馬勃狀硬皮馬勃胞外多糖的分子結(jié)構(gòu)及抗氧化活性研究

何培新，吳雙雙，賀新生，許春平*

（1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.西南科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽 621010）

0 引言

自Chihara 等[1]1969 年發(fā)現(xiàn)香菇多糖具有抗腫瘤活性和增強機體免疫功能以來，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)200 多種具有抗腫瘤活性的藥用真菌多糖[2-3].此外還發(fā)現(xiàn)真菌多糖具有降低血糖血脂、抗輻射、抗衰老、保肝護肝、抗氧化等多種生理功能[4]，使其成為國內(nèi)外醫(yī)藥與保健品行業(yè)研究與開發(fā)的熱點.馬勃狀硬皮馬勃（Scleroderma areolatum Ehrenb），又名馬皮泡、灰包，屬于擔子菌亞門（Basidiomycotina），硬皮馬勃目（Sclerodermatales），硬皮馬勃科（Sclerodermataceae），硬皮馬勃屬（Scleroderma）.該屬真菌廣泛分布于世界各地，共有60 余種，在我國較常見的有11 種.硬皮馬勃幼嫩時可食用，并多有止血、消腫、清熱和解毒等藥用功效[5].馬勃狀硬皮馬勃的子實體水提液具有抑菌、抗炎、止咳、止血、殺蟲、抗?jié)兊茸饔肹6].該屬真菌具有很高的藥用價值，其部分化學(xué)成分國外已有相關(guān)報道[7]，其中一種新的羊毛甾烷型三萜化合物（lanostanetype triterpenoid）對單純皰疹病毒1 型（HSV-1）有顯著的抗病毒活性[8]，然而目前還沒有馬勃狀硬皮馬勃胞外多糖（EPS）的研究報道.

本研究對發(fā)酵罐制得的馬勃狀硬皮馬勃EPS進行分離純化、結(jié)構(gòu)表征和抗氧化測定，為進一步研究馬勃狀硬皮馬勃EPS 的構(gòu)效關(guān)系及其在醫(yī)藥行業(yè)中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

馬勃狀硬皮馬勃試驗菌株由野生子實體經(jīng)組織分離獲得，由西南科技大學(xué)賀新生教授提供.

1.1.2 發(fā)酵罐種子液的制備

用打孔器取平板邊緣新生菌絲兩塊，接入含50 mL 種子培養(yǎng)液的250 mL 錐形瓶中，160 r/min 26 ℃振蕩培養(yǎng)4 d.然后加入滅菌磁棒和玻璃珠，置于磁力攪拌器上將菌絲球打碎后備用.本研究所有接種量均固定為4%.

1.1.3 發(fā)酵培養(yǎng)條件

采用搖瓶優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基：20.0 g/L 果糖，5.0 g/L 大豆粉，2.5 mmol/L KH2PO4，2.5 mmol/L MgSO4，pH 8.0；發(fā)酵培養(yǎng)溫度為26 ℃，攪拌速度160 r/min，進氣量2 vvm；發(fā)酵罐容積為5 L，裝液量為3.5 L.

1.1.4 透析袋

采用分子截留量3 500、直徑22 mm、壓平寬度34 mm 的透析袋.

1.1.5 主要儀器

SW-CJ-2F 超凈工作臺：蘇凈安泰；5 L 攪拌式發(fā)酵罐：上海百倫科技有限公司；XFH-30CA 立式壓力蒸汽滅菌鍋：浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；CPA224S 萬分之一天平：賽多利斯；78-1SA 磁力攪拌器：上海企戈實業(yè)有限公司；CXG-1 電腦恒溫層析柜（含DLH-A 恒流泵，DBS-100 全自動部份收集器）：上海青浦滬西儀器廠；SJIA-10N 冷凍干燥機：寧波雙嘉儀器有限公司；HZT-A1000 電子天平：上海嘉展儀器設(shè)備有限公司；UV-17001C 紫外分光光度計：上海鳳凰光學(xué)科儀有限公司；Sepharose CL-6B 層析柱：上海索萊寶生物技術(shù)公司；日本EYELA 全自動旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀N-2100：東京理化；SHB-III 循環(huán)水多用真空泵：北京成萌偉業(yè)有限公司；Nicolet 5700 傅立葉變換紅外光譜儀：美國；尺寸排阻色譜-多角度激光光散射（SECMALLS）：美國懷亞特.

1.1.6 主要化學(xué)試劑

果糖、苯酚、濃硫酸、氯仿、正丁醇、無水乙醇、KH2PO4、MgSO4、NaNO3、NaN3、KBr、吡啶和甲醇等（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；大豆粉購自蓮花市場；藍色葡聚糖2000、標準葡聚糖（Dextran T10、T40、T70、T150）：上海玉博生物科技有限公司；Sepharose CL-6B：Solarbio 公司；三氟乙酸（色譜純）：阿拉丁試劑有限公司；三甲基氯硅烷（BSTFA∶TMCS，99∶1）（色譜純）：東京化成工業(yè)株式會社產(chǎn)品.

1.2 試驗方法

1.2.1 從發(fā)酵液提取粗多糖

利用抽濾法[9]分離菌絲體和發(fā)酵液，將發(fā)酵液旋蒸濃縮至1/3，加入4 倍體積無水乙醇，4 ℃靜置過夜，然后10 000 r/min 離心15 min，得到粗多糖沉淀.

1.2.2 sevag 法除蛋白[10]

用少量蒸餾水溶解粗多糖，加入1/3 體積多糖溶液的除蛋白液(氯仿/正丁醇混合液，體積比為5∶1)，磁力攪拌30 min，然后于分液漏斗中靜置20 min，除去下層的有機相，保留水相；重復(fù)操作4～5次，直至有機相與水相間無明顯沉淀為止.將所有水相濃縮3 倍，加入4 倍體積無水乙醇，4 ℃靜置過夜后，10 000 r/min 離心15 min，得到粗多糖沉淀.粗多糖沉淀冷凍干燥即得粗胞外多糖.

1.2.3 粗胞外多糖的分離純化

稱量20 mg 粗多糖，溶解于2 mL 0.2 mol/L 的NaCl 溶液，用0.22 μm 孔徑的濾膜過濾，再進行Sepharose CL-6B 柱層析.調(diào)整恒流泵使洗脫液流速為1.15 mL/min，利用自動收集器收集.從每管取1 mL 收集液，用苯酚硫酸法[11]于490 nm 處檢測多糖，于280 nm 處直接檢測收集液的蛋白，記錄吸光度值.以管數(shù)為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制粗多糖純化曲線.重復(fù)過層析柱8～10 次，將同一組分的多糖收集在一起，濃縮后用分子截留量為3 500 的透析袋透析3 d，每天換蒸餾水3 次.最后將透析過的精制胞外多糖冷凍干燥，置干燥器中備用.

1.2.4 凝膠過濾法測胞外多糖的相對分子質(zhì)量[12]

用0.2 mol/L NaCl 溶液平衡Sepharose CL-6B層析柱24 h 后，先用藍色葡聚糖2 000 加入柱內(nèi)測得外水體積V0，然后取2 mL 質(zhì)量濃度為2 mg/mL 的分子質(zhì)量不同的標準葡聚糖（Dextran T10、T40、T70、T150）分別相繼上樣，調(diào)整恒流泵使洗脫液流速為1.15 mL/min，利用自動收集器收集.用苯酚硫酸法檢測吸光度值，合并洗脫液，分別求得洗脫體積Ve.凝膠柱所能容納的總體積定為Vt，其計算方法見公式（1）.以各標準多糖的分配系數(shù)Kav值為橫坐標，以分子質(zhì)量的對數(shù)值為縱坐標作標準曲線.Kav的計算公式見（2）.

式中：D 為層析柱直徑，h 為層析柱高，Ve為洗脫體積，V0為外水體積，Vt為柱床總體積.

按上述方法測得真菌胞外多糖的Ve，由標準曲線求得其相對分子質(zhì)量.

1.2.5 精制EPS 的紅外光譜（IR）測定

稱取2～3 mg 精制EPS，加入適量的KBr，研磨均勻后壓片，用傅立葉變換紅外光譜儀在4 000～400 cm-1波長區(qū)間內(nèi)掃描紅外吸收值[13].

1.2.6 精制EPS 的氣相色譜/質(zhì)譜（GC/MS）測定

稱取精制EPS 3 mg，放入棕色小瓶中，加入3 mL 2 mol/L 的三氟乙酸，密封后置于121 ℃的烘箱中恒溫2 h.冷卻后用0.22 μm 的水相濾膜過濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸干，然后加入2～3 mL 甲醇再次蒸干，重復(fù)3 次.加入1.5 mL 吡啶和0.1 mL 衍生試劑BSTFA∶TMCA（99∶1），密封后置于80 ℃的烘箱中恒溫1 h，冷卻后過0.22 μm 的有機濾膜，送樣檢測[14].

上樣條件：HP-5 MS 60 m 色譜柱，進樣量0.1 μL，分流比100∶1，延遲時間7 min，進樣口溫度280 ℃，傳輸線溫度280 ℃.升溫程序為：起始溫度60 ℃，保持2 min，以5 ℃/min 的速度升溫至280 ℃，保持20 min.MS 分析條件：溶劑延遲7 min，掃描范圍35～455 aum，進樣口280 ℃，傳輸線溫度280 ℃，EI 能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度160 ℃.

1.2.7 SEC/MALLS 測定精制EPS 的相對分子質(zhì)量及分子構(gòu)象

尺寸排阻色譜（SEC）、多角度激光光散射檢測器（MALLS）及示差折光檢測器（RI）聯(lián)用可測定精制EPS 相對分子質(zhì)量的大小及分子構(gòu)象[15].

使用50 mmol/L NaNO3和0.02% NaN3溶解精制EPS 樣品，配制成2 mg/mL 的樣品溶液，用0.22 μm 的水相膜過濾后備用.流速0.5 mL/min，進樣量100 μL，樣品的dn/dc 值根據(jù)相關(guān)文獻設(shè)置為0.14 mL/g[16].使用軟件Astra 4.72（美國懷亞特技術(shù)公司）計算樣品的相對分子質(zhì)量大小和均方根的回轉(zhuǎn)半徑.從均方根半徑與樣品相對分子質(zhì)量的雙對數(shù)曲線中，可以判斷多糖分子在水溶液中的構(gòu)象，具體條件由下列公式給出：

式中：ri是樣品的均方根半徑，Mi是樣品的分子質(zhì)量，k 是均方根半徑在Y 軸的截距，1/3、1/2 和1 分別代表樣品不同構(gòu)象的臨界坡度值.

1.2.8 精制EPS 黏度的測定[17]

EPS 的黏度用烏氏黏度計在（25±0.1）℃的水浴中進行測定.選擇溶劑流出毛細管時間大于120 s 的黏度計，由此可忽略動能校正.用逐步稀釋法按以下的Huggins 方程（3）和Kraemer 方程（4），將濃度外推至零計算特性黏度[η]:

其中，k’和β 為多糖在某溫度下某溶劑中的常數(shù)，ηsp/c 為比濃黏度，lnηr/c 為比濃對數(shù)黏度.

1.2.9 精制EPS 均方根旋轉(zhuǎn)半徑（Rg）和流體力學(xué)半徑（Rh）的測定[18]

分子質(zhì)量中心到各質(zhì)點（基團）距離平方的平均值的平方根被定義為均方根旋轉(zhuǎn)半徑（Rg），它反映單個高分子分子鏈在空間的伸展程度.流體力學(xué)半徑（Rh）反映流體力學(xué)作用時大分子在溶液中的尺寸，它是一個與高聚物鏈有相同平移擴散系數(shù)的等效球體的半徑[19].Rg通過SEC-MALLS 法測得，而Rh通過黏度法獲得，根據(jù)Einstein 理論公式（5）[20]推算得：

式中：NA為阿伏伽德羅常數(shù)（6.022×1023），Mw和[η]分別為重均分子質(zhì)量和特性黏度.

均方旋轉(zhuǎn)半徑和流體力學(xué)半徑的比值可以用ρ 表示：

1.2.10 鄰二氮菲法測定EPS 對·OH 的清除能力[21]

配制質(zhì)量濃度梯度分別為2 mg/mL、4 mg/mL、6 mg/mL、8 mg/mL、10 mg/mL 的EPS 溶液10 mL.取7 支試管，其中5 支為試驗組，1 支作為對照組，1 支為調(diào)零組.向試驗組中加入1 mL pH 為7.4 的磷酸緩沖液（0.02 mmol/L，PBS），1 mL 7.5 mmol/L的鄰二氮菲溶液，1 mL 3.25 mmol/L FeSO4溶液，1 mL 1.5%H2O2，EPS 溶液2 mL.調(diào)零組以蒸餾水代替2 mL EPS 溶液，對照組以蒸餾水代替2 mL EPS 溶液和1 mL 1.5%H2O2.混勻后，于37 ℃恒溫1 h.調(diào)零組調(diào)零后，用紫外分光光度計于510 nm處測定試驗組和對照組的吸光度值.每組做3 次平行試驗，取其平均值.EPS 對·OH 清除率的計算公式如下：

式中：Ai是試驗組的吸光度值，Aj是對照組的吸光度值.

1.2.11 EPS 對·DPPH 清除能力的測定[22]

配制質(zhì)量濃度梯度為1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL 的EPS 溶液20 mL.取11 支試管，5 支為試驗組，5 支為對照組，1 支為空白組.向試驗組分別加入2 mL EPS 溶液、2 mL 0.1 g/L 的DPPH 50%乙醇溶液，混勻后，于25 ℃恒溫1 h，以50%乙醇溶液為空白于517 nm 處測定其吸光度Ai；向空白組分別加入2 mL 0.1 g/L的DPPH 50%乙醇溶液、2 mL 蒸餾水，混勻后于25 ℃水浴中放置1 h，于517 nm 處測定其吸光度A0；向?qū)φ战M分別加入2 mL EPS 溶液、2 mL 50%乙醇，混勻后于25 ℃恒溫1 h，于517 nm 處測定其吸光度Aj.EPS 對·DPPH 清除率的計算公式如下：

式中：Ai是試驗組的吸光度值，Aj是對照組的吸光度值，A0是空白組的吸光度值.

2 結(jié)果與討論

2.1 馬勃狀硬皮馬勃EPS 的分離純化

發(fā)酵罐發(fā)酵馬勃狀硬皮馬勃所產(chǎn)EPS 經(jīng)除蛋白后，通過Sepharose CL-6B 柱層析進行分離純化，結(jié)果如圖1 所示.通過分析可知，馬勃狀硬皮馬勃粗多糖純化時有兩個多糖吸收峰，即兩個組分（Fr-I 和Fr-II）.Fr-I 為13～35 管，F(xiàn)r-II 為36～45 管，對這兩個組分的管數(shù)分別進行收集，透析袋透析，然后冷凍干燥，即得精制多糖.而且可以看出，蛋白吸收峰在兩個多糖吸收峰中都有，說明其精制多糖的兩個組分均可能含有蛋白.

圖1 馬勃狀硬皮馬勃產(chǎn)EPS 分離純化結(jié)果Fig.1 The separation and purification of EPS from S.areolatum Ehrenb

2.2 馬勃狀硬皮馬勃EPS 的相對分子質(zhì)量

以Kav為橫坐標，葡聚糖標準品系列的logM為縱坐標，繪得分子質(zhì)量標準曲線，回歸方程為y=-5.485 8x+6.537 9，相關(guān)性系數(shù)為R2=0.999 3.由標準曲線推算得馬勃狀硬皮馬勃EPS 精制組分的相對分子質(zhì)量，結(jié)果如圖2 所示.試驗測得馬勃狀硬皮馬勃EPSFr-I 和Fr-II 的Ve分別為115 mL 和195 mL，根據(jù)標準曲線推算得馬勃狀硬皮馬勃EPS Fr-I 和Fr-II 組分的相對分子質(zhì)量分別為627 500 和4 820.

2.3 馬勃狀硬皮馬勃EPS 的紅外光譜分析

圖2 馬勃狀硬皮馬勃EPS 精制組分的相對分子質(zhì)量Fig.2 The relative molecular weight of EPS refined fractions from S.areolatum Ehrenb

圖3 馬勃狀硬皮馬勃EPS 精制組分的紅外光譜Fig.3 The RT-IR spectra of EPS refined fractions from S.areolatum Ehrenb

馬勃狀硬皮馬勃產(chǎn)EPS Fr-I 和Fr-II 的紅外光譜圖如圖3 所示.通過分析可知，馬勃狀硬皮馬勃EPS Fr-I 在3 299.4 cm-1有寬展圓滑強吸收峰，為O—H 伸縮振動，說明其分子氫鍵以分子間氫鍵為主；2 930.4 cm-1處有較強吸收峰是由多糖中甲基—CH3或次甲基—CH2的C—H 的伸縮振動引起的，具有典型的多糖特征；在1 650.8 cm-1處出現(xiàn)紅外吸收峰，為N—H 的變角振動，為氨基或酰胺基的結(jié)構(gòu)[23]；1 386.2 cm-1處的紅外吸收峰為磺?；狾—SO2—R 的S ＝O 非對稱伸縮振動；1 123.8 cm-1處有紅外吸收峰，為C—O—C 環(huán)內(nèi)醚的C—O 伸縮振動；1 020.5 cm-1處的紅外吸收峰為—OH 的O—H 變角振動；在970.1 cm-1處出現(xiàn)紅外吸收峰，此處為吡喃環(huán)末端次甲基的橫搖振動；916.9 cm-1處出現(xiàn)紅外吸收峰，為α-吡喃糖的特征吸收峰；810.9 cm-1處的紅外吸收峰為甘露糖特征吸收峰[24].因此可以推測其Fr-I 可能是α-吡喃型甘露糖苷酸性雜多糖[25].馬勃狀硬皮馬勃EPS Fr-II 與Fr-I 不同的是在1 241.5 cm-1處有吸收峰，說明有酯基或O—乙酰基的存在；沒有C—O—C 環(huán)內(nèi)醚的C—O 伸縮振動；經(jīng)分析可以得出其Fr-II 可能也是α-吡喃型甘露糖苷酸性雜多糖.

2.4 馬勃狀硬皮馬勃EPS 單糖組分分析

將馬勃狀硬皮馬勃EPS 的各精制組分分別進行GC/MS 檢測，把各個組分的氣相色譜圖中每個峰的保留時間與標準單糖的保留時間進行比對.分別對馬勃狀硬皮馬勃EPS 精制組分的氣相色譜圖進行分析，結(jié)果如圖4 所示.

采用面積歸一化法對馬勃狀硬皮馬勃EPS 單糖組分進行分析，分析結(jié)果如表1 所示，其Fr-I 和Fr-II 所含單糖組分和含量分別為：鼠李糖0.86%、1.99%，核糖5.35%、8.36%，木糖9.81%、3.77%，葡萄糖醛酸47.35%、35.05%，半乳糖2.21%、2.82 %，葡萄糖4.21%、7.50%，甘露糖29.70%、33.79 %，半乳糖醛酸0.51%、6.72%，兩個組分所含單糖組分的種類一樣，含量有所差異.馬勃狀硬皮馬勃EPS各精制組分均含有葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，說明發(fā)酵所得的EPS 可能為酸性多糖[25-26]，與其紅外光譜分析結(jié)果一致；其單糖組分中甘露糖的含量較多，與紅外光譜中810 cm-1處出現(xiàn)的甘露糖特征吸收峰一致.

圖4 馬勃狀硬皮馬勃EPS 精制組分氣相色譜圖（上：Fr-I，下：Fr-II）Fig.4 The GC of EPS refined fractions from S.areolatum Ehrenb（top:Fr-I，under:Fr-II）

2.5 馬勃狀硬皮馬勃EPS 的SEC/MALLS 分析

利用尺寸排阻色譜（SEC）、多角度激光光散射檢測器（MALLS）及示差折光檢測器（RI）聯(lián)用技術(shù)，可檢測馬勃狀硬皮馬勃EPS 精制組分的分子質(zhì)量及其在水溶液中的分布情況，結(jié)果如表2 所示.

分析表2 可知，馬勃狀硬皮馬勃EPS Fr-I 和Fr-II 的重均分子質(zhì)量分別為1.332×105和1.198×105，Mw/Mn即多分散系數(shù)分別為4.797 和2.996，表明兩個組分的分散性均很低，在水溶液中很容易形成大量的聚集體，溶解度很小.馬勃狀硬皮馬勃EPSFr-I 和Fr-II 的均方根半徑分別為22.0 nm 和12.8 nm，F(xiàn)r-I 和Fr-II 的均方根半徑對分子質(zhì)量的雙對數(shù)曲線的斜率分別為0.13 和0.15（圖5），說明其在水溶液中以球形構(gòu)象存在，是一種高度緊密而且具有分支結(jié)構(gòu)的多糖聚集體.通過SEC/MALLS 測得馬勃狀硬皮馬勃產(chǎn)EPSFr-II 的相對分子質(zhì)量大于凝膠過濾法測得的相對分子質(zhì)量，這可能是因為精制多糖經(jīng)過透析時多糖分子發(fā)生了聚集，溶解度降低所致.馬勃狀硬皮馬勃產(chǎn)EPS 精制組分Fr-I（左）和Fr-II（右）的均方根半徑對相對分子質(zhì)量的雙對數(shù)曲線如圖5 所示.

表2 馬勃狀硬皮馬勃EPS 精制組分SEC/MALLS 參數(shù)Table 2 The SEC/MALLS parameters of EPS refined fractions from S.areolatum Ehrenb

圖5 馬勃狀硬皮馬勃EPS 精制組分均方根半徑對分子質(zhì)量的雙對數(shù)曲線（上：Fr-I，下：Fr-II）Fig.5 The double logarithmic curve of root mean square radius vs molecular weight for EPS refined fractions from S.areolatum Ehrenb（top:Fr-I，umder:Fr-II）

2.6 馬勃狀硬皮馬勃EPS 的分子構(gòu)象分析

馬勃狀硬皮馬勃EPS 分子構(gòu)象的參數(shù)如表3所示，其中Mw和Rg值通過SEC-MALLS 法測得，而Rh通過黏度法獲得，根據(jù)Einstein 理論公式推算得到.黏度由烏氏黏度計測定，它反映了在稀溶液中多糖所占的水力體積.通常認為，黏度越小，多糖往往具有比較致密的構(gòu)象[27].由表3 可知，試驗測得馬勃狀硬皮馬勃EPS Fr-II 的黏度值較Fr-I小，而且其相對分子質(zhì)量和均方旋轉(zhuǎn)半徑均較Fr-I的小，尤其是均方旋轉(zhuǎn)半徑非常小，說明其鏈未舒展開，結(jié)構(gòu)較為致密.

表3 馬勃狀硬皮馬勃EPS 精制組分的分子構(gòu)象參數(shù)Table 3 The molecular conformation parameters of EPS refined fractions from S.areolatum Ehrenb

k’值在0.3～0.5 之間時，表明該溶液對聚合物是良溶劑.由表3 可知，馬勃狀硬皮馬勃EPS 各精制組分的k’均大于0.5，說明其在水溶液中的溶解性較低.Rg和Rh的比值為ρ，ρ 值可以用來描述多糖分子在水溶液中的鏈構(gòu)象，ρ≈0.3 時，為均一緊密的球形構(gòu)象；ρ≈0.5 時，為一個松散連接的超支化鏈或聚合物；ρ≈1.0 時，為剛性桿狀鏈.分析結(jié)果可知，馬勃狀硬皮馬勃EPS 各精制組分的ρ 值均接近于1，說明其EPS 各精制組分在水溶液中可能為剛性桿狀鏈的多糖聚集體.

2.7 馬勃狀硬皮馬勃EPS 的抗氧化活性分析

馬勃狀硬皮馬勃EPS 對·OH 和·DPPH 自由基的清除率如圖6 所示.從圖6 可以看出，當馬勃狀硬皮馬勃EPS 質(zhì)量濃度為10 mg/mL 時，其對·OH自由基的清除率高達22.65%，而當馬勃狀硬皮馬勃EPS 濃度為5 mg/mL 時，其對·DPPH 自由基的清除率已高達41.32%.馬勃狀硬皮馬勃EPS對·DPPH 自由基的清除率明顯高于其對·OH 自由基的清除率，表現(xiàn)出良好的抗氧化活性.

圖6 馬勃狀硬皮馬勃EPS 對·OH 和·DPPH自由基的清除率Fig.6 The OH and DPPH radical scavenging rate of EPS from S.areolatum Ehrenb

3 結(jié)論

本研究表明，馬勃狀硬皮馬勃EPS 含有兩個組分Fr-I 和Fr-II，兩組分的相對分子質(zhì)量分別為627 500 和4 820.紅外光譜分析可知，其EPS 具有明顯的多糖特征吸收峰，可能為α-吡喃型甘露糖苷酸性雜多糖.Fr-I 和Fr-II 單糖組分和含量分別為：鼠李糖0.86%、1.99%，核糖5.35%、8.36%，木糖9.81%、3.77%，葡萄糖醛酸47.35%、35.05%，半乳糖2.21%、2.82%，葡萄糖4.21%、7.50%，甘露糖29.70%、33.79%，半乳糖醛酸0.51%、6.72%，兩個組分所含單糖組分的種類一樣，但含量有所差異；兩種組分均含有葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，表明發(fā)酵所得EPS 可能為酸性多糖，該結(jié)果與紅外光譜分析結(jié)果一致；單糖組分中甘露糖的含量較多，與紅外光譜中810 cm-1處出現(xiàn)的甘露糖特征吸收峰一致.SEC/MALLS 測定結(jié)果表明，其EPS 分散性很低，在水溶液中很容易形成大量的聚集體，溶解度很小，且在水溶液中以球形構(gòu)象存在，是一種高度緊密而且具有分支結(jié)構(gòu)的多糖聚集體.馬勃狀硬皮馬勃EPS Fr-II 的黏度、相對分子質(zhì)量和均方旋轉(zhuǎn)半徑均較Fr-I 的小，尤其是均方旋轉(zhuǎn)半徑非常小，說明其鏈未舒展開，結(jié)構(gòu)較為致密；馬勃狀硬皮馬勃EPS 的ρ 值接近于1，說明其EPS 在水溶液中可能為剛性桿狀鏈的多糖聚集體.馬勃狀硬皮馬勃EPS 質(zhì)量濃度為10 mg/mL 時，對·OH 自由基的清除率為22.65%，當質(zhì)量濃度為5 mg/mL 時，對·DPPH 自由基的清除率高達41.32%，表現(xiàn)出良好的抗氧化活性.本研究結(jié)果為進一步研究馬勃狀硬皮馬勃EPS 的構(gòu)效關(guān)系及其在醫(yī)藥行業(yè)的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).

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