高效液相色譜法測(cè)定不同產(chǎn)地丁香中丁香酚含量研究

張 銳，盧金清，江漢美*，周 坤，徐惠芳

(1.武漢市中醫(yī)醫(yī)院，湖北 武漢 430010；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué) 湖北省藥用植物研發(fā)中心，湖北 武漢 430065)

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高效液相色譜法測(cè)定不同產(chǎn)地丁香中丁香酚含量研究

張 銳1，盧金清2，江漢美2*，周 坤2，徐惠芳1

(1.武漢市中醫(yī)醫(yī)院，湖北 武漢 430010；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué) 湖北省藥用植物研發(fā)中心，湖北 武漢 430065)

目的：采用高效液色譜(HPLC)法對(duì)不同產(chǎn)地丁香中丁香酚的含量進(jìn)行比較研究。方法：采用DIONEX Acclaim120-C18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm)，以甲醇-水(65∶35)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，流速為1.0mL/min。結(jié)果：丁香酚在2.164～10.82μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系：Y=15.999 5X-5.712 2，r=0.999 9；平均加樣回收率為99.93%(RSD=0.06%, n=6)，不同產(chǎn)地丁香中丁香酚的含量有顯著差異，其中以印尼產(chǎn)丁香含量較高，其次為廣東產(chǎn)丁香。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好，可作為丁香中丁香酚含量的測(cè)定方法，為完善丁香質(zhì)量控制體系提供科學(xué)依據(jù)。

丁香；丁香酚；高效液相色譜

丁香(EugeniacaryophyllataThunb.)為桃金娘科丁香的干燥花蕾，習(xí)稱公丁香，主產(chǎn)于坦桑尼亞、馬來(lái)西亞、印度尼西亞等地，我國(guó)自上世紀(jì)50年代開(kāi)始對(duì)丁香進(jìn)行引種栽培，并取得初步成功。丁香為世界名貴香料植物，是一種臨床常用藥物，為我國(guó)傳統(tǒng)進(jìn)口“南藥”之一。丁香酚具有較廣泛的藥理活性，為丁香主要藥效成分，具有解熱、鎮(zhèn)痛、抑菌、麻醉、抗凝、抗腫瘤和促進(jìn)透皮吸收等[2]作用，對(duì)多種牙科疾病均有較好治療效果，此外丁香酚還能清除氧自由基而達(dá)到抗氧化、延緩衰老等[3]作用。文獻(xiàn)[3-4]報(bào)道采用比色法、高效毛細(xì)管電泳法測(cè)定丁香中丁香酚的含量，但普遍存在操作繁瑣、準(zhǔn)確度和靈敏度不高等問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法，以丁香酚為指標(biāo)成分對(duì)不同產(chǎn)地丁香藥材含量進(jìn)行測(cè)定研究。該方法具有操作簡(jiǎn)便、快速、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，為種質(zhì)和產(chǎn)地因素對(duì)丁香藥材質(zhì)量影響的科學(xué)評(píng)價(jià)奠定方法學(xué)基礎(chǔ)，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用丁香藥材提供科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)具體報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

DIONEX-U3000高效液相色譜儀；DIONEX Acclaim120-C18(4.6mm×250mm, 5μm)色譜柱；電子分析天平(CP225D，d=0.01mg)。

1.2 試藥

丁香分別產(chǎn)自印度尼西亞(編號(hào)S1)、廣東(編號(hào)S2)、云南(編號(hào)S3)、廣西(編號(hào)S4)、海南(編號(hào)S5)，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室鑒定為桃金娘科植物丁香(EugeniacaryophyllataThumb.)干燥花蕾；丁香酚對(duì)照品(批號(hào)：110725-201112)，甲醇(色譜純)，其他試劑均為分析純，水為三蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：DIONEX Acclaim120-C18(4.6mm×250mm,5μm) ；流動(dòng)相：甲醇-水(65∶35)；檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，流速為1.0mL/min，柱溫為30℃。

2.2 供試品溶液制備

取丁香藥材粉末(過(guò)三號(hào)篩)0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加乙醇15mL，稱定重量，超聲提取30min，放冷，用乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液以0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.3 對(duì)照品溶液制備

取丁香酚對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，制成丁香酚濃度為1.082mg·mL-1的溶液，即為對(duì)照品溶液。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液、供試品溶液及空白溶劑各10μL，按“2.1”項(xiàng)色譜條件檢測(cè)。結(jié)果表明，丁香酚色譜峰與相鄰峰達(dá)到基線分離，且分離度良好，其他組分無(wú)干擾，理論塔板數(shù)按丁香酚計(jì)算應(yīng)不低于5 000。色譜見(jiàn)圖1、圖2、圖3。

圖1 丁香供試品溶液HPLC色譜

圖2 丁香酚對(duì)照品溶液HPLC色譜

圖3 空白溶劑HPLC色譜

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精密吸取對(duì)照品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積值，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得丁香酚的回歸方程為：Y=15.999 5X-5.712 2, r=0.9999。結(jié)果表明，丁香酚在2.164～10.82μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。見(jiàn)圖4。

圖4 丁香酚標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 精密度試驗(yàn) 取“2.3”項(xiàng)方法制備對(duì)照品溶液5μL，參照“2.1”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定其峰面積，丁香酚峰面積RSD為0.98%。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.6.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一丁香供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件制備供試品溶液，精密吸取5μL，分別于0、3、6、9、12、24h注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積。結(jié)果顯示，丁香酚峰面積RSD為1.17%，表明樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.3 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批丁香樣品5份，每份0.5g，精密稱定，照“2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，精密吸取5μmL，注入色譜儀，記錄峰面積，計(jì)算丁香酚含量的RSD為0.69%。結(jié)果表明，該方法重現(xiàn)性良好。

2.7 加樣回收試驗(yàn)

取已知含量同批樣品粉末6份，每份0.5g，分別加入低、中、高(加入水平依次為80.0%、100.0%、120.0%)3個(gè)水平的丁香酚對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，精密吸取各供試品溶液5μL注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，其結(jié)果見(jiàn)表1。

2.8 丁香酚含量測(cè)定

取不同產(chǎn)地5批丁香樣品約0.5g，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)方法制備樣品溶液5份，平行測(cè)定3次，取平均值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出丁香酚含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 不同產(chǎn)地丁香中丁香酚含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

試驗(yàn)中選擇不同比例的甲醇-水、乙腈-水為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫[5]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以乙腈-水等度洗脫時(shí)間較短，但分離效果較差；甲醇-水進(jìn)行等度洗脫時(shí)間較適中，且分離效果明顯優(yōu)于乙腈-水系統(tǒng)分離效果，調(diào)整后發(fā)現(xiàn)以甲醇-水(65∶35)為流動(dòng)相等度洗脫，在所選定色譜條件下丁香酚色譜峰與其相鄰峰分離度良好，空白溶劑無(wú)干擾，故選擇甲醇-水(65∶35)為流動(dòng)相。

本試驗(yàn)采用乙醇為提取溶媒，結(jié)合超聲提取丁香中丁香酚成分，以HPLC法測(cè)定5個(gè)不同產(chǎn)地丁香中丁香酚含量，結(jié)果表明：不同產(chǎn)地丁香中丁香酚含量存在較大差異，其中以印度尼西亞所產(chǎn)丁香中丁香酚含量較高，海南產(chǎn)丁香中丁香酚含量最低，其他3個(gè)產(chǎn)地丁香中丁香酚含量由高到低依次為廣東、云南和廣西。丁香原產(chǎn)于印度尼西亞，該地區(qū)為熱帶雨林氣候，自上世紀(jì)50年代我國(guó)對(duì)丁香進(jìn)行引種栽培，現(xiàn)在廣東、云南、廣西和海南等地已具一定的種植規(guī)模。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，廣東產(chǎn)丁香與印度尼西亞產(chǎn)丁香的丁香酚含量差異較小，海南產(chǎn)丁香與印度尼西亞所產(chǎn)丁香差異較大，廣東為溫帶海洋氣候，海南為熱帶季風(fēng)氣候，可見(jiàn)不同產(chǎn)區(qū)氣候因素及光照強(qiáng)度、日照長(zhǎng)短等對(duì)植物次生代謝產(chǎn)物的積累存在一定影響。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[S].一部.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:4.

[2] 申云翔.丁香提取物不同極性部位體外抗氧化活性研究[D].洛陽(yáng):河南科技大學(xué),2013.

[3] 胡海清,厲輝,黃嶸.復(fù)方丁香洗劑中丁香酚和苦參堿的含量測(cè)定[J].中南藥學(xué),2004,2(4):216-218.

[4] 黃先敏,伍文聰,吳銀梅,等.高效毛細(xì)管電泳法測(cè)定山茱萸中丁香酚的含量[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(11):5612-5613,5618.

[5] 季光瓊,劉艷菊,王萍,等.HPLC法測(cè)定蒼術(shù)及麩炒蒼術(shù)中5-羥甲基糠醛的含量[J].湖北中醫(yī)雜志,2014,36(2):73-74.

(責(zé)任編輯：李嵐春)

Content Determination of Eugenol inEugeniacaryophyllataThunb. from Different Origin by HPLC

Zhang Rui1,Lu Jinqing2,Jiang Hanmei2*,Zhou Kun2.Xu Huifang1

(1.Chinese Medicine Hospital of Wuhan, WuHan 430010, China;2.Hubei Medicinal Plants R&D Center, Hubei University of Traditional Chinese Medicine, WuHan 430065,China)

Objective:High-performance liquid chromatography(HPLC) was conducted to comparative analysis the content of eugenol Eugenia caryophyllata Thunb. from different origin. Methods:The ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm, 5μm) column was used with the mobile phase of methanol-water (65:35) at the detection wavelength of 280nm and the flow rate was 1.0ml/min. Results:Analysis showed that the linear relationship of eugenol quality and peak areas was in the range of 2.164～10.82μg, the average recovery was 99.93% (RSD=0.06%, n=6).There is a significant difference in the eugenol content of clove in different habitats which the most higher content of eugenol was Indonesia and Guangdong clove followed.Conclusion:The method is simple, reproducible, and can be used in the determination of cloves eugenol content which provide a scientific basis for improving cloves' quality control system.

Clove; Eugenol; HPLC

2015-01-27

張銳(1988-)，女，武漢市中醫(yī)醫(yī)院藥師，研究方向?yàn)橹兴幹苿mail：496372737@qq.com

江漢美(1960-)，女，湖北中醫(yī)藥大學(xué)副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幹苿mail：jianghm-666@163.com

R284

A

1673-2197(2015)12-0036-02

10.11954/ytctyy.201512016