去除U(VI)的微生物組合構(gòu)建及培養(yǎng)條件的優(yōu)化

劉小玲，陳曉明* ，阮 晨，廖祥兵

(1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽 621010;2.西南科技大學(xué)核廢物與環(huán)境安全國防重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室，四川綿陽 621010)

近年來，隨著鈾礦開采和核工業(yè)技術(shù)的發(fā)展，鈾及其化合物得到廣泛應(yīng)用，但產(chǎn)生的含鈾廢物對(duì)周圍水體及環(huán)境造成的污染也越來越嚴(yán)重，且伴隨著其他放射性核素和金屬污染如 U235、Pu238、Cr、Mn、Fe 等。其中，鈾是一種對(duì)人體有放射性的核素，主要累積在肝臟、腎和骨骼，造成細(xì)胞的分化、凋亡等［1］。相對(duì)物理與化學(xué)修復(fù)技術(shù)，生物修復(fù)方法因具有顯著的優(yōu)勢(shì)而得到大量研究者的關(guān)注。目前，人們已發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌、硫酸鹽還原菌、檸檬酸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、耐輻射奇球菌等多種微生物對(duì)重金屬(核素)有去除作用［2－6］。楊晶等［7］指出，微生物與鈾作用的機(jī)理包括表面配合、氧化還原、無機(jī)微沉淀、離子交換等機(jī)理。但是，部分微生物對(duì)Cd、Hg、Ag等金屬非常敏感，甚至受到重金屬(核素)的毒害作用［8］。

隨著環(huán)境條件的改變，微生物的生長可引起自身形態(tài)、生長、繁殖等特征的改變，從而適應(yīng)周圍環(huán)境的變化，但是當(dāng)某些條件的改變超過微生物的極限時(shí)，也可引起微生物的死亡。據(jù)報(bào)道，微生物對(duì)重金屬(核素)的去除效應(yīng)易受到pH、溫度、金屬離子濃度、作用時(shí)間、接種量等多種因素的影響［9］。因此，篩選U(VI)的抗性微生物及微生物組合，優(yōu)化微生物組合的培養(yǎng)條件，研究其對(duì)U(VI)的去除效應(yīng)，對(duì)促進(jìn)微生物在環(huán)境治理中具有重要意義。

筆者以鈾尾礦與鹽堿地等特殊環(huán)境中篩選的優(yōu)勢(shì)菌株、文獻(xiàn)中具有特殊功能的菌株等為研究材料，篩選能耐受U(VI)的優(yōu)勢(shì)微生物和微生物組合，并且進(jìn)一步探究在培養(yǎng)條件下微生物及微生物組合對(duì)U(VI)的去除效率，通過正交試驗(yàn)考察微生物組合去除U(VI)的最適pH、溫度、U(VI)初始濃度。

1 材料與方法

1.1 微生物菌株 XJ1(Bacillus subtilis)，芽孢桿菌屬，新疆鹽堿地分離的優(yōu)勢(shì)菌株;考式玫瑰菌(Kocuria rosea)，考克式菌屬，若爾蓋鈾礦分離的優(yōu)勢(shì)菌株;耐輻射奇球菌(Deinococcus radiodurans)，奇球菌屬，來源于中國微生物菌種保藏中心;檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)，檸檬酸桿菌屬，來源于中國微生物菌種保藏中心。

1.2 微生物培養(yǎng)基 為了消除微生物培養(yǎng)基對(duì)U(VI)測(cè)量的影響，選擇相對(duì)于其他微生物培養(yǎng)基含有機(jī)成分較少的胰蛋白胨酵母葡萄糖培養(yǎng)基(TGY)。其主要成分為胰蛋白胨5.0 g、酵母粉 3.0 g、葡萄糖 1.0 g，定容至 1 000 ml，pH 7.0～7.2。

1.3 培養(yǎng)條件下微生物對(duì)U(VI)的抗性與去除能力研究 在100 ml作用體系中，U(VI)初始濃度分別為10、30、50 mg/L，置于120 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60 h。用分光光度計(jì)在600 nm處測(cè)量細(xì)胞懸浮液OD值。每隔12 h取樣，8 000 r/min振蕩5 min，利用偶氮胂(Ⅲ)分光光度法在652 nm處測(cè)量上清液中U(VI)濃度。重復(fù)3次。微生物對(duì)U(VI)的去除率按下式計(jì)算:

式中，C1為U(VI)初始濃度;C2為U(VI)殘留質(zhì)量濃度。

1.4 去除U(VI)的微生物組合篩選 將檸檬酸桿菌、耐輻射奇球菌按1∶1比例形成微生物組合，按10%接種量加入TGY培養(yǎng)基中，使得U(VI)初始濃度為30 mg/L，置于轉(zhuǎn)速為120 r/min、溫度為30℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，分析單菌株與組合菌對(duì)U(VI)的耐受性。

1.5 去除U(VI)的微生物組合培養(yǎng)條件優(yōu)化 按接種量10%，檸檬酸桿菌－耐輻射奇球菌組合與U(VI)作用36 h，以U(VI)去除率為指標(biāo)，考察菌株組合去除U(VI)的pH、溫度、U(VI)初始濃度。對(duì)pH、溫度、U(VI)初始濃度3個(gè)相互影響因素按L9(34)進(jìn)行正交試驗(yàn)(表1)。每組試驗(yàn)3個(gè)平行樣。

表1 試驗(yàn)因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 U(VI)對(duì)微生物生長的影響 為了探索微生物對(duì)U(VI)的去除效應(yīng)，首先需要研究U(VI)對(duì)細(xì)菌的生長影響情況，使錐形瓶中的 U(VI)保持在10、30、50 mg/L，30 ℃，120 r/min振蕩培養(yǎng)60 h，每隔12 h取樣，于600 nm處測(cè)定培養(yǎng)物中的細(xì)菌濃度，分別考察微生物在TGY培養(yǎng)基中的生長情況和對(duì)不同濃度U(VI)的耐受性。

由圖1可知，在U(VI)的脅迫下，菌株OD600均出現(xiàn)明顯變化，除考式玫瑰菌外，其他3種微生物均能耐受50 mg/L U(VI)。研究表明，高濃度U(VI)對(duì)檸檬酸桿菌的生長有輕微的抑制作用，但與10 mg/L U(VI)作用時(shí)明顯促進(jìn)該菌株的生長。檸檬酸桿菌分泌的檸檬酸可能改變?cè)芤褐械膒H，刺激該菌株的生長?？偟恼f來，檸檬酸桿菌生長受不同濃度U(VI)的影響較小。

U(VI)對(duì)耐輻射奇球菌對(duì)數(shù)生長期具有較小的影響，但在對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期影響不明顯。陳立等［10］指出，耐輻射奇球菌對(duì)核素的抗性機(jī)制歸因于DNA損傷的高效修復(fù)能力、對(duì)活性氧自由基的有效清除能力、自身特殊的基因結(jié)構(gòu)與生存方式3個(gè)方面?？际矫倒寰鶲D600均低于對(duì)照組，在未加入U(xiǎn)(VI)的情況下，培養(yǎng)至36h，其OD600可達(dá)到5.97，其生長雖可達(dá)到5.04左右，但生物量明顯降低。這說明從鈾污染區(qū)域分離的微生物相對(duì)于其他微生物具有明顯的生長優(yōu)勢(shì)。這可能與它的生存環(huán)境相關(guān)。

2.2 微生物對(duì)U(VI)的去除能力研究 在250 ml錐形瓶中，加入87 ml TGY培養(yǎng)基與10 ml OD值為0.8的XJ1、考式玫瑰菌、耐輻射奇球菌、檸檬酸桿菌菌液，30 mg/L U(VI)，培養(yǎng)溫度30℃，120 r/min振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h。每隔12 h取樣，8 000 r/min振蕩5 min，利用偶氮胂(Ⅲ)分光光度法在652 nm處測(cè)量上清液中U(VI)的濃度。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

由圖2所知，耐輻射奇球菌、檸檬酸桿菌對(duì)U(VI)有顯著的去除效應(yīng)，對(duì) U(VI)的去除率分別達(dá)到80.4%、84.8%，而XJ1、考式玫瑰菌對(duì) U(VI)的去除率僅分別為47.6%、35.7%。

檸檬酸桿菌為兼性厭氧菌，直桿狀，表面光滑，無莢膜，直徑約為1.0 μm，革蘭氏陰性菌。Xie等［11］研究表明，檸檬酸桿菌對(duì)U(VI)的吸附量可達(dá)9 000 mg/g，但研究中當(dāng)U(VI)濃度為30 mg/L時(shí)檸檬酸桿菌對(duì)U(VI)的去除率可達(dá)84.8%。由此可知，檸檬酸桿菌適合處理低濃度含鈾廢水［12］。

耐輻射奇球菌為兼性厭氧菌，球狀，能產(chǎn)生粉紅色色素，革蘭氏陽性菌，具有四分體結(jié)構(gòu)。研究中，耐輻射奇球菌對(duì)30 mg/L U(VI)的去除率可達(dá)到80.4%。與鄧欽文等［6］運(yùn)用耐輻射奇球菌菌體在優(yōu)化條件下對(duì)50 mg/L U(VI)的去除率達(dá)92.3%相比，去除率稍低，可能是利用活體微生物去除U(VI)的緣故。相關(guān)報(bào)道也指出，一些重金屬抗性基因已在耐輻射奇球菌中表達(dá)［13－16］。

2.3 單菌株與混合菌株對(duì)U(VI)的耐受性比較 將篩選得到的兩種優(yōu)勢(shì)菌株按1∶1比例建立對(duì)U(VI)作用的高效組合，設(shè)定檸檬酸桿菌－耐輻射奇球菌組合，考察單菌株與混合菌株對(duì)對(duì)U(VI)的耐受性。

由圖3可知，檸檬酸桿菌－耐輻射奇球菌組合對(duì)30 mg/L U(VI)的抗性明顯增加，其生長趨勢(shì)相對(duì)于兩單菌株均有增強(qiáng)，說明它為有效組合。由此可知，菌株的生長與U(VI)的去除率保持某種線性關(guān)系。因此，推測(cè)檸檬酸桿菌－耐輻射奇球菌組合能提升U(VI)的去除效果。

2.4 去除U(VI)的檸檬酸桿菌-耐輻射奇球菌的正交試驗(yàn)結(jié)果分析 影響微生物生長和去除U(VI)的因素較多。試驗(yàn)中，著重考察pH、溫度、U(VI)初始濃度對(duì)去除U(VI)的影響。

由表2可知，檸檬酸桿菌－耐輻射奇球菌組合去除U(VI)的最佳條件為:pH 6.0、溫度30℃、U(VI)初始濃度10 mg/L。各因素對(duì)檸檬酸桿菌－耐輻射奇球菌去除U(VI)的影響順序?yàn)閜H＞溫度＞U(VI)初始濃度。pH相對(duì)于溫度和U(VI)初始濃度對(duì)微生物組合去除U(VI)的影響較大。

表2 檸檬酸桿菌-耐輻射奇球菌的正交試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)比微生物組合對(duì)U(VI)的去除率，溫度較之于U(VI)初始濃度對(duì)微生物組合去除U(VI)的影響較大。正交試驗(yàn)中，溫度30℃為去除U(VI)的最適溫度，推測(cè)溫度可能影響細(xì)胞上金屬吸附位點(diǎn)和增加吸附位點(diǎn)與金屬離子的親和力，或?yàn)榻饘匐x子在細(xì)胞內(nèi)主動(dòng)運(yùn)輸提供能量而提升去除效率［17］。U(VI)初始濃度對(duì)組合菌去除U(VI)的影響較小。這可能是由于試驗(yàn)中U(VI)濃度較小。

3 結(jié)論

在U(VI)的脅迫下，篩選出3種耐受U(VI)的微生物，分別是XJ1、耐輻射奇球菌、檸檬酸桿菌，且均能耐受50 mg/L U(VI)。研究表明，耐輻射奇球菌與檸檬酸桿菌對(duì)U(VI)有顯著的去除能力，去除率分別達(dá)到80.4%、84.8%，而其他2種微生物則對(duì)U(VI)的去除能力不強(qiáng)。

運(yùn)用單菌株和菌株組合的耐受性比較分析，構(gòu)建了檸檬酸桿菌－耐輻射奇球菌組合，再通過三因素三水平優(yōu)化檸檬酸桿菌－耐輻射奇球菌去除U(VI)的pH、溫度、U(VI)初始濃度。結(jié)果表明，在最佳條件(pH 6.0、溫度30℃、U(VI)初始濃度10 mg/L)下，檸檬酸桿菌－耐輻射奇球菌組合對(duì)U(VI)的去除率可達(dá)到98.3%。

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