HPLC法同時(shí)測定普樂安片中槲皮素和山奈素含量

單麗芳 ，孫錦帆，曾 鑫，袁 彩，張 林 ，高 天

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610075;2.楚雄老撥云堂藥業(yè)股份有限公司，云南 楚雄 675000； 3.巧家縣中醫(yī)院，云南 昭通 654600;4.成都中醫(yī)藥大學(xué) 附屬醫(yī)院，四川 成都 610072)

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HPLC法同時(shí)測定普樂安片中槲皮素和山奈素含量

單麗芳1，孫錦帆2*，曾 鑫3，袁 彩1，張 林1，高 天4

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610075;2.楚雄老撥云堂藥業(yè)股份有限公司，云南 楚雄 675000； 3.巧家縣中醫(yī)院，云南 昭通 654600;4.成都中醫(yī)藥大學(xué) 附屬醫(yī)院，四川 成都 610072)

目的：建立普樂安片中槲皮素和山奈素的含量測定方法。方法：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇-0.4%磷酸溶液(50∶50)為流動(dòng)相，檢測波長為360nm。理論塔板數(shù)按槲皮素峰計(jì)算應(yīng)不低于2 500。結(jié)果：槲皮素在0.029～0.290μg質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，與主峰面積積分值呈良好線性關(guān)系，r=0.999 8，平均回收率為98.40%，RSD值為0.332%；山奈素在0.056 38～0.563 80μg質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，與主峰面積積分值呈良好線性關(guān)系，r=0.999 6，平均回收率為98.31%，RSD值為0.386%。結(jié)論：HPLC法測定普樂安片中槲皮素和山奈素，靈敏、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可用于其質(zhì)量控制。

普樂安片；槲皮素；山奈素；HPLC；含量測定

普樂安片為薄膜衣片，除去包衣后，外表呈黃色或棕黃色，味甜、微澀。其主要成分為油菜花花粉，可補(bǔ)腎固本，用于腎氣不固所致的腰膝酸軟，尿后余瀝或失禁及慢性前列腺炎、前列腺增生的治療[1]，可作為慢性前列腺炎的首選藥物。藥典以測定槲皮素和山奈素的含量控制該制劑的主要成分之一油菜花粉的含量。曾經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道用HPLC測定普樂安片中槲皮素的含量[2]，但很少有兩者同時(shí)測定的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法同時(shí)測定普樂安片中槲皮素和山奈素，為有效控制該藥品質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器、試藥與試劑

1.1 儀器

島津2010型液相色譜儀(自動(dòng)進(jìn)樣器、紫外檢測器、恒溫柱溫箱)；安捷倫色譜柱XDB-C18(4.6mm×250mm,5μm)；萬分之一電子天平(Precisa92SM-202A)；AS10200A數(shù)控超聲儀(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。

1.2 試藥與試劑

槲皮素對照品(來源：中國食品藥品檢定研究院，批號：100081-200406，純度97.3%)；山奈素對照品(來源：中國食品藥品檢定研究院，批號：110861-200808，純度95.9%)；甲醇(美國Fisher色譜純)、磷酸(色譜純)，水為重蒸水，其他試劑均為分析純。樣品：楚雄老撥云堂藥業(yè)有限公司產(chǎn)品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑,以甲醇-0.4%磷酸溶液(50∶50)為流動(dòng)相，檢測波長為360nm，理論塔板數(shù)按槲皮素峰計(jì)算應(yīng)不低于2 500，體積流量為1.0mL/min，柱溫為25℃，進(jìn)樣量為10μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 槲皮素、山奈素混合對照品溶液制備 取槲皮素對照品、山奈素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL分別含12μg、25μg對照樣品的混合溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液制備 取干燥至恒重的供試品，研細(xì)，取約0.6g，精密稱定，加25%鹽酸-甲醇(1∶6)混合溶液40mL，于80℃下加熱回流30min，迅速冷卻至室溫，移至50mL容量瓶中，用甲醇5mL洗滌回流瓶，洗液并入同一量瓶中并加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對照液制備 按照處方比例稱取除槲皮素、山奈素外的其余成分，按照普樂安片的制備工藝和供試品溶液制備方法制成陰性對照液。

2.3 專屬性試驗(yàn)

按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別取槲皮素、山奈素混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照液進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。主峰與其相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，且各組分互不干擾，陰性對照在相應(yīng)位置上未見色譜峰，本方法專屬性良好。

圖1 陰性對照色譜

圖2 槲皮素、山奈素對照品色譜

圖3 普樂安片樣品色譜

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取槲皮素對照品溶液(0.029 0mg·mL-1)適量，用甲醇稀釋成0.002 9mg·mL-1、0.005 8mg·mL-1、0.008 7mg·mL-1、0.011 6mg·mL-1、0.014 5 mg·mL-1、0.017 4mg·mL-1、0.020 3mg·mL-1、0.023 2mg·mL-1、0.026 1mg·mL-1、0.029 0mg·mL-1的槲皮素對照品溶液；同法精密吸取山奈素對照品溶液(0.056 380mg·mL-1)，用甲醇稀釋成0.005 6380mg·mL-1、0.011 276mg·mL-1、0.016 914mg·mL-1、0.022 552mg·mL-1、0.028 190mg·mL-1、0.033 828mg·mL-1、0.039 466mg·mL-1、0.045 104mg·mL-1、0.050 742mg·mL-1、0.056 380mg·mL-1的山奈素對照品溶液，按照“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖及峰面積積分值。以峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)，以濃度(X)為橫坐標(biāo)，結(jié)果表明槲皮素的回歸方程為Y=44 683 097.18X-1 661.8，R=0.999 8，在0.029 00～0.290 00μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系；山奈素的回歸方程為Y=45 625 759.19X-3 157.9，R=0.999 6，在0.056 38～0.563 80μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對照品溶液10μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積積分值。計(jì)算得槲皮素的RSD值為0.418%，山奈素的RSD值為0.343%。結(jié)果表明儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試溶液，取同一樣品溶液(批號：20130103)分別于放置0、2、4、8、14h后進(jìn)行測定，計(jì)算得槲皮素峰面積積分RSD值為0.364 4%，山奈素峰面積積分RSD值為0.161 3%，結(jié)果表明本品在14h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(批號：20130103)樣品6份，精密稱定，按照“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算每片藥中槲皮素和山奈素的含量。結(jié)果測得平均每片普樂安片含槲皮素0.313mg、山奈素0.903mg，槲皮素含量RSD值為0.535%、山奈素RSD值為0.329%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 回收率試驗(yàn)

取6份已知含量的樣品加入一定量的槲皮素、山奈素對照品，按照“ 2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定。結(jié)果表明，槲皮素對照品平均回收率為98.40%，RSD值為0.332%；山奈素對照品平均回收率為98.31%，RSD值為0.386%。見表1、表2。

表1 槲皮素對照品回收率

2.9 樣品測定

取6批樣品，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測定，記錄峰面積。根據(jù)含量測定結(jié)果，普樂安片中槲皮素和山奈素總量均超過1.000mg。表明該6批普樂安片中槲皮素和山奈素含量符合藥典規(guī)定，均為合格產(chǎn)品。

表2 山奈素對照品回收率

表3 樣品中槲皮素和山奈素含量

3 討論

3.1 流動(dòng)相選擇

本研究首先采用甲醇-0.4%磷酸溶液(55∶45)作為流動(dòng)相[2]，槲皮素色譜峰能較好分離，但山奈素峰形欠佳，分離效果不好，后改用以甲醇-0.4%磷酸溶液(50∶50)為流動(dòng)相。

3.2 提取方式選擇

槲皮素、山奈素屬于黃酮類成分，主要以苷的形式存在于油菜花粉中[3]。在實(shí)驗(yàn)過程中，對溫浸、超聲、回流三種提取方法進(jìn)行比較，結(jié)果顯示溫浸、超聲提取含量均較低，回流提取較為完全。由于槲皮素、山奈素在高溫、過酸的情況下會被破壞，在研究中采用25%鹽酸溶液-甲醇的混合溶液進(jìn)行提取[4]。采用25%鹽酸溶液-甲醇(1∶4)、25%鹽酸溶液-甲醇(1∶6)分別于80℃、100℃回流20、30、50min，結(jié)果顯示采用25%鹽酸溶液-甲醇(1∶6)、80℃加熱回流30min提取效果最好。

本研究采用HPLC 法同時(shí)測定普樂安片中槲皮素和山奈素含量，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性、專屬性均較好，可作為普樂安片中槲皮素和山奈素含量的定量分析方法。

[1] 中華人民共和國衛(wèi)生部.中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1964.

[2] 周利章,韓靜.HPLC法測定普樂安片中槲皮素的含量[J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn),2007,8(1):53-55.

[3] 郭娟麗,張培成,張智武.油菜花粉的化學(xué)成分研究[J].中國中藥雜志,2009,34(10):1235-1237.

[4] 鄭國平. RP-HPLC 法測定普樂安片中槲皮素和山柰素[J].中草藥,2011,42(4):719-721.

(責(zé)任編輯：尹晨茹)

Content Determination of Quercetin and Kaempferol in Pule’an Tablets using HPLC Determination

Shan Lifang1,Sun Jinfan2*,Zeng Xin3,Yuan Cai1,Zhang Lin1,Gao Tian4

(1.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 610075,China;2.Lao Bo Yun Tang, Chuxiong 675000,China;3.TCM Hospital of Zhaotong,Zhaotong 654600,China; 4.Teaching Hospital of Chengdu University of TCM,Chengdu 610072,China)

Objective:To establish an assay method for the determination of quercetin and kaempferol in Pule 'an Tablets by HPLC.Methods:The chromatographic column:XDB-C18;mobile phase:Methanol-0.4%phosphoric acid (50∶50) detection waveleng th:360nm.Results:quercetin showed a good linear relationship in the range of 0.029～0.290μg (r=0.999 8).The averge recovery was 98.40% and RSD=0.332%;kaempferol showed a good linear relationship in the rang e of 0.056 38～0.563 80μg (r=0.999 6).The averge recovery was 98.31% and RSD=0.386%.Conclusion:The method was simple,sensitive and accurate with good reproducibility. The methods may be used for quality control of Pule 'an Tablets.

Pule'an Tablets;Quercetin;Kaempferol;HPLC;Content Determination

2015-05-28

單麗芳(1989-)，女，成都中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幚碚撆c應(yīng)用、制劑。E-mail:465352726@qq.com

孫錦帆(1973-)，男，楚雄老撥云堂藥業(yè)股份有限公司工程師，研究方向?yàn)橹兴幮轮苿?。E-mail:381324501@qq.com

R284.2

A

1673-2197(2015)20-0017-03

10.11954/ytctyy.201520008