平衡針灸對(duì)肩周炎模型兔轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1、前列腺素E-2、羥脯氨酸影響的實(shí)驗(yàn)研究

袁紅 陳榕 黃大鵬 武燕 王穎 王文遠(yuǎn) 陳鋒

肩周炎是肩關(guān)節(jié)囊及周圍韌帶、肌腱、滑膜囊等肩關(guān)節(jié)周圍軟組織的退行性病變引起的肩部酸重疼痛及肩關(guān)節(jié)活動(dòng)受限、強(qiáng)直的臨床綜合征［1-2］。肩周炎根據(jù)其臨床表現(xiàn)、發(fā)病特點(diǎn)及發(fā)病年齡又可稱為“漏肩風(fēng)”、“五十肩”，是臨床常見(jiàn)病和多發(fā)病，屬于中醫(yī)“痹證”范疇。

平衡針是王文遠(yuǎn)教授在中醫(yī)學(xué)理論指導(dǎo)下，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期、反復(fù)的臨床摸索，總結(jié)出來(lái)的一種全新的針刺方法，強(qiáng)調(diào)人體的自我平衡修復(fù)功能，最大的特點(diǎn)在于單穴治療法［3-7］，例如:肩周炎的治療采用肩痛穴，穴名通俗化，快速針刺3 秒完成，強(qiáng)調(diào)針感的效應(yīng)，并取得鎮(zhèn)痛、改善肢體運(yùn)動(dòng)功能的即時(shí)效應(yīng)［8］，臨床上深受肩周炎患者的好評(píng)。

本實(shí)驗(yàn)從這一角度出發(fā)，選用肩周炎家兔為模型，采用組織形態(tài)學(xué)和酶聯(lián)免疫法、肌腱生化法等方法，觀察平衡針干預(yù)對(duì)肩周炎模型兔的血漿和局部組織炎性因子，致痛因子和局部病變組織的形態(tài)學(xué)等變化，試圖探討平衡針治療肩關(guān)節(jié)周圍炎的作用機(jī)理，為臨床上平衡針治療肩周炎提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

雄性新西蘭家兔30 只，體重2500 ±200 g，清潔級(jí)，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供［合格證號(hào):SCXK(京)2010-0002］，隨機(jī)將家兔分為3 組，每組10 只。(1)空白對(duì)照組:不做任何處理;(2)模型組:造肩周炎模型但不給予治療處理;(3)平衡針治療組:造成肩周炎模型后給予平衡針治療處理。

1.2 儀器與試劑

水平搖床(ZD-9556，江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠);韓氏穴位神經(jīng)刺激儀(LH202H，北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開發(fā)公司);毫針(規(guī)格:0.35 mm ×25 mm，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)。

1.3 家兔肩周炎模型復(fù)制

除空白對(duì)照組外，其余兩組家兔右肩部外側(cè)脫毛，面積為6 cm ×6 cm。家兔俯臥位固定，后肢和左前肢與兔臺(tái)固定，右前肢上臂與水平搖床固定。搖床搖動(dòng)頻率為240 次/分，振幅為1.5 cm 平行搖動(dòng)肩關(guān)節(jié)。每天持續(xù)固定搖晃6 小時(shí)，連續(xù)3 天，每次搖晃后即刻用自制冰袋外敷家兔右肩部，將兔固定于兔盒中，冰塊融化時(shí)及時(shí)更換新冰袋。每天持續(xù)6 小時(shí)，連續(xù)3 天［9-11］。

1.4 治療

平衡針治療組:平衡針治療在造模結(jié)束后次日開始進(jìn)行。每天1 次，7 次為一個(gè)療程，每個(gè)療程中間休息1 天，共治療3 個(gè)療程，于造模后第24 天取材。家兔左側(cè)“肩痛”穴(注:平衡針左病治右，右病治左，因而用的是左側(cè)肩痛穴，此穴位于腓骨小頭下1 cm 處)，針刺方法為:先在施針處常規(guī)消毒，繼以1 寸針灸針從“肩痛”穴直刺進(jìn)針，入針1 ～1.5 cm，主要運(yùn)用提插法，觀察家兔腿部有強(qiáng)烈的觸電樣抽搐感時(shí)，迅速出針不留針［12］，其余兩組不做治療同步飼養(yǎng)。

1.5 取材

造模后第24 天，用10%水合氯醛將所有家兔麻醉，腹主動(dòng)脈取血6 ～8 mL，離心，分離血漿，-70℃冰箱保存，待測(cè)。剝?nèi)≡炷?cè)肩關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜，取下肱二頭肌、岡上肌、岡上肌肌腱、滑膜囊及周圍組織，用生理鹽水沖洗，20%多聚甲醛溶液中固定1周，以做病理組織切片HE 染色。

1.6 指標(biāo)檢測(cè)

(1)局部肩關(guān)節(jié)滑膜組織病理切片的制備與組織形態(tài)學(xué)觀察;(2)血漿和肌肉內(nèi)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transformating growth factor-β1，TGF-β1)，前列腺素(prostaglandin E-2，PGE-2)含量的測(cè)定(雙抗夾心ELISA 法);(3)肌腱生化法檢測(cè)岡上肌腱羥脯氨酸(hydroxyproline，HYP)。

1.7 統(tǒng)計(jì)處理

用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0 對(duì)數(shù)據(jù)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各組數(shù)據(jù)均服從正態(tài)分布，方差齊，采用單因素方差分析(one way ANOVA)，組間比較采用LSD，以P ＜0.05為差異顯著，以P ＜0.01 為差異極顯著。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

模型組和平衡針治療組家兔在造模后第二天出現(xiàn)患側(cè)肩關(guān)節(jié)輕微活動(dòng)不利，之后肩關(guān)節(jié)受限情況日益加重，造模期間每次搖床捆綁、冰敷結(jié)束后，呈“扒地”狀態(tài)，不能直立?；紓?cè)肢體在造模后幾小時(shí)內(nèi)仍然不能恢復(fù)活動(dòng)，呈“前肢外翻”狀態(tài)，肩關(guān)節(jié)活動(dòng)受限，其它肢體可在數(shù)分鐘后迅速恢復(fù)直立和活動(dòng)。

2.1 肩周炎家兔肩關(guān)節(jié)周圍組織形態(tài)學(xué)改變

2.1.1 肩關(guān)節(jié)周圍組織的肉眼觀察 空白組:肩關(guān)節(jié)形態(tài)正常，未見(jiàn)腫脹及關(guān)節(jié)腔積液;肩周炎模型組:肩關(guān)節(jié)周圍組織充血腫脹明顯，周圍肌肉有肥厚、機(jī)化、黏連，打開關(guān)節(jié)腔時(shí)有大量黃色積液流出;平衡針治療組:肩關(guān)節(jié)周圍組織腫脹減輕，周圍肌肉肥厚和黏連情況有所緩解，打開關(guān)節(jié)腔時(shí)見(jiàn)少量黃色積液流出。

2.1.2 肩關(guān)節(jié)周圍組織光鏡下觀察(肩關(guān)節(jié)滑膜及岡山肌肌腱病理組織切片HE 染色) 空白對(duì)照組:滑膜細(xì)胞多為1 層，偶見(jiàn)2 ～3 層，在皺襞較多處滑膜細(xì)胞可達(dá)5 ～6 層?；ぜ?xì)胞深層結(jié)構(gòu)疏松，可見(jiàn)少量毛細(xì)血管;肌腱的外膜由結(jié)締組織包繞，最外層上皮細(xì)胞為立方細(xì)胞1 ～2 層，排列整齊，腱纖維排列整齊。肩周炎模型組:滑膜細(xì)胞多為1 ～2層，毛細(xì)血管較多。肌腱的外膜上皮細(xì)胞排列不整齊，上皮細(xì)胞增多可達(dá)4 ～5 層，上皮深層下行纖維增多，結(jié)構(gòu)致密，滑膜和肌腱均未見(jiàn)明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn)。平衡針治療組:滑膜細(xì)胞排列基本同空白組。肌腱的外膜(腱鞘臟層)上皮細(xì)胞增生，但較模型組少，多為2 ～3 層。上皮下結(jié)締組織也較致密。

2.2 TGF-β1 含量測(cè)定結(jié)果

2.2.1 血漿中TGF-β1 含量測(cè)定結(jié)果 各組數(shù)據(jù)均服從正態(tài)分布，方差齊，組間比較采用LSD 法。空白組家兔血漿中TGF-β1 有少量表達(dá)，模型組組家兔血漿中TGF-β1 含量比空白組明顯升高，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異極顯著(P =0.007，P ＜0.01)。平衡針組家兔血漿中TGF-β1 含量較模型組略有降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，詳見(jiàn)表1。

2.2.2 肱二頭肌中TGF-β1 含量測(cè)定結(jié)果 各組數(shù)據(jù)均服從正態(tài)分布，方差齊，組間比較采用LSD法?？瞻捉M家兔肱二頭肌中TGF-β1 有少量表達(dá)，模型組組家兔肱二頭肌中TGF-β1 含量比空白組明顯升高，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異極顯著(P =0.003，P ＜0.01)。平衡針組家兔肱二頭肌中TGF-β1 含量較模型組明顯降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異極顯著(P =0.005，P ＜0.01)，詳見(jiàn)表1。

表1 家兔血漿及肱二頭肌中TGF-β1 的含量比較(±s，ng/ml)

表1 家兔血漿及肱二頭肌中TGF-β1 的含量比較(±s，ng/ml)

注:與空白組相比，aP ＜0.01，與模型組相比，bP ＜0.01

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2.3 PGE-2 含量測(cè)定結(jié)果

2.3.1 血漿PGE-2 含量測(cè)定結(jié)果 各組數(shù)據(jù)均服從正態(tài)分布，方差齊，組間比較采用LSD 法?？瞻捉M家兔血漿中PGE-2 有少量表達(dá)，模型組組家兔血漿中PGE-2 含量比空白組明顯升高，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異極顯著(P=0.003，P ＜0.01)。而平衡針組家兔血漿中PGE-2 含量較模型組升高，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，詳見(jiàn)表2。

2.3.2 岡上肌中PGE-2 含量測(cè)定結(jié)果 各組數(shù)據(jù)均服從正態(tài)分布，方差齊，組間比較采用LSD 法?？瞻捉M家兔岡上肌中PGE-2 有少量表達(dá)，模型組組家兔岡上肌中PGE-2 含量比空白組明顯升高，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異極顯著(P =0.004，P ＜0.01)。而平衡針組家兔岡上肌中PGE-2 含量較模型組降低明顯，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異極顯著(P=0.002，P ＜0.01)，詳見(jiàn)表2。

表2 家兔血漿及岡上肌中PGE-2 的含量比較(±s，pg/ml)

表2 家兔血漿及岡上肌中PGE-2 的含量比較(±s，pg/ml)

注:與空白組相比，aP ＜0.01，與模型組相比，bP ＜0.01

組別 血漿PGE-2 岡上肌PGE-2 19.50 ±5.20 20.82 ±5.78模型組(n=9) 45.71 ±15.69a 48.97 ±17.95a平衡針組(n=9) 50.31 ±2.73 27.591 ±1.66空白組(n=10)b

2.4 岡上肌腱的HYP 含量測(cè)定結(jié)果

各組數(shù)據(jù)均服從正態(tài)分布，方差齊，組間比較采用LSD 法。空白組家兔岡上肌腱中HYP 正常表達(dá)，模型組組家兔岡上肌腱中HYP 含量比空白組明顯升高，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異極顯著(P =0.005，P ＜0.01)。而平衡針組家兔岡上肌腱中HYP 含量較模型組明顯降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P =0.002，P ＜0.05)，詳見(jiàn)表3。

表3 家兔岡上肌腱中HYP 的含量(±s，ug/g 肝濕重)

表3 家兔岡上肌腱中HYP 的含量(±s，ug/g 肝濕重)

注:與空白組相比，aP ＜0.01，與模型組相比，bP ＜0.05

HYP空白組組別 n 10 63.99 ±9.95模型組 9 121.53 ±23.44a平衡針組 9 100.81 ±6.85 b

3 討論

本實(shí)驗(yàn)基本模擬了人體肩關(guān)節(jié)周圍炎的肩關(guān)節(jié)活動(dòng)受限、肩周軟組織無(wú)菌性炎癥的病理改變。通過(guò)平衡針的治療發(fā)現(xiàn)，平衡針組家兔在治療一個(gè)療程后關(guān)節(jié)受限均有不同程度改善，家兔活動(dòng)能力增強(qiáng)，初步分析可能與平衡針對(duì)伴有疼痛的外傷性肩周炎治療有關(guān)。

TGF-β［13-15］是一種高度多效性、多功能性的生長(zhǎng)與分化因子，它廣泛地調(diào)節(jié)脊椎動(dòng)物和非脊椎動(dòng)物的生長(zhǎng)、發(fā)育、炎癥、修復(fù)和免疫等許多生物學(xué)過(guò)程。在炎癥與修復(fù)中的作用是TGF-β 最重要的作用之一。PGE-2 是重要的炎性致痛物質(zhì)，炎癥的全過(guò)程中都存在著PGE-2 的合成與釋放。肩周炎與局部組織的過(guò)度勞損有關(guān)，勞損過(guò)程中，局部組織的氧化代謝增強(qiáng)，細(xì)胞膜通透性增加，線粒體膨脹，溶酶體釋放大量的炎性致痛物質(zhì)，如PGE-2，五羥色胺，緩激肽等，造成肩周軟組織無(wú)菌性炎癥和疼痛［9，11］。HYP 和總蛋白等是參與膠原疤痕形成的主要物質(zhì)［11］，因此在此實(shí)驗(yàn)中選擇了TGF-β1、PGE-2、HYP 作為檢測(cè)指標(biāo)，來(lái)觀察模型復(fù)制的情況和平衡針治療后肩周炎家兔的抗炎能力的變化趨勢(shì)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示:(1)平衡針對(duì)肩周炎模型兔的炎癥的改善主要集中在局部病變的組織，分析平衡針對(duì)全身和局部的炎癥緩解的干預(yù)機(jī)制可能為:通過(guò)減少促炎因子和抗炎因子的釋放一定程度上抑制無(wú)菌炎癥的發(fā)生，從而解除或減輕血管的痙攣程度，改善肩周炎模型兔局部組織的瘀血、充血狀態(tài)。(2)平衡針對(duì)肩周炎模型兔的局部病變組織中的致痛因子的表達(dá)有顯著抑制作用，因此平衡針對(duì)肩周炎模型兔的局部病變組織有良好的鎮(zhèn)痛作用;分析平衡針對(duì)局部組織鎮(zhèn)痛效果的干預(yù)機(jī)制可能為:可通過(guò)興奮粗纖維、抑制PGE-2 和其他內(nèi)源性嗎啡樣物質(zhì)的分泌和合成等來(lái)達(dá)到鎮(zhèn)痛、消炎、消腫，促進(jìn)血液循環(huán)的功用，對(duì)肩周炎模型兔治療有積極作用。(3)平衡針治療可明顯緩解肩周炎模型兔的局部病變組織的機(jī)化和黏連;分析平衡針改善局部組織的機(jī)化黏連的機(jī)制可能為:通過(guò)抑制局部組織中HYP 的分泌和合成使得參與膠原疤痕形成物質(zhì)的減少?gòu)亩咕植坎±斫M織的持續(xù)機(jī)化和黏連有所減輕，改善肩周炎局部病理組織的無(wú)菌性炎癥和疼痛，進(jìn)而改善肩關(guān)節(jié)的活動(dòng)度。綜上，平衡針能有效地改善肩周炎所導(dǎo)致的局部和全身的癥狀，并且在抑制局部致痛因子的表達(dá)和改善肩關(guān)節(jié)活動(dòng)障礙方面效果較為突出。

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