成年大鼠局灶腦缺血/再灌注后海馬BDNFmRNA 和bFGF mRNA的動(dòng)態(tài)變化研究

黃艷君　羅　勇　張中念　曹飛虎　董　明　宋曉靈　張弟文

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成年大鼠局灶腦缺血/再灌注后海馬BDNFmRNA 和bFGF mRNA的動(dòng)態(tài)變化研究

黃艷君羅勇張中念曹飛虎董明宋曉靈張弟文

【摘要】目的觀察局灶腦缺血/再灌注大鼠海馬腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF) mRNA和堿性成纖維生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF ) mRNA的動(dòng)態(tài)表達(dá)。方法將108只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為正常組(NC組)、假手術(shù)組(SC組)、模型組(I/R組)，每組再于缺血1h后再灌注于1，3，7，14，21，28d六個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行觀察，正常組和假手術(shù)組于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)同步觀察。采用線栓法制備大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈局灶腦缺血/再灌注模型。應(yīng)用原位雜交法檢測(cè)大鼠缺血再灌注后1，3，7，14，21，28d缺血側(cè)海馬BDNF mRNA和bFGF mRNA表達(dá)。結(jié)果正常海馬區(qū)可見(jiàn)少量BDNF mRNA和bFGF mRNA的陽(yáng)性表達(dá)。BDNF mRNA陽(yáng)性反應(yīng)主要集中于齒狀回顆粒細(xì)胞以及CA2、CA3中的錐體細(xì)胞胞漿中，bFGF mRNA主要位于海馬錐體細(xì)胞層、CA1、CA2區(qū)。局灶腦缺血/再灌注后，I/R組缺血側(cè)海馬BDNF mRNA表達(dá)增加，主要見(jiàn)于齒狀回顆粒細(xì)胞層和錐體細(xì)胞層。缺血/再灌注后1d時(shí)BDNF mRNA陽(yáng)性反應(yīng)即有增多，3d時(shí)達(dá)到高峰(P＜0.01)，陽(yáng)性產(chǎn)物染色較深，7d后迅速下降(P＜0.01)，28d時(shí)接近正常水平。局灶腦缺血/再灌注后，I/R組缺血側(cè)海馬可見(jiàn)bFGF mRNA的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，1d時(shí)開(kāi)始增加(P＜0.05)，3d即達(dá)一小高峰(P＜0.01)，7d開(kāi)始下降，21d時(shí)明顯下降，28d時(shí)降到正常水平(P＜0.05)。結(jié)論局灶腦缺血/再灌注可上調(diào)BDNF mRNA和bFGF mRNA的表達(dá)，有利于腦缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)，具有神經(jīng)保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】局灶腦缺血/再灌注; BDNFmRNA; bFGF mRNA;海馬;大鼠

作者單位:621000綿陽(yáng)市第三人民醫(yī)院(黃艷君，張中念，曹飛虎，董明，宋曉靈，張弟文)，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(羅勇) ;重慶市神經(jīng)病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(羅勇)

在腦缺血的恢復(fù)過(guò)程中，神經(jīng)細(xì)胞的再生和細(xì)胞間突觸聯(lián)系的重建或重組是關(guān)鍵，而腦內(nèi)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的恢復(fù)密切相關(guān)，對(duì)神經(jīng)再生、神經(jīng)元遷移、軸突的發(fā)芽、延長(zhǎng)和成束以及正確神經(jīng)環(huán)路的形成起著重要作用。本研究觀察了局灶腦缺血/再灌注大鼠腦內(nèi)海馬區(qū)域BDNF mRNA和bFGF mRNA的動(dòng)態(tài)變化，以探討受損腦組織的自我修復(fù)機(jī)制，為通過(guò)“非藥物”手段調(diào)控某些化學(xué)信號(hào)因子提供理論基礎(chǔ)，為缺血性腦血管疾病的防治開(kāi)辟新的途徑，以期為臨床的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供客觀實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取健康雄性Wistar大鼠108只，清潔級(jí)，8周齡，體質(zhì)量250～300g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠術(shù)前12h禁食不禁水。實(shí)驗(yàn)組:大鼠隨機(jī)分為正常組(NC組)、假手術(shù)組(SC組)、模型組(I/R組)，每組根據(jù)再灌注時(shí)間的不同又分為1，3，7，14，21，28d 6個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行觀察(n=6)。均于缺血后1h行再灌注，假手術(shù)組(SC 組)分離頸外動(dòng)脈并結(jié)扎遠(yuǎn)端，線栓插入頸內(nèi)動(dòng)脈但不栓塞大腦中動(dòng)脈。正常組不造模。

1.1.2試劑針對(duì)大鼠BDNF靶基因的mRNA序列的寡核甘酸探針:5＇－CTTAC TATGG TTATT TCATA CTTTG GTTGC－3＇; 5＇－GCTGA GCGTG TGTGA CAGTA TTAGT GAGTG－3＇; 5＇－ACACT TCTTG TGTAT GTACA TTGAC CATTA－3＇。針對(duì)大鼠bFGF靶基因的mRNA序列的寡核甘酸探針: 5＇－GGCTT CTTCC TGCGC ATCCA CCCCG ACGGC－3＇;5＇－AGCAG AAGAG AGAGG AGTTG TGTCT ATCAA－3＇; 5＇－TGGAA TCTAA TAACT ACAAT ACTTA CCGGT－3＇。(探針由武漢博士德生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成并用地高辛標(biāo)記)。原位雜交試劑盒和原位雜交專(zhuān)用蓋玻片(武漢博士德)，DAB顯色劑(北京中山) ; DEPC和Poly－L－Lysine(Sigma(USA) )。

1.2方法

1.2.1模型制作根據(jù)Longa等［1］報(bào)道的方法，參照羅勇等［2］的經(jīng)驗(yàn)，采用線栓法制備右側(cè)大腦中動(dòng)脈局灶腦缺血/再灌注模型(middle cerebral artery occlusion，MCAO) ;栓塞成功的大鼠缺血1h，再次麻醉，拔出線栓至頸外動(dòng)脈殘端內(nèi)，實(shí)現(xiàn)再灌注。模型成功標(biāo)準(zhǔn):左側(cè)肢體疼痛回縮遲鈍或消失，提尾倒懸時(shí)左上肢向胸前屈曲，行走時(shí)向左側(cè)傾倒或向左轉(zhuǎn)圈;右側(cè)出現(xiàn)霍納(Honer＇s)氏征。排除標(biāo)準(zhǔn):神經(jīng)學(xué)癥狀評(píng)分低于2分者(評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照1.2.4神經(jīng)癥狀學(xué)評(píng)分)，蛛網(wǎng)膜下腔出血者，HE染色無(wú)缺血病理改變者，未到觀察時(shí)相點(diǎn)死亡者。凡因上述因素導(dǎo)致各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物數(shù)不足預(yù)定數(shù)量者采用隨機(jī)抽樣原則補(bǔ)齊。

1.2.2TTC染色TTC是脂溶性光敏感的復(fù)合物，與活細(xì)胞線粒體內(nèi)脫氫酶反應(yīng)生成深紅色脂溶性物質(zhì)，死亡細(xì)胞由于線粒體脫氫酶失活而不顯色，即TTC染色正常組織產(chǎn)生紅色，而缺血組織呈蒼白色。其主要步驟是:大鼠MCAO1h再灌注24h后斷頭取腦，－20℃下10min，連續(xù)冠狀切片(片厚約2mm)。腦片置于2% TTC (PH7.2) 37℃孵育30min，0.1 MPBS溶液沖洗2－3次，并拍照。

1.2.3HE染色石蠟切片常規(guī)脫蠟至水;蘇木素染色:切片置蘇木素染液5min，洗去多余的染料;分色和返藍(lán):切片先后入鹽酸酒精和氨水溶液中至細(xì)胞核變藍(lán);伊紅復(fù)染:將返藍(lán)的切片充分水洗，1%伊紅水溶液中5min;梯度酒精脫水、封片。

1.2.4神經(jīng)功能評(píng)分參照Z(yǔ)ea Longa 5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［1］，大鼠清醒后評(píng)分: 0分，無(wú)神經(jīng)功能缺失癥狀;1分，輕度局灶性神經(jīng)功能缺失(不能完全伸展左側(cè)前肢) ;2分，中度局灶性神經(jīng)功能缺失(向左側(cè)轉(zhuǎn)圈) ;3分，中度局灶性神經(jīng)功能缺失(向左側(cè)傾倒) ;4分，不能自發(fā)行走，意識(shí)水平降低。所有動(dòng)物于腦缺血/再灌注后1，6，12h，1，3，7d進(jìn)行評(píng)定。分值越高，說(shuō)明動(dòng)物行為障礙越嚴(yán)重。

1.2.5固定、取材、切片于腦缺血再灌注后1，3，7，14，21，28d，經(jīng)左心室常規(guī)灌注固定，開(kāi)顱取腦，由前向后作冠狀切片，取經(jīng)海馬腦組織塊各1塊，行固定、脫水、浸蠟、包埋、石蠟切片(片厚4μm)。取材部位:海馬(A－P坐標(biāo)，bregma－4.5至bregma－3.14mm)。

1.2.6原位雜交檢測(cè)海馬bFGF mRNA、BDNF mRNA表達(dá)按常規(guī)SABC法進(jìn)行。陰性對(duì)照用預(yù)雜交液代替雜交液，用正常羊血清代替地高辛抗體，其余步驟相同。

1.2.7圖像分析將切片在統(tǒng)一放大倍數(shù)(×200)下，隨機(jī)選擇10個(gè)非重疊視野，以缺血側(cè)海馬為觀察部位，每個(gè)時(shí)相點(diǎn)6只動(dòng)物，每只動(dòng)物的每個(gè)部位隨機(jī)取5張非連續(xù)切片，應(yīng)用重慶醫(yī)科大學(xué)電鏡室北航CM－2000B型生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行自動(dòng)計(jì)算平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.3統(tǒng)計(jì)方法所得數(shù)據(jù)用(x—±s)表示，采用SAS8.2統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用F檢驗(yàn)，P ＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1TTC染色各組大鼠在局灶腦缺血/再灌注24h后取腦行TTC染色，NC組和SC組呈紅色，I/R可見(jiàn)明顯梗塞灶，缺血累及頂葉、顳葉、額葉皮質(zhì)及基底節(jié)區(qū)等深部組織，符合大腦中動(dòng)脈供血范圍。見(jiàn)圖1。

圖1　局灶腦缺血/再灌注1d各組大鼠腦梗塞體積:正常為紅色，梗塞區(qū)呈白色(TTC染色)

圖2　正常組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)

圖3　局灶腦缺血1h/再灌注1d時(shí)梗死病灶:右側(cè)IA為梗死區(qū)(HE染色)

圖4　局灶腦缺血/再灌注1d時(shí)缺血腦組織稀疏，神經(jīng)細(xì)胞大量脫失

圖5　局灶腦缺血/再灌注7d時(shí)缺血腦組織變化

2.2HE染色光鏡下見(jiàn)NC組和SC組大腦皮質(zhì)細(xì)胞排列有序，組織結(jié)構(gòu)完整，核清楚，核仁明顯，胞漿染色均勻，胞膜完整; I/R組術(shù)后可見(jiàn)右側(cè)大腦中動(dòng)脈區(qū)腦缺血灶，缺血核心區(qū)細(xì)胞變性、壞死，鏡下可見(jiàn)核固縮，核仁消失，胞漿疏松，間質(zhì)水腫;缺血/再灌注后1d時(shí)，I/R組組織水腫、疏松;缺血中心區(qū)片狀組織壞死，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn);缺血周邊區(qū)神經(jīng)細(xì)胞不規(guī)則，核固縮，7d時(shí)I/R組可見(jiàn)大量神經(jīng)元細(xì)胞死亡，留下很多空泡，至14d時(shí)，I/R組缺血區(qū)見(jiàn)膠質(zhì)細(xì)胞廣泛增生，缺血中央?yún)^(qū)出現(xiàn)液化壞死腔，常被瘢痕取代。見(jiàn)圖2－圖5。

2.3神經(jīng)癥狀學(xué)評(píng)分正常組和假手術(shù)組未評(píng)分，I/R組局灶腦缺血/再灌注后1h均出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損，隨著缺血/再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，神經(jīng)功能缺失癥狀逐漸減輕。見(jiàn)表1。

表1　大鼠局灶腦缺血/再灌注后神經(jīng)功能評(píng)分

2.4海馬區(qū)BDNF mRNA陽(yáng)性反應(yīng)光鏡下BDNF mRNA陽(yáng)性反應(yīng)主要集中于齒狀回顆粒細(xì)胞以及CA2、CA3中的錐體細(xì)胞胞漿中，胞核不染色。局灶腦缺血/再灌注后，I/R組缺血側(cè)海馬BDNF mRNA表達(dá)增加，主要見(jiàn)于齒狀回顆粒細(xì)胞層和錐體細(xì)胞層。缺血/再灌注后1d時(shí)BDNF mRNA陽(yáng)性反應(yīng)即有增多，3d時(shí)達(dá)到高峰(P＜0.01)，陽(yáng)性產(chǎn)物染色較深，7d后迅速下降(P＜0.01)，14d后明顯下降(P＜0.01)，21d后進(jìn)一步下降(P＜0.05)，28d時(shí)接近正常水平。見(jiàn)表2。

2.5海馬區(qū)bFGF mRNA的陽(yáng)性表達(dá)正常海馬區(qū)可見(jiàn)少量bFGF mRNA的陽(yáng)性表達(dá)，主要位于海馬錐體細(xì)胞層、CA1、CA2區(qū)，SC組與NC組變化相似，比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。局灶腦缺血/再灌注后，I/R組缺血側(cè)海馬可見(jiàn)bFGF mRNA的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，1d時(shí)開(kāi)始增加(P＜0.05)，3d即達(dá)一小高峰(P＜0.01)，7d開(kāi)始下降，21d時(shí)明顯下降，28d時(shí)降到正常水平(P＜0.05)，與NC組和SC組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表3。

表2　各實(shí)驗(yàn)組海馬區(qū)BDNF mRNA的表達(dá)水平(光密度)

表3　各實(shí)驗(yàn)組海馬區(qū)bFGF mRNA的表達(dá)水平(光密度)

3　討　論

神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是神經(jīng)系統(tǒng)重要的生物活性因子，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的正常分化、發(fā)育、成熟、維持功能和存活、損傷修復(fù)等均具有重要的生物學(xué)作用。BDNF是廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種蛋白質(zhì)，是1982年德國(guó)神經(jīng)生物學(xué)家Brade等首次從豬腦中純化獲得。BDNF表達(dá)廣泛，包括大腦皮質(zhì)、海馬、基底前腦、紋狀體、下丘腦、小腦，其中皮質(zhì)和海馬含量最高［3］。BDNF具有增殖分化營(yíng)養(yǎng)的作用，使其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中起重要作用。BDNF能減少缺血引起的梗死面積，保護(hù)半影區(qū)神經(jīng)元，并能抑制遲發(fā)性神經(jīng)元壞死［4］。

本實(shí)驗(yàn)觀察到，在正常腦組織中，BDNF mRNA表達(dá)廣泛，但陽(yáng)性反應(yīng)很弱。局灶腦缺血/再灌注后3d，BDNF mRNA在缺血側(cè)海馬可達(dá)一小高峰。而胡躍強(qiáng)等［5］采用線栓法制作局灶性腦缺血大鼠模型，研究缺血半暗帶BDNF mRNA及其蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)缺血再灌注后3h開(kāi)始明顯上升，6h表達(dá)繼續(xù)增強(qiáng)，12h達(dá)高峰，3d后表達(dá)開(kāi)始減弱，7d后降至基礎(chǔ)水平，與本研究結(jié)果有所不一致。研究發(fā)現(xiàn)，BDNF mRNA及其受體TrkB在靶神經(jīng)元變性區(qū)域特異性上調(diào)，其上調(diào)發(fā)生在前3周，即細(xì)胞遷移、分化及整合階段，且在錐體神經(jīng)元進(jìn)行性凋亡的時(shí)期上調(diào)尤為明顯，表明BDNF可能參與并影響了腦損傷后新生細(xì)胞的增殖、分化和移行［6］。

bFGF是多肽神經(jīng)生長(zhǎng)因子一員，具有強(qiáng)烈促增殖效應(yīng)的多肽因子，也是內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂原和血管再生因子［7－8］。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)bFGF首先可通過(guò)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用和通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的分裂和分化，促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管的形成與功能恢復(fù)［9］。bFGF還可通過(guò)提高抗氧化酶活性，清除自由基，防治腦缺血再灌注后的神經(jīng)細(xì)胞凋亡［10］。

正常情況下，腦內(nèi)僅有少量bFGF表達(dá)，當(dāng)腦受到各種損害時(shí)，即可誘導(dǎo)bFGF表達(dá)增加。本實(shí)驗(yàn)觀察到，在正常腦組織中，bFGF mRNA表達(dá)廣泛，但陽(yáng)性反應(yīng)較弱。局灶腦缺血/再灌注后3d，bFGF mRNA在缺血側(cè)海馬區(qū)可達(dá)一小高峰，7d后開(kāi)始下降，因bFGF是一個(gè)強(qiáng)效擴(kuò)管劑，可以在不引起全身血管擴(kuò)張的同時(shí)優(yōu)先擴(kuò)張腦血管或特異性擴(kuò)張梗塞周?chē)?，增加半影區(qū)的血供，減少梗塞面積［11］。bFGF是一種具有多種生物活性的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，其與相關(guān)聯(lián)的受體結(jié)合導(dǎo)致廣泛的細(xì)胞反應(yīng)，包括細(xì)胞增殖和分化、血管形成和抑制凋亡等［12］。推測(cè)局灶腦缺血/再灌注后內(nèi)源性bFGF mRNA的上調(diào)，對(duì)新生細(xì)胞的增殖、遷移、存活、分化都會(huì)起到積極作用。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，EGF促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，而bFGF則促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化成神經(jīng)元［13－14］。

目前認(rèn)為缺血性腦血管疾病是一個(gè)有眾多因素參與的復(fù)雜病理生理過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)在成年哺乳動(dòng)物(包括人類(lèi))側(cè)腦室外側(cè)壁的室下帶(SVZ)和海馬齒狀回(DG)的顆粒下層，還存在著持續(xù)的神經(jīng)發(fā)生(neurogenesis)現(xiàn)象［15－16］。即認(rèn)為存在具有自我更新和多分化潛能的神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell，NSC)。正常情況下成年腦內(nèi)的神經(jīng)干細(xì)胞大多處于靜息狀態(tài)，只有在某些因素作用下或者受到損傷刺激時(shí)，神經(jīng)干細(xì)胞才被激活，重新進(jìn)入細(xì)胞增殖周期，在趨化因子的作用下向損傷部位遷移，并進(jìn)一步分化為特定功能的神經(jīng)細(xì)胞。國(guó)內(nèi)有研究顯示腦梗死后在梗死灶周?chē)鶥DNF和bFGF表達(dá)均增加，但兩者表達(dá)時(shí)間并不一致，bFGF表達(dá)較BDNF早，BDNF主要表達(dá)于梗死灶區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞胞漿，而bFGF主要表達(dá)于梗死灶外周的神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞胞漿，在梗死中心區(qū)有少量細(xì)胞表達(dá)，表明BDNF和bFGF在腦梗死后的不同時(shí)間發(fā)揮保護(hù)作用［17］。石旺清等［18］研究發(fā)現(xiàn)大鼠腦缺血/再灌注后3 d，大鼠出現(xiàn)了明顯的神經(jīng)功能缺損及運(yùn)動(dòng)功能障礙，缺血區(qū)周邊組織神經(jīng)元凋亡亦達(dá)到高峰，同時(shí)bFGF和GAP－43表達(dá)增強(qiáng)，7d達(dá)到高峰，以后逐漸減弱，缺血周邊組織可見(jiàn)散在的新生神經(jīng)元，持續(xù)到28d。

研究表明，腦缺血后神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可在一定時(shí)間內(nèi)表達(dá)上調(diào)，而神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可調(diào)節(jié)合成代謝，修復(fù)受損神經(jīng)元并促進(jìn)神經(jīng)元的再生;另外其能刺激成年神經(jīng)元的軸突和樹(shù)突出芽，增強(qiáng)突觸遞質(zhì)的釋放，調(diào)節(jié)突觸傳遞，加強(qiáng)了突觸聯(lián)系，同時(shí)也能維持成熟神經(jīng)元的正常功能。高俊淑等［19］運(yùn)用探索學(xué)習(xí)訓(xùn)練腦缺血再灌注大鼠，采用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)大鼠腦梗死灶周?chē)鶥DNF陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量，發(fā)現(xiàn)探索學(xué)習(xí)組最高，對(duì)缺血性腦損傷起到保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)提示局灶缺血/再灌注后腦內(nèi)細(xì)胞分泌內(nèi)源性BDNF mRNA和bFGF mRNA，改善了腦內(nèi)神經(jīng)元生存環(huán)境而促進(jìn)神經(jīng)元再生修復(fù)。因臨床上對(duì)缺血性腦血管病患者的治療是長(zhǎng)期的，所以，通過(guò)“非藥物”手段調(diào)控內(nèi)源性BDNF mRNA和bFGF mRNA的合成和釋放，可避免給予外源性BDNF和bFGF所帶來(lái)的各種困難，將是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的方向之一。

參考文獻(xiàn)

［1］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20(1) :84－91.

［2］羅勇，董為偉.Wistar大鼠插線法局灶性腦缺血/再灌注模型的實(shí)驗(yàn)研究［J］.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，27(1) :1－4.

［3］Kim WS，Lim JY，Shin JH，et al.Effect of the presence of brainderived neurotrophic factor val(66) met polymor－phism on the recovery in patients with acute subcortical stroke［J］.Ann Rehabil Med，2013，37(3) :311－319.

［4］Endres M，F(xiàn)an G，Hirt L，et al.Ischemic brain damage in mice after selectively odifying BDNF or NT4 gene expression［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2000，20(1) :139－144.

［5］胡躍強(qiáng)，唐農(nóng)，劉泰，等.大鼠局灶性腦缺血再灌注后BDNF mRNA及其蛋白的表達(dá)變化［J］.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2011，28(3) :220－222.

［6］Wang Y，Sheen VL，Macklis JD.Cortical interneurons upregulate neurotro－phins in vivo in response to targeted apoptotic degeneration of neighboring pyramidal neurons［J］.Exp Neurol，1998，154 (2) :389－402.

［7］Eckenstein FP.J Neurobiol.Fibroblast growth factors in the nervous system［J］.1994，25(11) :1467－1480.

［8］Powell PP，F(xiàn)inklestein SP，Dionne CA，et al.Temporal，differential and regional expression of mRNA for basic fibroblast growth factor in the developing and adult rat brain［J］.Brain Res Mol Brain Res，1991，11(1) :71－77.

［9］Burger PE，Coetzee S，Mckeehan WL，et al.Fibroblast growth factor receptor－1 is expressed by endothelial progenitor cells［J］.Blood，2002，100(10) :3527－3535.

［10］Ay I，Sugimori H，F(xiàn)inklestein SP.Intravenous basic fibroblast growth factor (bFGF) decreases DNA fragmentation and prevents downregulation of Bcl－2 expression in the ischemic brain following middle cerebral artery occlusion in rats［J］.Brain Res Mol Brain Res，2001，87(1) :71－80.

［11］Tanaka R，Miyasaka Y，Yada K，et al.Fibroblast growth factor increases regional cerebral blood flow and reduces infarct size after experimental ischemia in a rat model［J］.Stroke，1995，26(11) : 2154－2159.

［12］Jin－qiao S，Bin S，Wen－h(huán)ao Z，et al.Basic fibroblast growth factor stimulates the proliferation and differentiation of neural stem cells in neonatal rats after ischemic brain injury［J］.Brain，2009，31(5) :331－340.

［13］Baldauf K，Reymann KG.Influence of EGF/bFGF treatment on proliferation，early neurogenesis and infarct volume after transient focal ischemia［J］.Brain Res，2005，1056(2) :158－167.

［14］Weickert CS，Kittell DA，Saunders RC，et al.Basic fibroblast growth factor and fibroblast growth factor receptor－1 in the human hippocampal formation［J］.Neuroscience，2005，131(1) : 219－233.

［15］Gage FH.Stem cells in the central nervous system［J］.Science，2000，287(5457) :1433－1438.

［16］Alvarez－Buylla A，Garcia－Verdugo JM.Neurogenesis in the adult subventricular zone［J］.J Neurosci，2002，22(3) :629－634.

［17］楊小艷，余昌胤，范瑞明.糖尿病大鼠缺血再灌注腦組織腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的表達(dá)及意義［J］.貴州醫(yī)藥，2008，32(2) :99－101.

［18］石旺清，鄭關(guān)毅，陳曉東，等.大鼠腦缺血/再灌注后bFGF和GAP－43的表達(dá)與神經(jīng)再生［J］.中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志，2013，29(1) :63－67.

［19］高俊淑，李闊，李娜，等.探索學(xué)習(xí)對(duì)局灶性腦梗死大鼠梗死灶周?chē)べ|(zhì)BDNF表達(dá)的影響［J］.中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2007，22 (7) :584－588.

論著·臨床

Study on dynamic changes of BDNF mRNA and bFGF mRNA in hippocampus of adult rats with focal cerebral ischemia/reperfusion

HUANG Yan－jun1，LUO Yong2，3，ZHANG Zhong－nian1，CAO Fei－h(huán)u1，SONG Xiao－ling1，ZHANG Diwen11The Third Hospital of Mianyang，Mianyang 621000，China2The Department of Neurology，the First Affiliated Hospital of Chongqing University of Medical Sciences，Chongqing 400016，China3Chongqing Key Laboratory of Neurology，Chongqing 400016，China

【Abstract】Objective To study on dynamic changes of BDNF mRNA and bFGF mRNA in hippocampus of adult rats with focal cerebral ischemia/reperfusion.Methods The animal model of focal cerebral ischemia/reperfusion was made by filament occlusion of the right middle cerebral artery.108 male Wistar rats were randomly divided into three groups: normal control group (NC group)，sham operation control group (SC group)，ischemia/reperfusion group (I/R group)，each group contain 1，3，7，14，21 and 28d six time points (for each point，n=6).In situ hybrization method was used to detect the number of BDNF mRNA and bFGF mRNA expression positive cells following various time in hippocampus of adult rats.Results Normally a small amount of BDNF mRNA and bFGF mRNA in hippocampus.After focal cerebral ischemia/reperfusion，the number of BDNF mRNA and bFGF mRNA positive cells increased at each time point，reached small peak value after 3 days(P＜0.01).Immunoprecipitates were dyed deeply，after 7 days decreased rapidly，28d decreased to normal level(P＜0.05).Conclusion Focal cerebral ischemia/reperfusion can up－regulated expression of BDNF mRNA and bFGF mRNA，Advantageous to the recovery of neural function after cerebral ischemia and have neuroprotective effect.

【Key words】Focal cerebral ischemia/reperfusion; BDNF mRNA; bFGF mRNA; hippocampus;Rat

(收稿日期:2015－01－30)

項(xiàng)目基金:四川省衛(wèi)生廳科研課題(080211)。

doi:10.11886/j.issn.1007-3256.2015.01.006

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

中圖分類(lèi)號(hào):R743.3