兩種含苦參中成藥中主要黃酮類成分定性鑒別方法研究

陳錫欣，黃 榮,劉 怡,陳 磊,2*

(1.廣東藥學(xué)院 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006； 2.國家中醫(yī)藥管理局 中藥數(shù)字化質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù)重點(diǎn)研究室，廣東 廣州 510006; 3.南方醫(yī)科大學(xué) 中醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510515)

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兩種含苦參中成藥中主要黃酮類成分定性鑒別方法研究

陳錫欣1，黃 榮1,劉 怡3,陳 磊1,2*

(1.廣東藥學(xué)院 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006； 2.國家中醫(yī)藥管理局 中藥數(shù)字化質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù)重點(diǎn)研究室，廣東 廣州 510006; 3.南方醫(yī)科大學(xué) 中醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510515)

目的：首次探索建立含苦參中成藥(當(dāng)歸苦參丸和四味土木香散)中黃酮類成分的定性鑒別方法。方法：采用薄層GF254硅膠板，鑒別三葉豆紫檀苷成分：以石油醚-乙酸乙酯-甲醇(5∶7∶1)溶液為展開劑，噴以10%的硫酸乙醇溶液，揮干，再噴以10%的磷鉬酸溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光下檢視各樣品與三葉豆紫檀苷標(biāo)準(zhǔn)品比較結(jié)果；鑒別苦參酮成分：以石油醚-乙酸乙酯-甲醇(5∶5∶1)溶液為展開劑，揮干，置紫外光(365nm)下檢視各樣品與苦參酮標(biāo)準(zhǔn)品比較結(jié)果。結(jié)果：建立苦參中黃酮類成分三葉豆紫檀苷和苦參酮的薄層鑒別方法，在與對(duì)照品斑點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的位置上，供試品色譜顯示相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性無干擾。結(jié)論：該研究所建立的方法重復(fù)性高，操作簡便，可用于薄層鑒別當(dāng)歸苦參丸和四味土木香散，可為其他含苦參中成藥的定性鑒別方法提供參考。

四味土木香散；當(dāng)歸苦參丸；苦參；薄層鑒別；黃酮類成分

苦參為豆科槐屬植物苦參(SophoraFlavescensAit.)的干燥根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。苦參性寒，味苦，具有清熱燥濕、殺蟲、利尿的功效[1]。

苦參主要含有生物堿和黃酮兩大類化學(xué)成分，且兩類成分含量基本相當(dāng)[2]。近年來，國內(nèi)外研究不斷發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)，苦參生物堿和黃酮兩類成分具有較多相同的藥理活性，如抗炎、抗腫瘤等[3-6]。但目前《中國藥典》及各級(jí)藥品標(biāo)準(zhǔn)仍僅以缺乏專屬性的生物堿[7]作為其藥材、飲片及相關(guān)制劑的質(zhì)量控制指標(biāo)，不利于苦參藥用資源的綜合利用與開發(fā)，需進(jìn)一步研究將苦參黃酮類成分納入其質(zhì)量控制體系。

經(jīng)文獻(xiàn)調(diào)研，結(jié)合前期工作，研究發(fā)現(xiàn)三葉豆紫檀苷和苦參酮為苦參中含量較高的兩個(gè)黃酮類成分[8-9]，并已被證實(shí)有重要的藥理活性[10-12]。當(dāng)歸苦參丸、四味土木香散均為以苦參為主藥，且以原粉形式入藥的中藥制劑。本文以當(dāng)歸苦參丸、四味土木香散兩個(gè)制劑為例，首次建立薄層色譜方法，鑒別其中三葉豆紫檀苷和苦參酮等主要苦參黃酮成分，為含苦參中藥制劑中苦參黃酮類成分的定性鑒別提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，WD-9403C型紫外分析儀(北京市六一儀器廠)，SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城工貿(mào)有限公司)，AY-120型精密電子天平(日本島津)，PS-100超聲清洗器。

1.2 試藥

苦參(廣州市藥材公司中藥飲片廠，YPA4G0002)；當(dāng)歸、山柰、土木香、珍珠桿，均購自河北安國中藥材市場，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)王春國講師鑒定均為正品。當(dāng)歸苦參丸(三批均購自北京同仁堂科技發(fā)展有限公司制藥廠)。

四味土木香散(按2010版《中國藥典》方法制備)、苦參酮對(duì)照品、三葉豆紫檀苷對(duì)照品均為自制[13]，經(jīng)測試均符合定性鑒別要求。

1.3 方法

1.3.1 供試品溶液制備 鑒別三葉豆紫檀苷：取當(dāng)歸苦參丸6g，剪碎，置500mL圓底燒瓶中，每次加入5倍量80%的乙醇，加熱回流提取2次，第1次1h，第2次30min，合并2次提取液，進(jìn)行抽濾，將濾液濃縮至適量，作為當(dāng)歸苦參丸供試品；另取土木香10g、苦參10g、珍珠稈5g、山奈2.5g，按處方工藝制備四味土木香散，同“當(dāng)歸苦參丸供試品”法，制得四味土木香散供試品溶液。

鑒別苦參酮：取當(dāng)歸苦參丸6g，置500mL圓底燒瓶中，每次加入五倍量80%的乙醇，加熱回流提取2次，第1次1h，第2次30min，合并2次提取液，進(jìn)行抽濾，將濾液濃縮至適量，用同倍量的乙酸乙酯萃取2次，取乙酸乙酯層合并，濃縮至適量，作為當(dāng)歸苦參丸供試品溶液。另取土木香10g、苦參10g、珍珠稈5g、山奈2.5g，按處方工藝制備四味土木香散，同“當(dāng)歸苦參丸供試品”法，制得四味土木香散供試品溶液。

1.3.2 對(duì)照品、對(duì)照藥材溶液制備 取苦參藥材6g，剪碎，置500mL圓底燒瓶中，每次加入5倍量80%的乙醇，加熱回流提取2次，其他按“1.3.1”項(xiàng)供試品溶液制備方法，制備苦參對(duì)照藥材溶液；取苦參酮對(duì)照品，加甲醇制備濃度為1mg·mL-1的苦參酮對(duì)照品溶液；取三葉豆紫檀苷對(duì)照品加乙醇-丙酮(1∶1)溶液，超聲至全部溶解，制備濃度為1mg·mL-1的三葉豆紫檀苷對(duì)照品溶液。

1.3.3 陰性對(duì)照溶液制備 取當(dāng)歸藥材6g，按當(dāng)歸苦參丸制劑工藝，制備不含苦參藥材的當(dāng)歸苦參丸陰性對(duì)照溶液；另取土木香10g、珍珠稈5g、山奈2.5g，按四味土木香散制劑工藝，制備不含苦參藥材的四味土木香散陰性對(duì)照溶液。

2 結(jié)果

2.1 三葉豆紫檀苷的鑒別

2.1.1 當(dāng)歸苦參丸鑒別 按薄層色譜法，吸取上述供試品溶液、對(duì)照藥材溶液、對(duì)照品溶液及陰性對(duì)照溶液，各1μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，于層析缸中上行展開，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇(5∶7∶1)為展開劑展開，取出揮干，噴以10%的硫酸乙醇溶液，揮干，再噴以10%的磷鉬酸溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光下檢視。見圖1。

2.1.2 四味土木香散鑒別 按薄層色譜法，吸取上述供試品溶液、對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液及陽性對(duì)照溶液，各1μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，于層析缸中上行展開，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇(5∶7∶1)為展開劑展開，取出揮干，噴以10%的硫酸乙醇溶液，揮干，再噴以10%的磷鉬酸溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光下檢視。見圖2。

圖1 當(dāng)歸苦參丸中三葉豆紫檀苷薄層鑒別色譜

圖2 四味土木香散中三葉豆紫檀苷薄層鑒別色譜

2.1.3 苦參酮鑒別 當(dāng)歸苦參丸：按薄層色譜法，吸取上述供試品溶液、對(duì)照藥材溶液、對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液以及陽性對(duì)照溶液各1μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，于層析缸中上行展開，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇(5∶7∶1)為展開劑展開，取出揮干，置紫外光(365nm)下檢視。見圖3。

圖3 當(dāng)歸苦參丸中苦參酮薄層鑒別色譜

四味土木香散鑒別：按薄層色譜法，吸取上述供試品溶液、對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液以及陽性對(duì)照溶液各1μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，于層析缸中上行展開，取出揮干，置紫外光(365nm)下檢視。見圖4。

圖4 四味土木香散苦參酮薄層鑒別色譜

3 討論

相較于生物堿，苦參黃酮類成分研究起步較晚。近年來，有多篇研究文獻(xiàn)報(bào)道顯示，苦參黃酮成分的抗菌、抗腫瘤作用強(qiáng)于其生物堿成分[14-16]；同時(shí)，發(fā)現(xiàn)苦參黃酮成分新的功能及適應(yīng)證，可治療阿爾茨海默病、抗糖尿病主要并發(fā)癥(糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病)等[17-19]。山豆根、苦豆子等同屬中藥，具有與苦參較為相似的生物堿類成分，但存在明顯不同的臨床應(yīng)用。但目前對(duì)于苦參的研究，可將兩類成分割裂出來，在《中國藥典》及各級(jí)藥品標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)其生物堿類成分進(jìn)行質(zhì)量要求，亟需對(duì)苦參質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行完善。

近年來，對(duì)國內(nèi)苦參資源和市場跟蹤調(diào)查發(fā)現(xiàn)，苦參的年用量為6 000～7 000噸，目前主要集中于生物堿部位及成分?？鄥⑺幉慕?jīng)水提取生物堿后，含有大量黃酮類成分的藥渣被廢棄，藥效成分得不到合理利用，造成了藥用資源的巨大浪費(fèi)。深入研究苦參黃酮成分的藥理作用，建立更加全面的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，有利于解決中藥苦參資源浪費(fèi)的問題。

當(dāng)歸苦參丸和四味土木香散組方分別有2味和4味中藥，其成分涵蓋植物化學(xué)中多種成分，通過對(duì)苦參黃酮的薄層鑒別研究，確定了苦參酮和三葉豆紫檀苷的薄層鑒別方法，分離度好，陰性無干擾。實(shí)驗(yàn)過程中，分別采用6種不同的展開劑展開：二氯甲烷-甲醇(10∶1)、氯仿-甲醇-甲酸(5∶1∶0.5)、石油醚-乙酸乙酯-甲醇(5∶5∶1)、石油醚-乙酸乙酯-甲醇(5∶7∶1)、石油醚-乙酸乙酯-甲醇(5∶8∶1)、石油醚-乙酸乙酯-甲醇(5∶9∶1)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：三葉豆紫檀苷以石油醚-乙酸乙酯-甲醇(5∶7∶1)展開，成點(diǎn)性較好，斑點(diǎn)清晰無干擾；苦參酮以石油醚-乙酸乙酯-甲醇(5∶5∶1)展開，系統(tǒng)較為理想。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)中，三葉豆紫檀苷在未噴顯色劑前，紫外分光光度法在365nm處為暗熒光斑點(diǎn)，噴以10%的硫酸乙醇加熱顯色后，日光檢視為棕色斑點(diǎn)，再以紫外光365nm檢視，出現(xiàn)明顯的暗黃色斑點(diǎn)，最后噴以10%的磷鉬酸溶液，日光下斑點(diǎn)更清晰。苦參酮在未噴顯色劑前，紫外分光光度法在365nm處為藍(lán)色熒光，噴以10%的硫酸乙醇加熱顯色后，日光下檢視是暗黃色斑點(diǎn)，再用365nm檢視，出現(xiàn)強(qiáng)暗斑點(diǎn)，一般在未染色前紫外檢視可清晰辨認(rèn)苦參酮斑點(diǎn)。

本試驗(yàn)對(duì)多批當(dāng)歸苦參丸和四味土木香散供試品薄層色譜鑒別環(huán)境進(jìn)行考察，結(jié)果顯示：在溫度15～30℃、相對(duì)濕度20%～60%條件下，供試品色譜中主要斑點(diǎn)的分離度均較好；穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，樣品在24h內(nèi)薄層鑒別，供試品色譜中主要斑點(diǎn)的分離度較好；重復(fù)性試驗(yàn)表明，該方法重復(fù)性良好。

綜上所述，本研究建立了苦參中黃酮類成分三葉豆紫檀苷和苦參酮的薄層鑒別方法，在與對(duì)照品斑點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的位置上，供試品色譜顯示相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性無干擾。該研究所建立的方法重復(fù)性高，操作簡便，可用于薄層鑒別當(dāng)歸苦參丸和四味土木香散，可為其他含苦參中成藥的定性鑒別提供參考。

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(責(zé)任編輯：李嵐春)

Study on TLC Identification for Flavonoid Compounds in Two Traditional Chinese Medicine Patent Prescriptions Containing withSophoraFlavescens

Chen Xixin1, Huang Rong1, Liu Yi3, Chen Lei1,2*

(1.College of Traditional Chinese Medicine, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China; 2.Key laboratory of Traditional Chinese Medicine Digital Quality Evaluation on The Technology, Chinese State Administration of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China; 3.College of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangdong 510515,China)

Objective:To establish thin layer distinction method for flavonoid compounds in Traditional Chinese Medicine (TCM) patent prescriptions containing withSophoraFlavescensflavonoid compounds.Methods:Using the silica GF254 thin layer plate. Trifolirhizin identification: used petroleum-ether-ethyl acetate-methanol (5∶7∶1) as the developing solvent, sprayed with 10% sulfuric acid in ethanol, evaporated to dryness, and then sprayed with 10% phosphomolybdic acid solution, heated the silica plate to spot the color clear, viewed the results of the sample comparing with trifolirhizin under the sunlight; Kurarinone identification: used petroleum-ether-ethyl acetate-methanol (5∶5∶1) as the developing solvent, evaporated to dryness, view the results of the sample comparing with Kurarinone standard under the UV (365nm) lamp.Results:Established a TLC identification method for Trifolirhizin and Kurarinone ofSophoraFlavescens, in the chromatogram, comparing with the reference spot corresponding position was the same color of the spots, and negative non-interference.Conclusion:The method was repeatable and simple, could be used for the TLC identification of Danggui Kushen pills and Siwei Tumuxiang powder, and also provided a reference for the other TCM patent prescriptions containing with Sophora flavescens flavonoid compounds.

Siwei Tumuxiang Powder;Danggui Kushen Pills;SophoraFlavescensAit.; TLC; Flavonoid Compounds

2015-08-21

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81303193、81403063)；南方醫(yī)科大學(xué)青年科技人員培育項(xiàng)目(B1012115)

陳錫欣(1989-)，男，廣東藥學(xué)院碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幏治龌瘜W(xué)與代謝。E-mail：harry173net@hotmail.com

陳磊(1981-)，男，博士，廣東藥學(xué)院副教授，研究方向?yàn)橹兴幏治龌瘜W(xué)與代謝。E-mail：chenlei0080@163.com

R284

A

1673-2197(2015)20-0000-04

10.11954/ytctyy.201520015