白藜蘆醇在大鼠肝微粒體中的代謝動力學(xué)研究

任 平，王文斌

(1.湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北咸寧437100;2.咸寧市中心醫(yī)院)

1 材料與方法

1.1 儀器

Shimadzu N3000高效液相色譜系統(tǒng)(北京創(chuàng)新通恒)，3-30K高速臺式冷凍型離心機 (德國sigma公司)，美國Biotek synergy2多功能酶標儀，分析天平(A＆D.Company.L imited.Tokyo.Japan)

1.2 試劑與藥品

白藜蘆醇(純度≥98%，由西安天一生物工程技術(shù)有限公司提供)，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G-6-PD)，葡萄糖-6-磷酸單鈉鹽(glucose-6-phosphate monosodiun salt，G-6-P)，輔酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP)均為美國Sigma公司產(chǎn)品，BCA試劑盒(南京建成)，地塞米松磷酸鈉注射液(江蘇漣水制藥有限公司)，苯巴比妥鈉(上海新亞有限公司)，其余均為國產(chǎn)分析純化學(xué)試劑。

1.3 試驗方法

1.3.1 大鼠預(yù)處理

9只健康雄性SD大鼠(Sprague-Danley)給予普通飼料喂養(yǎng)1周后，隨機分為3組，即正常對照組、苯巴比妥誘導(dǎo)組、地塞米松誘導(dǎo)組。對照組腹腔注射生理鹽水10ml·kg-1·d-1，連續(xù)3d;PB組PB溶于生理鹽水，腹腔注射80mg·kg-1·d-1，連續(xù)3d;DEX組DEX腹腔注射75mg·g-1·d-1，連續(xù)3d。

1.3.2 肝微粒體的制備

動物末次給藥24h后斷頭處死動物，剖腹，用注射器吸取經(jīng)冰浴冷卻的生理鹽水，經(jīng)胸動脈或門靜脈注入肝臟，灌流，除去肝中血液。取出肝臟，采用鈣沉淀法［4］制備肝微粒體。以BCA法［5］測定肝微粒體的蛋白濃度。

1.3.3 溫孵條件

郭文安：從五院?！督逃龑W(xué)》到《教育學(xué)》(新編本)(王道俊、王漢瀾主編)再到《教育學(xué)》(第六版、第七版)(王道俊、郭文安主編)，我們經(jīng)歷了一個從蒙昧到啟蒙，再發(fā)展到自覺求索的歷程。

孵育體系總體積250μl，反應(yīng)體系中包含新鮮配制的 NADPH再生系統(tǒng)(NADP 4mmol·L-1，G6PD 4μmol/ml·ml-1，G6P 10mmol·L-1)，微粒體蛋白(1g·L-1)，0.1mol·L-1Tris-0.3mol·L-1KCl-20mmol·L-1MgCl2緩沖液(pH7.4)。白藜蘆醇和酮康唑用不同比例的甲醇配制，反應(yīng)體系中甲醇終體積分數(shù)小于1%。反應(yīng)于37℃水浴中溫孵震蕩，預(yù)孵5min，加入NADPH啟動反應(yīng)，反應(yīng)完畢立即取出，加入乙腈0.5ml終止反應(yīng)。

1.3.4 樣品處理

肝微粒體溫孵反應(yīng)結(jié)束后，立即加入0.5ml乙腈，振旋 3min，12000rpm 離心 5min，取上清20μl進HPLC系統(tǒng)，采用峰面積外標法定量分析，測定白藜蘆醇的濃度。

1.3.5 色譜條件

色譜柱為 Nucleodur C18(250mm×4.6mm，5μm)反相柱;流動相為超純水-乙腈(35∶65，V∶V);檢測波長為303nm;流速為1.0ml·min-1;柱溫為 25℃;進樣量為 20μl。

1.3.6 白藜蘆醇代謝的酶促動力學(xué)研究

白藜蘆醇(終濃度為 6.25，12.5，25，50，75 和100μmol·L-1)在空白對照組和DEX組的肝微粒體(蛋白濃度為1g·L-1)的反應(yīng)體系中，在37℃的條件下溫孵30min。

1.3.7 白藜蘆醇在各誘導(dǎo)劑組大鼠肝微粒體溫孵液中代謝影響的比較

將各組肝微粒體組分懸浮液適量(蛋白濃度為 1g·L-1)分別與白藜蘆醇(25，50μmol·L-1)在NADPH再生溫孵體系中共同溫孵，觀察白藜蘆醇在各溫孵體系中的代謝。

1.3.8 代謝抑制實驗

孵育條件同前，孵育體系中白藜蘆醇濃度為50μmol·L-1，微粒體蛋白質(zhì)量濃度為 1mg·ml-1，孵育時間為30min，實驗中所用的酮康唑濃度為6.25，12.5，25，50，100μmol·L-1，對照組用等量的緩沖鹽代替抑制劑。抑制程度按抑制劑濃度為0時代謝量為100%計算。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 線性范圍及最低檢測限

在每200μl空白對照組肝微粒體中，分別加入白藜蘆醇一系列標準品溶液，配制濃度分別為0.5，1，2，4，8，16，32，64，132μmol·L-1，按上述樣品處理步驟操作，并進行色譜分析。以白藜蘆醇標準對照品的峰面積(Y，A)對相應(yīng)的濃度(X，μmol·L-1)進行線性回歸，得血漿標準曲線方程為:Y=60.573+3795.1，r=0.9991，線性范圍 0.5～132μmol·L-1。本法測定肝微粒體中白藜蘆醇的最低定量限為0.03μmol·L-1。

2.2 白藜蘆醇在大鼠肝微粒體酶中的代謝

2.2.1 微粒體酶對不同濃度白藜蘆醇的代謝

在蛋白質(zhì)量濃度為1g·L-1的DEX誘導(dǎo)組和空白對照組的肝微粒體酶中，分別加入不同濃度的白藜蘆醇(終濃度 3.125，6.25，12.5，25，50，100μmol·L-1)，37℃水浴中孵育 30min，測定白藜蘆醇濃度。以白藜蘆醇原始濃度為橫坐標，對白藜蘆醇代謝速率為縱坐標作圖。由圖可見，當白藜蘆醇濃度大于50μmol·L-1，其代謝速率并未隨白藜蘆醇濃度的增加而呈線性增加，表現(xiàn)出明顯的代謝飽和特性。且白藜蘆醇在DEX誘導(dǎo)組的代謝速率明顯高于空白對照組，結(jié)果見圖1。

圖1 白藜蘆醇在地塞米松與空白對照組的肝微粒體中代謝速率的比較

2.2.2 白藜蘆醇在不同誘導(dǎo)組大鼠肝微粒體的代謝

經(jīng)DEX，PB誘導(dǎo)后，白藜蘆醇在大鼠肝微粒體中的代謝明顯提高，其代謝速率分別與空白對照組比較差異有顯著性(P＜0.01)，結(jié)果見表1。

表1 白藜蘆醇在不同處理組的消除速率比較(s，n=3)

表1 白藜蘆醇在不同處理組的消除速率比較(s，n=3)

與對照組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與 DEX 比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 底物濃度(μmol·L-1)剩余濃度(nmol·L-1)代謝速率(nmol·min-1·mg protein-1)DEX組25 4.05±0.52* 1.42±0.007*50 8.97±1.47* 3.27±0.02＊＊PB組25 8.05±1.53* 1.06±0.03＊＊#50 10.47±3.49* 2.16±0.04＊＊##25 10.95±4.33 0.35±0.01 50 24.07±5.93 0.73±0.03對照組

2.2.3 CYP3A特異性抑制劑對白藜蘆醇代謝的影響

CYP3A的特異性抑制劑Ket在6.25μmol·L-1可以抑制白藜蘆醇的代謝(P＜0.01)，降低白藜蘆醇的代謝速率，并呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。以抑制劑的濃度為橫坐標，藥物的代謝率為縱坐標(按抑制劑濃度為0時代謝量為100%計算)作圖，結(jié)果見圖2。

圖2 CYP3A選擇性抑制劑對大鼠肝微粒體中白藜蘆醇代謝的影響，白藜蘆醇濃度為25μmol·L-1(n=3，s)

3 討論

以肝臟為基礎(chǔ)的微粒體代謝模型，以其特有的優(yōu)勢在藥物代謝研究中得到廣泛應(yīng)用。一般采用特異性誘導(dǎo)劑在體誘導(dǎo)肝微粒體CYP450，用其微粒體孵育，DEX主要誘導(dǎo)CYP3A，PB主要誘導(dǎo)CYP2B、2C。此方法能比較全面地反映藥物在生物體內(nèi)的代謝情況，具有制備方便、重現(xiàn)性好，酶混合體系易保存和孵育條件易優(yōu)化等優(yōu)點［6］。研究結(jié)果顯示，白藜蘆醇在大鼠肝微粒體中被迅速代謝;在 3.125～50μmol·L-1，蛋白質(zhì)量濃度為1mg·ml-1，白藜蘆醇代謝基本呈線性消除。當白藜蘆醇濃度超50μmol·L-1時，藥物的消除速率不再隨底物濃度的增加而呈線性增加，表現(xiàn)出代謝的飽和特性。觀察白藜蘆醇在誘導(dǎo)后的大鼠肝微粒體溫孵液中代謝，結(jié)果表明，白藜蘆醇在DEX，PB，誘導(dǎo)的大鼠肝微粒體中的代謝明顯提高，其代謝率與空白對照組相比差異有顯著性(P＜0.01或P＜0.05)。這說明 CYP3A、CYP2B、CYP2C可能參與白藜蘆醇的代謝。在PB誘導(dǎo)的大鼠肝微粒體中的代謝明顯低于其在DEX組中的代謝(P＜0.01)，可見CYP2B、CYP2C雖然可能參與白藜蘆醇的代謝，但其催化白藜蘆醇代謝轉(zhuǎn)化的作用僅處于次要地位。且CYP2B對肝臟藥物代謝的作用較為有限，故CYP2B參與其代謝意義不大。PB雖然主要誘導(dǎo) CYP2B，CYP2C，同時也誘導(dǎo)CYP3A［7］，這提示PB誘導(dǎo)的肝微粒體內(nèi)白藜蘆醇代謝的加快可能還與CYP3A被誘導(dǎo)有關(guān)。通過研究CYP3A特異性抑制劑Ket對白藜蘆醇代謝的影響進一步了解白藜蘆醇代謝與CYP3A的關(guān)系。本實驗中Ket可以顯著地抑制白藜蘆醇在肝微粒體溫孵液中的代謝，該抑制作用有劑量依賴性。此結(jié)果進一步表明CYP3A可能是催化白藜蘆醇代謝的主要亞酶。藥物代謝性相互作用是影響藥物在體內(nèi)濃度水平的一個重要因素。如果抑制白藜蘆醇經(jīng)CYP3A，CYP2B，CYP2C的代謝，將會降低其代謝速率，提高白藜蘆醇在體內(nèi)的水平。這提示CYP3A，CYP2C，CYP2E1的抑制劑與白藜蘆醇之間有潛在的藥物相互作用，前者可以降低白藜蘆醇的代謝速率。本研究對白藜蘆醇體外代謝作了初步的探討，為進一步藥物相互作用研究和進行開發(fā)利用提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

［1］黎永勝，文軍.白藜蘆醇的藥理作用研究進展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2008，14(3):469

［2］周麗，董永海，胡傳來，等.HPLC法測定葡萄汁(酒)中的白藜蘆醇和白藜蘆醇苷［J］.營養(yǎng)學(xué)報，2010，32(1):86

［3］張瑞，汪電雷，張弦，等.高效液相色譜法測定大鼠血漿中白藜蘆醇含量及其藥物代謝動力學(xué)［J］.安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010，29(5):56

［4］徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實驗方法學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1994:489

［5］方福德，周呂，丁濂，等.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實驗技巧全書(上冊)［M］.北京:北京醫(yī)科大學(xué)中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1995:562

［6］Donato MT，Castell，JV.Strategies and molecular probes toinvestigate the role of cytocbrome P450 in drug metabolism［J］.Clin Pharmacokinet，2003，42:153

［7］Morrison VM，Burnett AK，Crafe JA.Metabolism of 7，12-dimethyl-benz［a］anthracene in hepatic microsomal membranes from rats treated with isoenzyme selective inducers of cytochromes P450［J］.Biochem Pharmacol，1991，41(10):1219