鯪魚(yú)下腳料酶解液發(fā)酵條件的研究

李小燕，王莉嫦,2，汪 薇，任文彬*

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510225；2.廣州鷹金錢(qián)企業(yè)集團(tuán)公司，廣東 廣州 510000）

豆豉鯪魚(yú)是廣東、福建等地的特產(chǎn)。鯪魚(yú)在加工過(guò)程中剩余的魚(yú)頭、魚(yú)骨、魚(yú)鱗等下腳料營(yíng)養(yǎng)豐富，所含的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)與魚(yú)肉相近，礦物質(zhì)中的鈣含量高于魚(yú)肉，并且還含有人類(lèi)所需的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1-3]。但是這些下腳料往往僅是進(jìn)行粗加工，得不到充分利用，造成大大的浪費(fèi)。

魚(yú)蛋白的水解方式有酶法水解、微生物水解、堿水解、酸水解、酒精萃取脫脂等[4]。國(guó)外早在1886年已開(kāi)始水解魚(yú)類(lèi)蛋白方面的研究[5]，我國(guó)近幾年隨著深加工企業(yè)的發(fā)展，也在這方面進(jìn)行大力開(kāi)發(fā)。趙靜等[6]研究堿性蛋白酶水解蝦頭殼蛋白質(zhì)，水解度可達(dá)21.8%。張曉旭等[7]用木瓜蛋白酶酶解甲魚(yú)蛋白。丁梅等[8]用高效能蛋白質(zhì)分解酶水解章魚(yú)下腳料，多肽質(zhì)量濃度達(dá)5.0798 mg/mL。而微生物發(fā)酵法相對(duì)于其他水解方法，不但可提高魚(yú)類(lèi)下腳料消化利用率，還可減少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失。特別是利用微生物發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)蛋白質(zhì)飼料或是魚(yú)露產(chǎn)品，越來(lái)越受到人們的重視[9-10]。

目前，用于發(fā)酵的菌種主要有霉菌、酵母菌、細(xì)菌三大類(lèi)[11]。KIM J K等[12]利用從蚯蚓內(nèi)臟分離出的芽孢桿菌對(duì)魚(yú)類(lèi)廢棄物進(jìn)行發(fā)酵使其轉(zhuǎn)化成液體肥料。劉峰等[11]用嗜酸乳桿菌發(fā)酵海水魚(yú)下腳料，發(fā)酵后提高了原料中氨基酸等的含量。本研究擬采用酵母菌發(fā)酵鯪魚(yú)下腳料酶解液，以期能為鯪魚(yú)下腳料的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮鯪魚(yú)：華潤(rùn)萬(wàn)家超市；干酵母：湖北安琪酵母股份有限公司；復(fù)合風(fēng)味蛋白酶：廣州市華琪生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TJ12-H絞肉機(jī)：廣東恒聯(lián)食品機(jī)械有限公司；800型電動(dòng)離心機(jī)：江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；UV5200紫外分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 鯪魚(yú)下腳料酶解液的制備工藝流程及操作要點(diǎn)

鮮活鯪魚(yú)下腳料→絞成糜狀→冷凍備用→解凍→加水?dāng)嚧蚓鶆颉附狻鷾缑浮鋮s→離心→收集上清液即得酶解液

操作要點(diǎn)如下：

鯪魚(yú)下腳料：新鮮鯪魚(yú)去肉后的魚(yú)骨、魚(yú)頭、魚(yú)鰭、魚(yú)鱗。

企業(yè)社會(huì)責(zé)任從內(nèi)容的爭(zhēng)論到企業(yè)社會(huì)責(zé)任報(bào)告的發(fā)布，經(jīng)歷了從理論到實(shí)踐的飛躍。一旦一種理論成為實(shí)踐的指導(dǎo)就獲得了理論證實(shí)的合法地位。“我們知道，科學(xué)界利用規(guī)范的一個(gè)收獲是，只要接受了這種規(guī)范，就有了一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)選擇那些可以肯定有解的問(wèn)題。”〔1〕30“有了一種規(guī)范，有了規(guī)范所容許的那種更深?yuàn)W的研究，這是任何一個(gè)科學(xué)部門(mén)達(dá)到成熟的標(biāo)志?！薄?〕9企業(yè)社會(huì)責(zé)任的提出、內(nèi)容的界定以及最終形成共識(shí)被確定為評(píng)判企業(yè)非經(jīng)濟(jì)層面行為的規(guī)則和標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)現(xiàn)了企業(yè)倫理從寬泛的而又抽象的甚至有點(diǎn)空洞的企業(yè)文化研究轉(zhuǎn)變到務(wù)實(shí)的社會(huì)責(zé)任研究上，渡過(guò)了企業(yè)倫理研究對(duì)象模糊不清的階段，這是它成熟的一種標(biāo)志。

加水?dāng)嚧蚓鶆颍毫纤葹?∶2（g∶mL），經(jīng)高速勻漿后，水浴加熱至50 ℃，并調(diào)節(jié)pH至7.0。

酶解：加酶量為每30 g鯪魚(yú)下腳料加入0.06 g酶，溫度為50 ℃，攪拌均勻，于恒溫振蕩器中50 ℃恒溫酶解6 h，能使蛋白酶酶解充分。

滅酶：酶解結(jié)束后，將酶解液加熱至90～95 ℃滅酶20 min。

離心：4 800 r/min，20 min。離心充分能使不溶物和懸浮物沉淀，過(guò)濾后取上清液即為酶解液。

1.3.2 酵母發(fā)酵酶解液條件的優(yōu)化

分別以料水比、接種量、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度為單因素，以水解度為指標(biāo)，研究這4個(gè)因素對(duì)鯪魚(yú)下腳料酶解液水解度的影響。

1.3.3 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以接種量A、發(fā)酵時(shí)間B、發(fā)酵溫度C進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)，確定發(fā)酵最佳條件。

蛋白含量測(cè)定：考馬斯亮藍(lán)法[13]；氨基酸含量測(cè)定：茚三酮比色法[14]；水解度（degree of hydrolysis，DH）計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 料水比對(duì)鯪魚(yú)下腳料酶解液酶解效果的影響

圖1 料水比對(duì)酶解液水解度的影響Fig.1 Effect of material to water ratio on hydrolysis degree of enzymatic hydrolysate

酶解液與水的比例會(huì)影響酵母菌的發(fā)酵環(huán)境，料水比過(guò)低時(shí)底物濃度過(guò)大，發(fā)酵液過(guò)稠，不利于酵母菌的生長(zhǎng)發(fā)酵；料水比過(guò)高會(huì)稀釋酵母濃度，進(jìn)而影響發(fā)酵的效率。試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，各處理對(duì)鯪魚(yú)下腳料酶解液的水解度與空白對(duì)照相比，隨著加水量的升高，水解度均有所提高，但在料水比＞1∶15（g∶mL）后，水解度增加幅度較小，添加量1∶25時(shí)，水解度最高為25.09%，綜合試驗(yàn)結(jié)果和經(jīng)濟(jì)效益，選用最佳料水比為1∶15（g∶mL）。

2.2 接種量對(duì)鯪魚(yú)下腳料酶解液酶解效果的影響

活化后的酵母接種量對(duì)鯪魚(yú)下腳料酶解液酶解效果的影響見(jiàn)圖2。水解度隨接種量增大而增加，在接種量達(dá)到1.0%時(shí)，水解度最高為26.57%，隨后鯪魚(yú)下腳料酶解液的水解度開(kāi)始下降。這說(shuō)明酵母菌的加入能有效提高增加鯪魚(yú)下腳料酶解液中可溶性氨基酸的含量，提高其水解程度。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇適宜接種量為1.0%。

圖2 接種量對(duì)酶解液水解度的影響Fig.2 Effect of inoculum on hydrolysis degree of enzymatic hydrolysate

2.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)鯪魚(yú)下腳料酶解液酶解效果的影響

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酶解液水解度的影響Fig.3 Effect of fermentation time on hydrolysis degree of enzymatic hydrolysate

適宜的發(fā)酵時(shí)間有利于酵母菌的增殖，也有利于酵母菌適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境，充分發(fā)揮其活性，提高鯪魚(yú)下腳料酶解液中的各類(lèi)蛋白質(zhì)的含量。由圖3可知，鯪魚(yú)下腳料酶解液的水解度隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為1.5 h時(shí)，水解度為26.65%；1.5 h后水解度略下降，可能是隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，鯪魚(yú)下腳料酶解液中水解產(chǎn)物增加，使其黏度加大，影響了反應(yīng)的進(jìn)行。因此選擇適宜的發(fā)酵時(shí)間為1.5 h。

2.4 發(fā)酵溫度對(duì)鯪魚(yú)下腳料酶解液酶解效果的影響

溫度是影響酵母菌發(fā)酵的重要因素之一，溫度過(guò)低會(huì)影響發(fā)酵的速度，而溫度過(guò)高則可能造成一些雜菌的生長(zhǎng)，也可能產(chǎn)生不良的風(fēng)味。由圖4可知，在20～35 ℃發(fā)酵溫度范圍內(nèi)，鯪魚(yú)下腳料酶解液發(fā)酵后的水解度隨溫度增加呈上升趨勢(shì)。當(dāng)發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)，水解度增加趨于平緩。根據(jù)酵母菌的最適生長(zhǎng)溫度，選擇適宜發(fā)酵溫度為30 ℃。

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)酶解液水解度的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on hydrolysis degree of enzymatic hydrolysate

2.5 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

選擇接種量（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、發(fā)酵溫度（C）3個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平見(jiàn)表1，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 鯪魚(yú)下腳料酶解液發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for enzymatic hydrolysate fermentation conditions optimization of mud carp by-product

表2 鯪魚(yú)下腳料酶解液發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiment for enzymatic hydrolysate fermentation conditions optimization of mud carp by-product

從表2的正交試驗(yàn)分析結(jié)果可知影響因素主次順序?yàn)锳＞B＞C。根據(jù)正交試驗(yàn)表結(jié)果，初步確定鯪魚(yú)下腳料酶解液發(fā)酵的最佳條件是A2B3C1，即在接種量為1.0%，發(fā)酵時(shí)間為2.0 h，發(fā)酵溫度為25 ℃時(shí)，鯪魚(yú)下腳料酶解液水解度最高。

在最優(yōu)發(fā)酵條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得水解度3次重復(fù)平均值為（41±2）%，驗(yàn)證結(jié)果與正交試驗(yàn)結(jié)果相近，說(shuō)明優(yōu)化后的條件基本穩(wěn)定可行，重復(fù)性好。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化了酵母菌發(fā)酵鯪魚(yú)下腳料酶解液的最佳條件為料水比1∶15（g∶mL）、接種量1.0%、發(fā)酵時(shí)間2.0 h、發(fā)酵溫度25 ℃。在此條件下最后得到的鯪魚(yú)下腳料酶解液水解度為41%。

利用微生物發(fā)酵魚(yú)類(lèi)下腳料，將其轉(zhuǎn)化為可利用的優(yōu)質(zhì)蛋白飼料，可一定程度上提高魚(yú)類(lèi)下腳類(lèi)的資源利用率。而菌種是影響到發(fā)酵效果的最主要因素，酵母菌作為常見(jiàn)的生產(chǎn)菌體蛋白的微生物之一，本身就含有一定量的蛋白質(zhì)和氨基酸[9，15-16]。因此加工企業(yè)在考慮經(jīng)濟(jì)效益和產(chǎn)品質(zhì)量的條件下，選擇優(yōu)良的酵母品種、適當(dāng)酵母添加量或是與其他微生物混合發(fā)酵，更好地提高鯪魚(yú)下腳料酶解液中的粗蛋白和氨基酸態(tài)氮含量。

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