痔血、肝熱目赤、頭痛眩暈等證的治療[1]，《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列為上品。糖尿病是臨床最常見的慢性疾病之一，研究報道，蘆丁可通過抑制AGEs形成、改善鏈脲霉素誘導(dǎo)糖尿病大鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)、改善血糖平衡等發(fā)揮治療糖尿病的作用[2-3]；槲皮素可修復(fù)內(nèi)皮細胞損傷，有效發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用[4-6]。槐米主要含蘆丁及檞皮素等[7]有效成分，故推測槐米可在糖尿病治療方面發(fā)揮一定作用，而槐米及其不同成分對內(nèi)皮細胞損傷修復(fù)作用比較研究未見詳細報道。本次實驗采用高濃度葡萄糖誘導(dǎo)人臍靜脈HUVEC內(nèi)皮細胞建立細胞損傷模型，以模型內(nèi)皮細胞NO分泌量和細胞活力為指標，比較研究蘆丁、槲皮素、槐米黃酮部位和槐米藥材提取物對內(nèi)皮細胞損傷的修復(fù)作用，為進一步開發(fā)利用中藥槐米提供實驗依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 細胞

人臍靜脈HUVEC內(nèi)皮細胞(中國藥科大學國家新藥篩選中心惠贈)。

1.2 試藥與試劑

槐米藥材(購自安徽亳州，經(jīng)作者鑒定為豆科植物槐SophorajaponicaL.的干燥花蕾)；一氧化氮試劑盒(南京建成生物工程研究所)；DMEM培養(yǎng)基(批號：914292，Gibco公司)；D-葡萄糖(Amresco, USA)；胰蛋白酶(批號：27250018，Gibco公司)；胎牛血清(Gibco公司)；二甲基亞砜(分析純，南京化學試劑有限公司)。

1.3 儀器與設(shè)備

Forma311系列直熱式CO2培養(yǎng)箱(Thermo Electron Corporation,USA)；超凈工作臺(蘇州艾可林凈化設(shè)備有限公司)；COIC XDS-1B倒置光學顯微鏡(重慶光電儀器有限公司)；Spectra Max Plus 384酶標儀(Molecular Devices公司)；TB-25型十萬分之一電子天平(Sartorius, USA)；PB-10型酸度計(Sartorius, USA)；YXQ·SG41·280型電熱手提壓力蒸汽消毒器(上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司)；79-1型磁力攪拌器(深圳國華儀器有限公司)；0412-1型低速離心機(上海醫(yī)療器械有限公司)；微量移液器(Thermo ELectron Corporation，USA)大龍；96孔細胞培養(yǎng)板(Caster公司)。

2 方法

2.1 槐米藥材提取物與槐米黃酮部位制備

2.1.1 槐米藥材提取物制備 托盤天平稱取50g槐米藥材，置于1L圓底燒瓶中，加12倍量50%的乙醇，密封，浸泡2h，85℃回流提取2h，趁熱過32層紗布，同法再提取2次，合并3次濾液，減壓濃縮至無醇味，于水浴鍋上蒸至浸膏(90℃)，于50℃減壓干燥至恒重，稱定所得固形物重量為28.450 1g，槐米藥材提取物得率=醇提取稱量/藥材稱量×100%=28.450 1/50×100%=56.9%。經(jīng)HPLC法測定，槐米藥材提取物中蘆丁含量為24.2%，槲皮素含量為1.05%。

2.1.2 槐米黃酮部位制備 實驗室采用堿溶酸沉法分離純化制得槐米黃酮部位，藥材中該部位得率為12.8%，經(jīng)HPLC法測定，該部位中蘆丁含量為91.1%，槲皮素含量為4.58%。

2.2 試藥配制

2.2.1 造模劑配制 取已制得的DMEM低糖培養(yǎng)基500mL，加入D-葡萄糖2.466 0g，磁力攪拌1h，得到葡萄糖濃度為33mmol·L-1的DMEM培養(yǎng)基，0.22μm微孔濾膜過濾除菌，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 陽性藥羥苯磺酸鈣配制 已知每粒羥苯磺酸鈣膠囊標示量為500mg，膠囊內(nèi)容物重量為556mg，精密稱取羥苯磺酸鈣粉末2.42mg于5mL容量瓶中，DMEM低糖培養(yǎng)基溶解并定容至刻度，0.22μm微孔濾膜過濾除菌，即得濃度為436μg·mL-1的羥苯磺酸鈣溶液，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 蘆丁對照品樣品液配制 精密稱定蘆丁對照品1.07mg，置于5mL容量瓶中， DMEM低糖培養(yǎng)基定容至刻度，0.22μm微孔濾膜過濾除菌，即得濃度為214μg·mL-1蘆丁對照品母液。分別稀釋成濃度為6.69、13.38、26.75、53.5μg·mL-1蘆丁對照品樣品液，備用。

2.2.4 槲皮素對照品樣品液配制 精密稱定槲皮素對照品1mg，置于5mL容量瓶中， DMEM低糖培養(yǎng)基定容至刻度，0.22μm微孔濾膜過濾除菌，即得濃度為200μg·mL-1槲皮素對照品母液。稀釋成濃度為25.00μg·mL-1槲皮素對照品樣品液，備用。

2.2.5 槐米黃酮部位樣品液配制 精密稱定1.47mg槐米黃酮部位于5mL容量瓶中，DMEM低糖培養(yǎng)基定容至刻度，以0.22μm微孔濾膜過濾除菌，即得蘆丁濃度為267.8μg·mL-1、槲皮素濃度為13.6μg·mL-1的槐米黃酮部位樣品母液。稀釋成蘆丁濃度為26.78μg·mL-1、槲皮素濃度為1.36μg·mL-1的槐米黃酮部位樣品液，備用。

2.2.6 槐米藥材提取物樣品液配制 精密稱定1.20mg槐米藥材提取物于5mL容量瓶中， DMEM低糖培養(yǎng)基定容，以0.22μm微孔濾膜過濾除菌，即得蘆丁濃度為58.08μg·mL-1、槲皮素濃度為2.52μg·mL-1的槐米藥材樣品母液。稀釋成蘆丁濃度為29.04μg·mL-1、槲皮素濃度為1.26μg·mL-1的槐米藥材樣品液，備用。

2.3 細胞給藥濃度確定

2.3.1 細胞培養(yǎng)與分組 HUVEC細胞在含10%FBS、100μg·mL-1青霉素及100μg·mL-1鏈霉素的DMEM低糖培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37℃飽和濕度空氣培養(yǎng)箱中孵育，每2～3天傳代1次。

實驗時，將細胞稀釋至3×104個·mL-1，接種于96孔板中，每孔接種200μL，待細胞生長至80%～90%融合時，換用葡萄糖濃度為33mmol·L-1且含有1%FBS的DMEM培養(yǎng)基同步培養(yǎng)24h，后將細胞隨機分為7組，每組設(shè)6個復(fù)孔：①空白對照組：200μLDMEM低糖培養(yǎng)基；②模型組：180μL造模劑、20μLDMEM低糖培養(yǎng)基；③陽性藥組：180μL造模劑、20μL陽性藥液；④53.5μg·mL-1蘆丁對照品樣品液：180μL造模劑、20μL藥液；⑤ 26.75μg·mL-1蘆丁對照品樣品液：180μL造模劑、20μL藥液；⑥13.38μg·mL-1蘆丁對照品樣品液：180μL造模劑、20μL藥液；⑦6.69μg·mL-1蘆丁對照品樣品液：180μL造模劑、20μL藥液。

2.3.2 NO分泌量測定 NO分泌量用NO試劑盒進行測定。NO在生理溶液中不穩(wěn)定，大部分NO快速代謝成亞硝酸鹽NO2-和NO3-。本試劑盒采用硝酸還原酶特異性的將NO3-還原為NO2-，NO2-與顯色劑作用生成有色物質(zhì)，用比色法測定NO2-濃度即代表NO水平。

將加藥后的96孔板培養(yǎng)72h后，每孔取100μL含藥培養(yǎng)液于相應(yīng)Ep管中，用按照NO試劑盒說明書操作，于550nm下檢測每孔的吸光值。

2.3.3 細胞活力測定 用MTT法進行測定。按照“2.3.1”項下方法培養(yǎng)72h后，移除培養(yǎng)液，每孔加入180μL新培養(yǎng)基和20μLMTT溶液(5g·L-1)，孵育4h后吸出上清液，每孔加入200μL DMSO，輕輕震蕩10min，待藍紫色結(jié)晶完全溶解后，用酶聯(lián)免疫檢測儀在570nm條件下測各孔吸光度值。

2.4 蘆丁、槲皮素、槐米黃酮部位和槐米藥材提取物對高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞損傷修復(fù)作用比較

實驗時，將細胞稀釋至3×104個·mL-1，接種于96孔板中，每孔接種200μL，待細胞生長至80%～90%融合時，換用葡萄糖濃度為33mmol·L-1且含有1%FBS的DMEM培養(yǎng)基同步培養(yǎng)24h，后將細胞隨機分為7組，每組設(shè)6個復(fù)孔：①空白對照組：200μLDMEM低糖培養(yǎng)基；②模型組：180μL造模劑、20μL DMEM低糖培養(yǎng)基；③陽性藥組：180μL造模劑、20μL陽性藥液；④26.75μg·mL-1蘆丁對照品樣品液：180μL造模劑、20μL藥液；⑤25.00μg·mL-1槲皮素對照品樣品液：180μL造模劑、20μL藥液；⑥蘆丁濃度29.04μg·mL-1槐米藥材提取物樣品液：180μL造模劑、20μL藥液；⑦蘆丁濃度26.78μg·mL-1槐米黃酮部位樣品液：180μL造模劑、20μL藥液。

將加藥后的96孔板繼續(xù)培養(yǎng)72h，參照“2.3.2”項、“2.3.3”項下方法，測定模型細胞NO分泌量及細胞活力。

2.5 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 給藥濃度確定

NO分泌量采用NO試劑盒進行測定。結(jié)果顯示，造模組NO含量降低，且與空白組做t檢驗的P值<0.01，說明高糖誘導(dǎo)的HUVEC內(nèi)皮細胞損傷模型造模成功。當用高糖處理72h后，NO分泌量將為空白組的53.28%，而給予不同濃度的蘆丁對照品樣品液后，能夠不同程度地抑制高糖誘導(dǎo)的NO分泌量降低，NO分別恢復(fù)到空白組的66.39%、63.93%和57.38%，且呈劑量依賴性關(guān)系，濃度為26.75μg·mL-1時的作用優(yōu)于陽性藥強苯磺酸鈣。但當濃度為6.69μg·mL-1時，與模型組做t檢驗的P值>0.05，說明6.69μg·mL-1的蘆丁對照品樣品液已無明顯修復(fù)內(nèi)皮細胞作用。具體結(jié)果見表1。

表1 不同濃度蘆丁對照品樣品液對內(nèi)皮細胞損傷NO分泌量的影響 (±s，n=6)

注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

細胞活力采用MTT法進行測定。結(jié)果顯示，蘆丁對照品樣品液濃度在26.75μg·mL-1以上時，細胞出現(xiàn)死亡，說明給藥濃度過大，產(chǎn)生了一定的細胞毒性。當用高糖處理72h后，細胞活力降低至74.44%，給予不同濃度的蘆丁對照品樣品液后，能夠劑量依賴性增長細胞活力。具體結(jié)果見表2。

表2 不同濃度蘆丁對照品對內(nèi)皮細胞損傷模型細胞活力的影響 (±s，n=6)

注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

以NO分泌量和對細胞活力的影響為指標，將蘆丁對照品給藥濃度確定為26.75μg·mL-1，為使研究結(jié)果具有比較意義，槐米黃酮部位和槐米藥材提取物根據(jù)其蘆丁含量統(tǒng)一成同等蘆丁對照品濃度給藥，槲皮素對照品給藥濃度與蘆丁對照品一致。

3.2 蘆丁、槲皮素、槐米黃酮部位和槐米藥材提取物對高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞損傷修復(fù)作用比較

3.2.1 蘆丁、槲皮素、槐米黃酮部位和槐米藥材提取物對內(nèi)皮細胞損傷NO分泌量的影響 NO分泌量用NO試劑盒進行測定。結(jié)果顯示，造模組NO含量降低，且與空白組做t檢驗的P值<0.01，說明高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞損傷模型造模成功。當用高糖處理72h后，NO分泌量相比空白組降低，而給予不同樣品時，可不同程度地抑制NO分泌量降低，且除蘆丁組外，槲皮素、槐米黃酮部位和槐米藥材提取物抑制NO分泌量降低的程度均優(yōu)于陽性藥強苯磺酸鈣。具體結(jié)果見表3。

表3 蘆丁、槲皮素、槐米黃酮部位和槐米藥材提取物對內(nèi)皮細胞損傷NO分泌量的影響 (±s，n=6)

注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.2.2 蘆丁、槲皮素、槐米黃酮部位和槐米藥材提取物對內(nèi)皮細胞損傷細胞活力的影響 細胞活力采用MTT法進行測定。結(jié)果顯示，模型組與空白組比較有極顯著性差異，說明內(nèi)皮細胞損傷模型造模成功。當用高糖處理72h后，細胞活力降低，給予不同樣品時，蘆丁、槲皮素、槐米黃酮部位和槐米藥材提取物可不同程度地增強細胞活力。具體結(jié)果見表4。

表4 蘆丁、槲皮素、槐米黃酮部位和槐米藥材提取物對內(nèi)皮細胞損傷模型細胞活力的影響 (±s，n=6)

注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

4 討論

文獻表明[8-9]，NO具有松弛血管平滑肌、抗血小板聚集的作用，可減輕氧自由基造成的血管內(nèi)皮功能障礙。槲皮素可通過維持一氧化氮(NO)和內(nèi)皮素-1(Endothelin-1，ET-1)的動態(tài)平衡，對內(nèi)皮細胞損傷有一定修復(fù)作用。本次研究用高濃度葡萄糖誘導(dǎo)人臍靜脈HUVEC內(nèi)皮細胞損傷，以模型HUVEC內(nèi)皮細胞NO分泌量和細胞活力為指標，比較研究蘆丁、槲皮素、槐米黃酮部位和槐米藥材提取物對內(nèi)皮細胞損傷的修復(fù)作用，方法簡單，穩(wěn)定可靠。

本次研究表明，蘆丁、槲皮素、槐米黃酮部位和槐米藥材提取物對HUVEC內(nèi)皮細胞損傷均有一定的修復(fù)作用，可不同程度地抑制模型HUVEC內(nèi)皮細胞NO分泌量的降低，不同程度地增強模型內(nèi)皮細胞活力，說明蘆丁和槲皮素均為槐米藥材中修復(fù)HUVEC內(nèi)皮細胞損傷的活性成分，且槲皮素對HUVEC內(nèi)皮細胞損傷的修復(fù)作用強于蘆?。贿x定給藥濃度實驗時，該濃度下槐米黃酮部位和槐米藥材提取物中蘆丁的含量分別為26.78μg·mL-1和29.04μg·mL-1，槲皮素含量分別為1.36μg·mL-1和1.26μg·mL-1，蘆丁和槲皮素含量相差無幾，而槐米黃酮部位修復(fù)HUVEC內(nèi)皮細胞損傷的作用強于槐米藥材提取物，提示槐米藥材提取物中可能存在其他成分對蘆丁和槲皮素修復(fù)HUVEC內(nèi)皮細胞損傷產(chǎn)生了拮抗作用，說明對槐米藥材提取物進行富集得到的槐米黃酮部位具有一定的實際價值；統(tǒng)一蘆丁濃度給藥時，槐米黃酮部位和槐米藥材提取物對HUVEC內(nèi)皮細胞損傷的修復(fù)作用均強于蘆丁，且槐米黃酮部位和槐米藥材提取物中主要成分為蘆丁和槲皮素，提示槲皮和蘆丁可能產(chǎn)生了協(xié)同作用。

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(責任編輯：尹晨茹)

Protective Effects of Different Components in Sophorae flos on High Glucose-induced Injury in Human Umbilical Vein Endothelial Cell

An Jinmeng1,Yang Zhonglin1*,Zheng Zhuo1,Xiao Wei2,Wang Zhengzhong2,Huang Wenzhe2,Ding Gang2

(1.State Key laboratory of Natural Products and Functions, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China;2.Kanion Pharmaceutical Co. Ltd.,Nanjing 222002, China)

Objective:To evaluate the protective effects of rutin, quercetin,Flavonoids compounds of Sophorae flos, extract of Sophorae flos on the injured human umbilical vein endothelial cell. Methods:High glucose-induced injury in human umbilical vein endothelial cell, determine cell survival viability by MTT, determine the NO produced in cell supernatant by means of nitrate reductase method. Results:A certain concentration of rutin, quercetin,Flavonoids compounds of Sophorae flos, extract of Sophorae flos can enhance the activity of cell under high glucose condition, inhibit the recession of NO.Conclusion:Rutin and quercetin could be the active ingredient of Sophorae flos.

Rutin; Quercetin; Flavonoids Compounds of Sophorae flos;Extract of Sophorae flos; Human Umbilical Vein Endothelial Cell

2014-12-22

安金蒙(1991-)，女，中國藥科大學碩士研究生，研究方向為中藥制劑學。E-mail：anjinmengcpu@126.com

楊中林(1950-)，女，中國藥科大學教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為中藥炮制與中藥制劑。E-mail：YZL1950@126.com

R285.5

A

1673-2197(2015)10-0027-04

10.11954/ytctyy.201510012