過表達(dá)肝細(xì)胞核因子4α臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)小鼠大部肝切后肝再生

吳 寧，馬 永，翟秀宇，張玉玲，張 勇，張祺祺，杭化蓮，夏 強(qiáng)，卞建民*

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過表達(dá)肝細(xì)胞核因子4α臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)小鼠大部肝切后肝再生

吳 寧1，馬 永1，翟秀宇2，張玉玲3，張 勇1，張祺祺4，杭化蓮4，夏 強(qiáng)4，卞建民1*

（1南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院普外科，南京 210006；2吉林大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外二科，吉林 130021；3遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院貴州省細(xì)胞工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遵義 563003；4上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院肝臟外科，上海 200127）

探討人源性臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（UC-MSC）以及過表達(dá)肝細(xì)胞核因子4α（HNF4α）的UC-MSC能否促進(jìn)小鼠大部肝切后肝再生。體外分離、培養(yǎng)、鑒定人UC-MSC，慢病毒轉(zhuǎn)染過表達(dá)HNF4α。體外收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，將L02與上清液共培養(yǎng)，通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)試劑盒（CCK8）檢測細(xì)胞增殖活性。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)建立肝大部切除模型（約70%），分別經(jīng)尾靜脈向肝切除小鼠移植0.9%生理鹽水（NS）、MSC、MSC-HNF4α。48h后比較3組肝切后肝再生的變化，通過免疫組化來觀察肝標(biāo)本Ki67的表達(dá)。成功分離鑒定UC-MSC，并且成功建立穩(wěn)定過表達(dá)HNF4α的MSC。體外實(shí)驗(yàn)MSC組和MSC-HNF4α組中L02的增殖能力都明顯高于NS組（＜0.01），MSC組高于MSC-HNF4α組（＜0.05）。同樣體內(nèi)實(shí)驗(yàn)相對于NS組，經(jīng)MSC或MSC-HNF4α細(xì)胞處理的肝臟，其Ki67的表達(dá)明顯高于NS組（＜0.01），同樣MSC組高于MSC-HNF4α組（＜0.05）。UC-MSC和過表達(dá)HNF4α的MSC都分泌一系列因子促進(jìn)肝再生。

小鼠；肝再生；間充質(zhì)干細(xì)胞；肝細(xì)胞核因子4α

肝臟作為機(jī)體重要的代謝器官，在受到各種因素的損傷后表現(xiàn)出極強(qiáng)的自我修復(fù)能力。雖然肝細(xì)胞屬于終末分化細(xì)胞，生理?xiàng)l件下主要處于靜息狀態(tài)，但一旦肝受到損傷后便會(huì)通過各種途徑對受損肝進(jìn)行代償修復(fù)，在短期恢復(fù)原來大小，以滿足機(jī)體需求[1]。然而很多嚴(yán)重肝損傷及肝衰竭患者，肝再生能力無法滿足機(jī)體需求，既不耐受肝切除手術(shù)，也因?yàn)椴荒塬@得及時(shí)進(jìn)行原位肝移植的機(jī)會(huì)從而錯(cuò)失治療時(shí)機(jī)。

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）作為一種多能干細(xì)胞，具備強(qiáng)大的增殖能力、多向分化能力以及免疫調(diào)節(jié)能力，已獲廣泛認(rèn)可。目前，很多學(xué)者將目光投向采用MSC治療各種類型的肝臟疾病，結(jié)果證明MSC能夠改善多種肝臟疾病[2?4]。MSC移植治療丙肝性肝硬變等在臨床試驗(yàn)中也均取得了較好的療效[5]。還有研究發(fā)現(xiàn)將MSC在體外通過人工誘導(dǎo)成為“肝樣細(xì)胞”后移植于患者，同樣具有改善肝功能不全的效應(yīng)，且這種肝樣細(xì)胞聚集到肝的能力強(qiáng)于MSC[6?8]。

肝細(xì)胞核因子4α（hepatocyte nuclear factor 4α，HNF4α），作為細(xì)胞核受體超家族成員，是肝細(xì)胞分化和功能維持最為關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子[9]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，在同樣誘導(dǎo)條件下將HNF4α過表達(dá)于MSC后發(fā)現(xiàn)其誘導(dǎo)成為肝樣細(xì)胞的效果明顯強(qiáng)于對照組[10]。

本次試驗(yàn)主要探討MSC是否能夠促進(jìn)大部肝切后肝再生，以及過表達(dá)HNF4α的MSC對肝再生的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

足月剖宮產(chǎn)臍帶（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院婦產(chǎn)科）；改良型RPMI1640培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（HyClone，美國）；DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）,脂肪誘導(dǎo)液、成骨誘導(dǎo)液、軟骨誘導(dǎo)液（Gibco，美國）；堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）（Invitrogen，美國）；HNF4α過表達(dá)慢病毒（吉?jiǎng)P基因，中國）；流式抗體、免疫組化抗體（BD，美國）；細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）（同仁，日本）；6周齡BALB/c小鼠（上海斯萊克，中國）。儀器包括高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（Eppendorf，德國），酶標(biāo)儀（Biotek，美國），F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)胞儀（BD，美國），免疫共聚焦（萊卡，德國）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSC）的分離培養(yǎng) 在征得家屬同意簽署知情同意書并且經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意后取健康足月剖宮產(chǎn)胎兒臍帶，沖洗臍帶中殘留血液，剝離臍帶外層羊膜以及內(nèi)部2根動(dòng)脈1根靜脈，將臍帶剪碎成肉糜狀（1mm×1mm×1mm的組織塊），培養(yǎng)皿中貼壁1h后加入適量含10%FBS、1μg/L bFGF的DMEM/F12完全培養(yǎng)基，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7d后半量換液，待MSC貼壁后移除組織塊，觀察細(xì)胞生長情況，至細(xì)胞融合度約達(dá)80%，0.25%胰酶消化后按1∶3比例傳代培養(yǎng)。

1.2.2 UC-MSC流式鑒定和分化鑒定 取第3代融合度80%UC-MSC，消化離心后PBS洗滌2次，計(jì)數(shù)每流式管中加入細(xì)胞2×105/ml，200μl PBS重懸細(xì)胞，按抗體使用說明書中的量加入流式直標(biāo)抗體各10μl CD90、CD105、CD29、CD31、CD34、HLA-DR，4℃暗室孵化30min，PBS離心洗滌2次，流式固定液固定后上機(jī)檢測，數(shù)據(jù)采用Flowjo7.6分析。取第3代UC-MSC接種于預(yù)置蓋玻片的6孔板中，分別添加不含血清脂肪誘導(dǎo)液、成骨誘導(dǎo)液和軟骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)培養(yǎng)，1周換液2次，持續(xù)3周。分別將誘導(dǎo)后的細(xì)胞通過油紅染色、茜紅染色和檢測Ⅱ型膠原表達(dá)的方式檢測誘導(dǎo)效果。

1.2.3 構(gòu)建人HNF4α慢病毒載體 設(shè)計(jì)HNF4α全長引物，上游5′-GAGGATCCCCGGGTACCGGT- CGCCACCATGCGACTCTCCAAAACCCTC-3'，下游5′-TCCTTGTAGTCCATACCGATAACTTCCTGCTT-GGTGATG-3′。提取原代肝細(xì)胞總RNA進(jìn)行RT-PCR，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2min，94℃解鏈30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，循環(huán)33次，72℃總延伸10min，4℃終止反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，采用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收并純化目的基因片段。將純化的目的基因片段交由公司測序驗(yàn)證，構(gòu)建慢病毒載體。所構(gòu)建載體包括含HNF4α過表達(dá)載體，以及不含HNF4α的對照載體，上述慢病毒均自帶綠色免疫熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因。

1.2.4 轉(zhuǎn)染HNF4α 將第3代MSC接種于6孔板，確保次日貼壁后融合度約為30%。次日換液，將1×108TU慢病毒（MOI＝50）加于2ml含5mg/L聚凝胺（Polybrene）的感染增強(qiáng)液（enhanced infection solution）中，混勻用于培養(yǎng)細(xì)胞。8h后棄上清轉(zhuǎn)染液，PBS清洗3遍，加10%FBS培養(yǎng)液2ml，常規(guī)培養(yǎng)，2d換液，5d后共聚焦觀察熒光以檢測病毒轉(zhuǎn)染效率。

1.2.5 收集上清檢測分泌蛋白 將MSC和MSC-HNF4α分別接種于25cm2培養(yǎng)瓶，待其融合度約達(dá)70%，PBS清洗3遍，換不含血清DMEM/F12培養(yǎng)基6ml，常規(guī)培養(yǎng)48h后收集上清。兩組分別3個(gè)不同批次各取上清2ml，送至上?？党缮锕こ逃邢薰静捎肦ayBio?人L系列抗體芯片Ⅰ（507）檢測上清液中各種因子表達(dá)情況，以及比較兩組間分泌蛋白表達(dá)差異。其余上清-80℃長期保存，待用。

1.2.6 CCK-8檢測細(xì)胞增殖活性 本次實(shí)驗(yàn)體外采用L02肝細(xì)胞系作為普通肝臟細(xì)胞，消化離心對數(shù)生長狀態(tài)L02細(xì)胞，含10% FBS的RPMI1640完全培養(yǎng)基重懸計(jì)數(shù)使其密度為1×105/ml，100μl接種至96孔板，過夜待其完全貼壁，吸去培養(yǎng)基。設(shè)3組（＝5）：對照組，MSC組和MSC-HNF4α組分別添加DMEM/F12，MSC和MSC-HNF4α上清各75μl，最終加RPMI1640完全培養(yǎng)液使每孔補(bǔ)足100μl，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。每孔加10μl CCK-8溶液，孵箱內(nèi)繼續(xù)孵化1.5h后用450nm波長酶標(biāo)儀分別檢測OD值。

1.2.7 小鼠肝切模型建立和檢測 8周齡，體質(zhì)量約20g雄性BALB/c小鼠18只。術(shù)前2h，隨機(jī)分3組（＝6），分別注射生理鹽水（normal saline, NS）、5×106/ml MSC、5×106/ml MSC-HNF4α 200μl。小鼠肝切術(shù)參照姚菊芳小鼠大部肝切術(shù)的改進(jìn)，60mg/kg戊巴比妥麻醉，仰臥位固定，于劍突下腹中線剪開約2cm長切口，打開腹腔。顯微鏡下，分別結(jié)扎左外葉及中葉（約70%肝體積）血管，并切除，觀察創(chuàng)面無滲血后縫合關(guān)閉腹腔。48h后統(tǒng)一活殺小鼠，下腔靜脈采血1ml做丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine transaminase，ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate transaminase，AST）和白蛋白（albumin，ALB）檢測，取剩余部分肝4%多聚甲醛固定，其余肝組織立即投入液氮長期保存。石蠟包埋固定24h肝組織，切片，常規(guī)HE染色觀察肝組織病理變化。按照免疫組化說明書檢測肝組織中增殖細(xì)胞核抗原Ki67表達(dá)，判定標(biāo)準(zhǔn)：以細(xì)胞核呈界限清楚的棕色反應(yīng)為陽性，每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野（×400倍），對其中的表達(dá)陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，指標(biāo)比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用檢驗(yàn)。＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MSC的形態(tài)與鑒定

組織塊貼壁培養(yǎng)2周后可見從組織塊邊緣游離出部分MSC,移除組織塊后繼續(xù)培養(yǎng)1周使細(xì)胞融合度約達(dá)80%傳代，傳代后細(xì)胞生長速度加快，排列規(guī)則，形態(tài)大多呈梭形、多邊形及不規(guī)則形（圖1A）。在脂肪、成骨、軟骨誘導(dǎo)液中誘導(dǎo)3周后的MSC形態(tài)明顯發(fā)生改變，多趨向扁平狀，油紅染色、茜紅染色和Ⅱ型膠原表達(dá)陽性（圖1B，1C，1D）。細(xì)胞流式鑒定發(fā)現(xiàn)細(xì)胞高表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞相關(guān)抗原CD29、CD90、CD105，而低表達(dá)造血細(xì)胞相關(guān)抗原CD31、CD34和HLA-DR（圖2）。

2.2 免疫共聚焦檢測HNF4α轉(zhuǎn)染效率

慢病毒轉(zhuǎn)染5d后，免疫共聚焦觀察MSC中GFP表達(dá)情況以鑒定其轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染效率＞90%（圖3），細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯改變。

2.3 細(xì)胞上清液促進(jìn)L02增殖活性

將各組上清培養(yǎng)L02細(xì)胞24h后，通過CCK-8測得OD值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MSC-HNF4α組L02增殖活性明顯高于NS組[（1.278±0.071）（1.031±0.047），＜0.01]，同樣MSC組也高于NS組[ （1.964±0.074）（1.031±0.047），＜0.01；圖4]。提示：在體外條件下，MSC和MSC-HNF4α培養(yǎng)上清液中的物質(zhì)都具備促進(jìn)L02細(xì)胞增殖的分泌物質(zhì)，且在沒有免疫調(diào)節(jié)的環(huán)境下MSC分泌物對肝細(xì)胞的增殖作用強(qiáng)于過表達(dá)HNF4α的MSC細(xì)胞（＜0.05；圖4）。

2.4 移植細(xì)胞促進(jìn)大部肝切肝再生

尾靜脈注射細(xì)胞（或NS）2h后，開腹行70%肝切除，48h后18只小鼠均存活，并且活力飲食基本恢復(fù)正常。統(tǒng)一活殺后，各組小鼠肝大小大致相似。同一部位HE染色未見明顯差別，均可見少量炎性細(xì)胞浸潤，膽小管增生，肝細(xì)胞增生（圖5）。免疫組化測得肝再生指標(biāo)Ki67表現(xiàn)一致，均為MSC組明顯高于NS組[（45.000±5.263）（12.333±2.516），＝0.001]和MSC-HNF4α組[（45.000±5.263）（23.000±4.000），＝0.007]，同時(shí)MSC-HNF4α組上述指標(biāo)陽性率高于NS組[（23.000±4.000）（12.333±2.516），＝0.017；圖6]。提示在體內(nèi)存在免疫調(diào)節(jié)環(huán)境下，MSC和MSC-HNF4α同樣具有促進(jìn)肝再生的能力，并且過表達(dá)HNF4α后對肝再生的促進(jìn)能力弱于正常MSC。

圖1 MSC形態(tài)以及分化鑒定

Figure 1 Identification of MSC morphology and differentiation

MSC: mesenchymal stem cells; A: the third-passage UC-MSC (×100); B: after adipogenic induction, many small lipid vacuoles are observed by Oil Red O staining (×400); C: after chondrogenic induction, MSC differentiate into chondrogenic-like cells and are positive for typeⅡcollagen (×100); D: after osteogenic-specific induction, MSC are positive for Alizarin red staining (×100)

圖2 第3代MSC流式細(xì)胞鑒定結(jié)果

Figure 2 Identification of the third-passage human UC-MSC by flow cytometry

UC-MSC: umbilical cord mesenchymal stem cells. Flow cytometric analysis shows MSC cells are positive for CD29, CD 90 and CD105, and negative for CD31, CD34 and HLA-DR

圖3 MSC轉(zhuǎn)染慢病毒

Figure 3 Transfection of HNF4α into MSC (×200)

MSC: mesenchymal stem cells; HNF4α: hepatocyte nuclear factor 4α; A: control group; B: overexpression HNF4α group

圖4 體外實(shí)驗(yàn)MSC和MSC-HNF4α促進(jìn)L02增殖

Figure 4 MSC and MSC-HNF4α promote L02 proliferation

NS: normal saline; MSC: mesenchymal stem cells; HNF4a: hepatocyte nuclear factor 4α. Compared with NS group,**<0.01; compared with MSC group,#<0.05

2.5 蛋白芯片兩組細(xì)胞分泌物差異

收集兩組細(xì)胞上清各3份，采用RayBio?人L系列抗體芯片Ⅰ（507）檢測上清液中各種因子表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)兩組上清液中分泌因子存在較大差異（圖7）。而在這些因子中我們發(fā)現(xiàn)，MSC和MSC-HNF4α能分泌大量促進(jìn)肝細(xì)胞再生因子：肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）、轉(zhuǎn)化生長因子β、（transforming growth factor-beta，TGFβ）、成纖維生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、胰島素等，而過表達(dá)HNF4α的MSC表達(dá)更多的HGF、血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）及分泌型卷曲蛋白1（secreted frizzled-related proteins 1，sFRP-1）等多種因子，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討 論

肝臟再生是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，包括啟動(dòng)階段、增殖階段和終止階段3個(gè)步驟。目前，普遍接受的學(xué)說認(rèn)為，肝切后血液流體剪應(yīng)力發(fā)生改變，從而促進(jìn)肝間充質(zhì)細(xì)胞分泌胰島素、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、HGF、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNFα）和IL-6等多種細(xì)胞因子[11]，作用于肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，并且激活wnt等多條相關(guān)信號(hào)通路[12]，啟動(dòng)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞通過有絲分裂代償再生。一些研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)大部分肝細(xì)胞死亡或肝毒性物質(zhì)持續(xù)作用時(shí)，肝臟中的干細(xì)胞即卵原細(xì)胞通過快速增殖分化參與肝再生；肝受到更嚴(yán)重?fù)p傷后，骨髓MSC、胰腺干細(xì)胞等可經(jīng)血流停留于肝參與肝再生[13,14]。有研究結(jié)果表明，體外誘導(dǎo)分化后的MSC具備治療多種肝臟疾病的潛力[8,15,16]。本研究小組在前期研究中已證實(shí)，將HNF4α過表達(dá)于MSC能夠誘導(dǎo)更趨成熟肝細(xì)胞的肝樣細(xì)胞[10]。

本次實(shí)驗(yàn)，我們采用UC-MSC，是因?yàn)閁C-MSC相對于傳統(tǒng)骨髓或者脂肪來源的MSC具備更好的原始特性，并且具備更好的免疫調(diào)節(jié)能力，原料的獲取和分離也較后者更加容易。我們將HNF4α通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方式過表達(dá)于MSC，并且收集MSC和MSC-HNF4α條件培養(yǎng)基。通過體外增殖實(shí)驗(yàn)，我們證實(shí)MSC和MSC-HNF4α的外分泌因子都能夠促進(jìn)L02的增殖效應(yīng)，而且MSC組的促增殖作用較MSC-HNF4α組明顯。經(jīng)尾靜脈注入MSC組動(dòng)物殘肝中Ki67的表達(dá)高于MSC-HNF4α組（但兩組都明顯高于對照組）。為了解釋上述現(xiàn)象，我們采用抗體芯片技術(shù)檢測兩組細(xì)胞外分泌因子。通過比對兩組芯片結(jié)果差異，我們發(fā)現(xiàn)MSC以及MSC-HNF4α能夠分泌大量促進(jìn)肝細(xì)胞再生的關(guān)鍵性因子，如HGF、TGFβ、FGF、IL-6、胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）等。不過，MSC-HNF4α不僅能夠更多地分泌HGF（＜0.05），而且還能大量分泌sFRP-1。sFRP-1作為wnt信號(hào)通路的上游競爭性抑制因子，能夠有效抑制wnt信號(hào)通路的激活而導(dǎo)致其下游的關(guān)鍵性因子β?連環(huán)蛋白（catenin）抑制。肝切除后殘肝再生啟動(dòng)過程中，β?連環(huán)蛋白的激活有至關(guān)重要的作用[17]。我們認(rèn)為MSC-HNF4α組中抑制因子sFRP-1的高表達(dá)能夠合理地解釋MSC-HNF4α促再生能力弱于未經(jīng)處理的MSC。

圖5 各組小鼠肝臟HE染色未見明顯差別

Figure 5 HE-staining of liver tissue shows no difference between different groups (×200)

MSC: mesenchymal stem cells; HNF4a: hepatocyte nuclear factor 4α; A: control group; B: MSC group; C: overexpression HNF4α group

圖6 MSC和MSC-HNF4α促進(jìn)肝再生（Ki67表達(dá)）

Figure 6 MSC and MSC-HNF4α promote liver proliferation(Ki67 experssion, ×400)

MSC: mesenchymal stem cells; HNF4a: hepatocyte nuclear factor 4α; A: control group; B: MSC group; C: MSC-HNF4α group; D: the expression of Ki67 in each group. Compared with NS group,**<0.01; compared with MSC group,#<0.05

圖7 抗體芯片檢測MSC和MSC-HNF4α上清分泌蛋白

Figure 7 Detection of secreted proteins in supernatant of MSC and MSC-HNF 4α by antibody microarray

MSC: mesenchymal stem cells; HNF4a: hepatocyte nuclear factor 4α; A: MSC group; B: MSC-HNF4α group

在體外大量獲取“肝樣細(xì)胞”建立工程化肝細(xì)胞株用于細(xì)胞移植或組織工程肝，有望成為今后治療肝衰竭的方法。我們認(rèn)為，由于MSC-HNF4α能夠分泌更多因子以及能夠更好地分化成為肝樣細(xì)胞，其可能會(huì)在肝衰竭尤其是慢性肝衰竭的治療中發(fā)揮重要作用。

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（編輯: 周宇紅）

Overexpression of hepatocyte nuclear factor 4α in umbilical cord mesenchymal stem cells promotes liver regeneration after subtotal hepatectomy in mice

WU Ning1, MA Yong1, ZHAI Xiu-Yu2, ZHANG Yu-Ling3, ZHANG Yong1, ZHANG Qi-Qi4, HANG Hua-Lian4, XIA Qiang4, BIAN Jian-Min1*

(1Department of General Surgery, Nanjing Hospital Affiliated to Nanjing Medical University, Nanjing 210006, China;2the Second Department of Urology, the First Hospital of Jilin University, Jilin 130021, China;3Guizhou Provincial Key Laboratory of Cell Engineering, Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Zunyi 563033, China;4Department of Liver Surgery, Renji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200127, China)

To investigate whether human umbilical cord mesenchymal stem cells (UC-MSC) and the cells with overexpression of hepatocyte nuclear factor 4α (HNF4α) can promote liver regeneration after subtotal hepatectomy in mice.After human UC-MSC were isolated, cultured and identified, the cells were transfected with lentiviral vector LV-HNF4α. Then the cell supernatant was collected and cultured with L02 cells, and the L02 cell viability was detected by cell counting kit-8 (CCK8) assay. In thestudy, a total of 18 mice were randomly divided into 3 groups (=6 for each group): normal saline (NS) group, MSC group and MSC-HNF4α group, and received an injection of NS, MSC and MSC-HNF4α (5×106/ml), respectively via tail vein in 2 h before the establishment of subtotal hepatectomy model (70%). In 48 h later, the expression of Ki67 in the liver tissues was detected by immunohistochemical assay, and the results were compared among 3 groups.UC-MSC was successfully isolated from human umbilical cord, and the UC-MSC with stable overexpression of HNF4α were established.study indicated that the L02 cells showed stronger proliferative ability when cocultured with MSC and MSC-HNF4α than cultured alone (＜0.01), and those cocultured with MSC-HNF4α stronger than the cells with MSC (＜0.05).study showed similar findings: the expression of Ki67 was stronger in the mice treated with MSC or MSC-HNF4α than those with NS (＜0.01), and also overexpression of HNF4α resulted in more significant expression of Ki67 (＜0.05).Both MSC and MSC-HNF4α secret some cytokines to promote liver regeneration.

mice; liver regeneration; mesenchymal stem cells; hepatocyte nuclear factor 4α

(201308014),(81100306)(134119a9501).

R333.4

A

10.11915/j.issn.1671?5403.2015.01.016

2014?09?17;

2014?11?06

南京市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)基金（201308014）；國家自然科學(xué)基金 (81100306)；上海市科委醫(yī)學(xué)引導(dǎo)類基金(134119a9501)

卞建民, E-mail: jmbian0324@gmail.com