白簕總黃酮、多糖的體外抑菌作用研究

王 艷，石瑛翹，潘育方(廣東藥學(xué)院，廣東 中山 528458)

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白簕總黃酮、多糖的體外抑菌作用研究

王 艷，石瑛翹，潘育方*
(廣東藥學(xué)院，廣東 中山 528458)

目的：研究白簕總黃酮提取液醇洗脫、水洗脫部分和多糖提取部分對(duì)常見(jiàn)菌種的抑菌活性。方法：通過(guò)白簕的總黃酮提取液醇洗脫部分與水洗脫部分、多糖提取物對(duì)枯草桿菌、痢疾桿菌等5種常見(jiàn)臨床細(xì)菌進(jìn)行紙片擴(kuò)散法實(shí)驗(yàn)、試管稀釋法實(shí)驗(yàn)，研究藥物不同成分的抑菌作用。結(jié)果：白簕總黃酮提取液醇洗脫部分對(duì)枯草桿菌、傷寒桿菌的最低抑菌濃度為0.131 3mg/mL，對(duì)痢疾桿菌、大腸桿菌、金葡萄球菌的最低抑菌濃度為0.262 5mg/mL;白簕總黃酮水洗脫部分對(duì)傷寒桿菌、金葡萄球菌、痢疾桿菌、大腸桿菌、枯草桿菌的最低抑菌濃度均為0.296 0mg/mL。白簕多糖的體外抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)雜菌，未能探究出結(jié)果。結(jié)論：白簕總黃酮提取液醇洗脫部分抑菌作用強(qiáng)于水洗脫部分，多糖無(wú)明顯抗菌作用。

白簕;總黃酮；多糖；體外抑菌；最低抑菌濃度

白簕(AcanthopanaxTrifoliatus)又稱鵝掌簕、三葉五加、三加皮、苦刺，為五加科攀援狀灌木。白簕味苦，性辛、涼，氣微香，具有疏風(fēng)、消腫、止癢等功效，此外還具有多種食療功效[1]。白霸嫩葉枝梢中含有豐富的氨基酸和人體必需的礦物質(zhì)元素，氨基酸總含量達(dá)20.8%，其中谷氨酸含量最高，具有健腦和增強(qiáng)腦細(xì)胞呼吸作用的功能。白簕中含有黃酮、皂苷、香豆素、多糖、強(qiáng)心苷等藥用成分，薄層色譜結(jié)果顯示白簕總黃酮中含蘆丁、金絲桃苷等黃酮醇單體。白簕作為蔬菜和藥材有著悠久歷史，其體外抑菌作用集中在對(duì)白簕黃酮的研究[2-4]。近年來(lái)，越來(lái)越多的多糖被發(fā)現(xiàn)有抑菌活性。本試驗(yàn)采用瓊脂擴(kuò)散法定性研究中藥白簕總黃酮兩種洗脫物和粗多糖對(duì)臨床常用菌種抑菌活性的強(qiáng)弱；采用連續(xù)稀釋法定量它們的抑菌濃度(MIC)、最低殺菌濃度(MBC)；評(píng)價(jià)白簕的藥用價(jià)值，為深入開(kāi)發(fā)利用白簕提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與藥品

UV-1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)；HPD-600(極性)大孔樹(shù)脂(滄州寶恩吸附材料科技有限公司)；AB-8(弱極性)大孔樹(shù)脂(滄州寶恩吸附材料科技有限公司)；LDZX-50FAS 型立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)；ZHJH-C1209C 型超凈工作臺(tái)(上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司)；白簕葉、白簕莖(廣東省恩平市大人山簕菜茶)均經(jīng)廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院中藥資源系劉基柱副教授鑒定為五加屬，標(biāo)本保存于廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院標(biāo)本室；木瓜蛋白酶(上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司)；注射用青霉素鈉(河南新鄉(xiāng)華星藥廠，國(guó)藥準(zhǔn)字H41020817)；注射用硫酸鏈霉素(深圳華藥南方制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20054140)；其余均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)菌

傷寒桿菌、痢疾桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌均由廣東藥學(xué)院化工學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供，經(jīng)分離培養(yǎng)，無(wú)污染。

1.3 白簕總黃酮的制備

經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)后，確定采用回流提取法從白簕葉中提取黃酮。稱取白簕葉粉末2g，提取白簕葉總黃酮的方法為固液比1∶45，提取液為濃度50%的乙醇，溫度為50℃，采用回流法提取，共提取2次，每次提取3h。提取液經(jīng)過(guò)HPD-600 大孔樹(shù)脂洗脫提純，裝柱的大孔樹(shù)脂為600mL，上樣量為300mg；上樣后待大孔樹(shù)脂吸附12h 左右；采用1滴/8s的流速，先用水進(jìn)行洗脫，待洗脫下的溶液為接近無(wú)色時(shí)，分別用30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇，直至洗脫下的溶液呈無(wú)色。分別收集、揮去部分溶劑后，記錄體積。紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)得白簕總黃酮純化液水洗脫部分濃度為1.184mg/mL，醇洗脫部分濃度為0.525mg/mL?？傸S酮提取物于4℃冰箱中保存。

1.4 白簕多糖的制備

采用熱水浸提法，稱取白簕莖粉末500g，加入40倍水，80℃恒溫水浴鍋中浸提6h，提取多糖后，去除藥渣，最后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器55℃下濃縮至原來(lái)溶液體積的1/10。酶法除蛋白，加入2%木瓜蛋白酶，50℃水浴4h，加熱到100℃，10s滅酶，得酶解液，置于3 500r/min離心10min去蛋白。取上層清液，按照4∶1的比例加入95%乙醇進(jìn)行醇沉，置于冰箱4℃中過(guò)夜。第2天 3 500r/min離心10min，棄上清液，合并沉淀，于60℃烘箱中烘干，即得到白簕粗多糖。粗多糖于干燥器中常溫保存。

1.5 抑菌實(shí)驗(yàn)

采用紙片擴(kuò)散瓊脂法:吸取有不同藥液的圓濾紙片(直徑6mm，每片吸取黃酮藥液500μL，青霉素33.3μL，鏈霉素25μL；根據(jù)菌種類(lèi)型選擇陽(yáng)性對(duì)照藥液)貼于MH瓊脂平板表面，37℃恒溫箱培養(yǎng)16～18h。重復(fù)4次，培養(yǎng)完成后用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑(精確到0.1mm)，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

試管稀釋法：取10支無(wú)菌小試管排于試管架上，編號(hào)，如表1加入后，置于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)16h。凡澄清透明的的管判定為無(wú)菌生長(zhǎng)，以無(wú)菌生長(zhǎng)的最高藥物稀釋度為該藥液對(duì)細(xì)菌的MIC。從上述無(wú)菌生長(zhǎng)的試管中挑取培養(yǎng)液，劃線接種于MH肉湯瓊脂平板上，37℃恒溫箱培養(yǎng)24h。平板上無(wú)菌落說(shuō)明對(duì)應(yīng)管中細(xì)菌全被殺死，重復(fù)3次，以無(wú)菌生長(zhǎng)的最高藥物稀釋濃度為該藥對(duì)細(xì)菌的MBC。試管稀釋法見(jiàn)表1。

表1 試管稀釋法

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 白簕葉不同成分紙片瓊脂擴(kuò)散法抑菌結(jié)果

白簕葉總黃酮醇洗脫部分對(duì)枯草桿菌的抑菌效果比水洗脫部分強(qiáng)，但2種提取物都比陽(yáng)性對(duì)照藥液的抑菌作用弱。白簕多糖紙片無(wú)抑菌作用。 紙片擴(kuò)散法結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 白簕葉不同成分紙片瓊脂擴(kuò)散法抑菌結(jié)果

注：與抗生素比較，*P<0.01。

2.2 白簕總黃酮醇洗脫部分試管稀釋法抑菌結(jié)果

白簕葉總黃酮醇洗脫部分與白簕葉總黃酮水洗脫部分對(duì)各種供試菌液都有不同程度的抑菌作用，并且這種抑菌作用隨著黃酮提取液濃度的升高而增強(qiáng)。詳見(jiàn)表3、表4。

2.3 白簕總黃酮水和醇洗脫部分MBC

白簕葉總黃酮水洗脫部分對(duì)金葡萄球菌、傷寒桿菌、枯草桿菌、痢疾桿菌、大腸桿菌的最低殺菌濃度均為0.592mg/mL;白簕總黃酮醇洗脫部分對(duì)傷寒桿菌、痢疾桿菌、大腸桿菌的最低殺菌濃度均為0.262 5mg/mL，對(duì)枯草桿菌的最低殺菌濃度為0.131 3mg/mL。總黃銅醇洗脫部分對(duì)金葡萄菌未體現(xiàn)出最低殺菌濃度，結(jié)果見(jiàn)表5。

表3 白簕總黃酮醇洗脫部分試管稀釋法抑菌結(jié)果

注:“+”表示細(xì)菌生長(zhǎng)，“-”表示細(xì)菌未生長(zhǎng)。

表4 白簕總黃酮水洗脫部分試管稀釋法抑菌結(jié)果

注:“+”表示細(xì)菌生長(zhǎng)，“-”表示細(xì)菌未生長(zhǎng)。

表5 白簕總黃酮水和醇洗脫部分MBC (mg/mL)

注：-表示MIC最高稀釋濃度有細(xì)菌生長(zhǎng)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用體外抗菌試驗(yàn)測(cè)定白簕總黃酮醇洗脫部分和水洗脫部分、多糖的抑菌作用強(qiáng)弱。該方法簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)，是很便捷的初步篩選方法，但抗菌試驗(yàn)的結(jié)果易受外界因素影響。為了避免紙片瓊脂擴(kuò)散法抑菌物濃度不同對(duì)擴(kuò)散的影響和比濁法受中藥顏色的影響等因素，本實(shí)驗(yàn)采用紙片瓊脂擴(kuò)散法和試管稀釋法同時(shí)進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)研究[5-6]。紙片法通過(guò)不斷將藥物水分揮發(fā)，增大紙片載藥量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果最終有抑菌圈出現(xiàn)，但與試管稀釋法對(duì)比，其結(jié)果有出入，原因?yàn)榧埰d藥量達(dá)到飽和，載藥量達(dá)不到設(shè)計(jì)的載藥量[7]。本抑菌實(shí)驗(yàn)誤差來(lái)源主要有：①方法誤差，選用紙片法在試驗(yàn)過(guò)程上受紙片的質(zhì)量、紙片含藥的準(zhǔn)確性和均勻性影響較大，這是導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)出現(xiàn)誤差的最重要因素；②比濁法容易受藥物顏色的影響，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)出現(xiàn)誤差。

本實(shí)驗(yàn)在對(duì)白簕多糖進(jìn)行抑菌研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，白簕多糖樣品含有雜菌。本研究嚴(yán)格按照微生物實(shí)驗(yàn)操作規(guī)定，經(jīng)過(guò)4次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，此現(xiàn)象仍舊存在。將白簕多糖進(jìn)行試管稀釋法實(shí)驗(yàn)后，肉眼觀察均發(fā)現(xiàn)每組試管都呈混濁狀態(tài)，將每組前3支試管分別在固體培養(yǎng)基上劃線進(jìn)行分離培養(yǎng)，結(jié)果通過(guò)肉眼可直接發(fā)現(xiàn)固體培養(yǎng)基上均長(zhǎng)滿細(xì)菌，且可明確看到所長(zhǎng)的菌非原來(lái)所培養(yǎng)的細(xì)菌種類(lèi)。將白簕多糖樣品單獨(dú)滴于在平板固體培養(yǎng)基上，經(jīng)24h培養(yǎng)后，培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出細(xì)菌，證明樣品本身含有細(xì)菌。白簕多糖出現(xiàn)此結(jié)果可以排除體外抗菌實(shí)驗(yàn)的操作問(wèn)題。根據(jù)實(shí)驗(yàn)探究結(jié)果和近代多糖研究方法進(jìn)展[12]，白簕多糖體外抑菌實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)此結(jié)果的因素可能有以下4點(diǎn)：①在提取白簕的過(guò)程中，白簕多糖受到外界細(xì)菌的污染，且提取溫度只有80℃，未達(dá)到100℃，不能滿足滅菌規(guī)定的溫度；酶法除蛋白過(guò)程中溫度雖達(dá)100℃，時(shí)間卻只有10s，不足以將細(xì)菌殺滅，導(dǎo)致在體外抗菌實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)雜菌；②藥材自身存在細(xì)菌；③濾紙片法采用倒置培養(yǎng)，培養(yǎng)基表面的水分能滿足細(xì)菌的生長(zhǎng)，而多糖作為大分子擴(kuò)散所需水分多，培養(yǎng)基表面的水分不能讓多糖擴(kuò)散，使其留在紙片上，不能對(duì)微生物生長(zhǎng)產(chǎn)生作用；④瓊脂培養(yǎng)基可能對(duì)多糖分子有一定的吸附作用，多糖不能擺脫而擴(kuò)散不好。所以，白簕多糖的體外抗菌實(shí)驗(yàn)仍舊需要進(jìn)行探究。

由紙片擴(kuò)散法和試管稀釋法實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，白簕總黃酮的醇洗脫物與水洗脫物皆對(duì)實(shí)驗(yàn)的5種細(xì)菌有抑菌活性，但皆遠(yuǎn)弱于抗生素的抑菌活性。是否用大劑量的藥材就能發(fā)揮相應(yīng)的效果呢？因沒(méi)有繼續(xù)研究隨著濃度的增大，其抑菌能力的強(qiáng)弱變化，這需要今后進(jìn)一步深入研究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果尚不能完全代表白簕總黃酮對(duì)其他致病菌有抑制作用，因此白簕總黃酮對(duì)其他致病菌有無(wú)抑制作用有待于進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯：宋勇剛)

Research of Antimicrobial Test about Flavonoids and Polysaccharide fromAcanthopanaxTrifoliatus

Wang Yan，Shi Yingqiao， Pan Yufang*
(Guangdong Pharmaceutical University, Zhongshan 528458, China)

Objective:To research the bacteriostatic action of the polysaccharide and flavonoids extract ofAcanthopanaxTrifoliatus, which were eluted with alcohol, water on the common strains.Methods:This experiment is through used flavonoids extract alcohol elution parts, water elution from Acanthopanax Trifoliatus and polysaccharide extract to conduct disc diffusion method and test tube dilution method of common clinical bacteria, studying the bacteriostatic action of different ingredients.Results:AcanthopanaxTrifoliatusflavonoids extract alcohol elution ofB.subtilisandSalmonellatyphiminimal inhibitory concentrations (mic) was 0.131 3mg/mL, but 0.262 5 mg/mL forSh.dysenteriae,Escherichiacoli(E.coli),S.aureus; Water elution part of total flavonoids minimal inhibitory concentrations (mic) were 0.296 0 mg/mL.Conclusion:Flavonoids extract alcohol elution, water elution part ofAcanthopanaxTrifoliatushad bacteriostatic action for a variety of pathogenic bacteria in clinical.

AcanthopanaxTrifoliatus; Total Flavonoids; Polysaccharide; Antimicrobial Test; Minimal Inhibitory Concentration

2015-01-06

王艷(1981-)，女，廣東藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)樯锘钚晕镔|(zhì)。

潘育方(1966-)，男，廣東藥學(xué)院教授，研究方向?yàn)樘烊恢参锷锘钚浴-mail: 279864335@qq.com

R285.5

A

1673-2197(2015)11-0037-03

10.11954/ytctyy.201511015