北海道黃楊葉片愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)

李 鳳 孫 寧 王 赫 劉敏潔 王伶云 胡洪宇 趙玉雯

（1.天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，中國 天津300384；2.深圳市萬信達(dá)生態(tài)環(huán)境股份有限公司，廣東 深圳518026）

0 引言

北海道黃楊（Euonymus japonicus）為衛(wèi)矛科、衛(wèi)矛屬的常綠闊葉樹種。其樹形有明顯的主干，樹體高大，葉片為卵形或橢圓形，四季常綠，且能開花結(jié)果，入冬后，其成熟的果實(shí)會開裂，露出紅色的種子，鑲嵌于綠葉叢中，紅果綠葉，具有較高的觀賞價值。北海道黃楊抗白粉病、黑斑病能力較強(qiáng)，吸收有害氣體的能力強(qiáng)，對二氧化硫、氫氣、氟化氫等有害氣體都有很強(qiáng)的抗性[1]。北海道黃楊的抗逆性強(qiáng)，適應(yīng)性強(qiáng)，能耐寒、耐干旱，在-23.9℃時仍能保持綠色；其生長速度快，年平均生長量約為70 cm，比普通大葉黃楊生長速度快3~5倍。其四季常綠、無污染的特性決定了能夠成為優(yōu)良的北方城鎮(zhèn)街道綠化樹種。

本文以北海道黃楊葉片為試材，對其離體培養(yǎng)條件下愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖與分化狀況進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以北海道黃楊葉片為試材。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體消毒

采集完整無病蟲的新生葉片和老熟葉片為外植體，在流水下沖洗后，無菌條件下在75%酒精中浸泡30s，用蒸餾水沖洗3次，后用0.1%氯化汞浸泡6min，無菌水清洗5次，放置于無菌濾紙上吸干水分。

1.2.2 葉片愈傷組織誘導(dǎo)試驗(yàn)

將葉片剪為1cm2左右?guī)~脈的方形葉塊，接種在不同配方的培養(yǎng)基上?；九囵B(yǎng)基采用MS（蔗糖30g/L、瓊脂6.3g/L，pH6.0），附加不同濃度的6-BA、NAA、2,4-D，共設(shè)10個處理。培養(yǎng)溫度25℃，暗培養(yǎng)。接種后定期觀察統(tǒng)計葉片生長情況。

1.2.3 葉片愈傷組織分化試驗(yàn)

無菌條件下，將誘導(dǎo)出的愈傷組織用刀片切成小塊接入到不同濃度處理的培養(yǎng)基中?；九囵B(yǎng)基采用MS（蔗糖30 g/L、瓊脂6.3 g/L，pH6.0），附加不同濃度的6-BA、NAA、KT、IBA、ZT、2,4-D，共設(shè)12個處理。培養(yǎng)溫度25℃，光照強(qiáng)度2000lx左右，光照時間12h/d。接種后定期觀察愈傷組織的生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片離體培養(yǎng)狀況

老熟葉片接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)15d后，愈傷組織誘導(dǎo)開始啟動，葉片邊緣切口處開始出現(xiàn)乳白色的愈傷組織，質(zhì)地堅硬，但是此時的愈傷組織較小，厚度約為0.05mm；接種30d后，愈傷組織的生長發(fā)生明顯變化，此時為愈傷組織生長的最旺盛時期，葉片四周的愈傷組織厚度約為0.1cm左右，此時的顏色為黃白色，質(zhì)地堅硬。此后，隨培養(yǎng)時間延長，愈傷組織逐漸開始慢慢褐化，由黃白色變?yōu)闇\褐色，再變?yōu)樯詈稚?，質(zhì)地也由堅硬慢慢開始變得疏松。培養(yǎng)40d后，愈傷組織誘導(dǎo)啟動較早的且長勢較好的愈傷組織葉片大部分都已褐化，此時這些長勢較好的愈傷組織厚度大小約為0.3~0.4cm，而愈傷組織長勢較差的愈傷組織則已經(jīng)完全褐化，且厚度只有0.1cm左右。

新葉作為外植體時，其葉片誘導(dǎo)愈傷組織的啟動時間則會相對的早于老葉，其誘導(dǎo)的愈傷組織為黃綠色，質(zhì)地堅硬，并且葉脈處也有愈傷組織長出，而老葉雖也有部分葉片的葉脈處長出愈傷組織，但是極少于新葉；新葉愈傷組織褐化衰老時間也晚于老葉愈傷組織。

2.2 外源激素對葉片誘導(dǎo)愈傷組織的影響

由表1可以發(fā)現(xiàn)，雖然處理A2愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)82.3%，但誘導(dǎo)出的愈傷組織量很小；而處理A8與A10誘導(dǎo)率相對較高，均為80%，且愈傷組織形成的量也較多；A7誘導(dǎo)率相對較低，為59%，但誘導(dǎo)形成的單塊愈傷組織體積較大。

表1 不同激素對葉片誘導(dǎo)愈傷組織的影響（30d）

將未誘導(dǎo)出愈傷組織、誘導(dǎo)出少量愈傷組織和誘導(dǎo)出少量愈傷組織且褐化的3種葉片再次轉(zhuǎn)接入處理A8與A10中進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)過10d后，原本未誘導(dǎo)出愈傷組織的葉片四周開始長出黃白色的愈傷組織，質(zhì)地疏松為顆粒狀；而原有少量愈傷組織的葉片四周也開始繼續(xù)增殖愈傷組織，同樣為黃白色，質(zhì)地疏松；誘導(dǎo)出愈傷組織但愈傷組織褐化的葉片，能夠在本已褐化了的組織周圍長出新的透明帶淺黃色的新的愈傷組織，其質(zhì)地柔軟疏松。在轉(zhuǎn)移接種21d后，新生愈傷組織的厚度在0.6-1.2cm之間，呈黃綠色至乳白色。（見圖1）

圖1 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)（左：培養(yǎng)30d；右：二次轉(zhuǎn)接A10培養(yǎng)21d）

2.3 外源激素對愈傷組織分化培養(yǎng)的影響

將葉片誘導(dǎo)獲得的愈傷組織接種到添加不同濃度激素組合的培養(yǎng)基中進(jìn)行光培養(yǎng)，10d后，B5處理的培養(yǎng)瓶中有少數(shù)愈傷組織開始有黃白色轉(zhuǎn)為綠色。由表2中可以看出，在12組處理中，B1、2、4、5、9這5組處理中的愈傷組織轉(zhuǎn)綠，其余的處理都是愈傷組織進(jìn)行了不同程度的增殖。培養(yǎng)14d，B1、B2、B4 3個處理都開始出現(xiàn)少量轉(zhuǎn)綠的愈傷組織。接種19d后，B2處理中轉(zhuǎn)綠的愈傷組織增多，B5中每塊愈傷組織上都有小部分轉(zhuǎn)綠。接種55d后，各處理配方中培養(yǎng)的愈傷組織均未分化出芽。

3 小結(jié)

在葉片誘導(dǎo)愈傷組織階段，MS+2,4-D1.5mg/L和MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L這兩個配方對愈傷組織的誘導(dǎo)效果最好，誘導(dǎo)率與愈傷組織量較高，并可作為愈傷組織的繼代培養(yǎng)基。在外植體的選擇上，新葉的誘導(dǎo)效果比老葉好，大部分新葉不僅葉片四周的切口處誘導(dǎo)出愈傷組織，葉脈處也會誘導(dǎo)出愈傷組織。

表2 不同激素配比對愈傷組織分化出芽的影響

在愈傷組織分化培養(yǎng)試驗(yàn)中，雖然未能分化出芽，但是發(fā)現(xiàn)NAA0.1mg/L與6-BA的激素組合能夠刺激愈傷組織轉(zhuǎn)綠。馬杰[2]等學(xué)者利用金邊北海道黃楊的葉片作為外植體，在MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)出不定芽，6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L時效果最好。在其他學(xué)者的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)有大量顆粒狀球形胚產(chǎn)生時可將其轉(zhuǎn)移到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)，此時由于愈傷組織正處于分化旺盛期，應(yīng)適當(dāng)降低激素用量或者去除細(xì)胞分裂素[3]。因此可以確定6-BA具有誘導(dǎo)分化出芽的作用，但是針對不同品種其適宜的6-BA濃度還需要探索。而ZT與2,4-D的激素組合則會誘導(dǎo)出質(zhì)地堅硬的白色愈傷組織。

對北海道黃楊葉片離體培養(yǎng)愈傷組織的獲得及其分化培養(yǎng)的初步研究，為北海道黃楊再生體系的成功建立奠定了技術(shù)基礎(chǔ)，并將為后續(xù)北海道黃楊細(xì)胞誘變、離體快繁、基因轉(zhuǎn)化等相關(guān)研究提供理論參考。

［1］王新生.北海道黃楊的特性和用途[J].中國林業(yè)，2008(10)：44.

［2］馬杰，郭利勇，崔波，等.金邊北海道黃楊再生體系的建立及其快繁初探[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36(6)：2245-2246，2346.

［3］曹孜義，劉國民.實(shí)用組培教程[M].蘭州：甘肅科學(xué)技術(shù)出版社，1996：78-80.