大腸桿菌O157∶H7微滴數(shù)字PCR定量方法的建立

董蓮華等

摘 要 以大腸桿菌O157∶H7 （E. coli O157∶H7）rfbE基因?yàn)榘谢?，建立了可對其?zhǔn)確定量的微滴數(shù)字PCR（ddPCR）方法。對ddPCR反應(yīng)中的探針濃度進(jìn)行了優(yōu)化，考察了方法的線性范圍、精密度、定量限和檢出限。最終確定ddPCR反應(yīng)中的最佳探針濃度為300 nmol/L。E. coli O157∶H7基因組DNA濃度范圍為4～1.25×105拷貝/20 μL ddPCR反應(yīng)液時(shí)，ddPCR方法線性相關(guān)系數(shù)（R2）為0.999。當(dāng)DNA濃度為760～88400拷貝/20 μL時(shí)，方法的精密度最好（RSD<5%）。本方法的定量限為4拷貝/20 μL，檢出限為3拷貝/20 μL。特異性驗(yàn)證結(jié)果表明，建立的ddPCR方法特異性良好，對13份豬肉、牛肉和雞肉樣品的檢測結(jié)果與定量PCR方法檢出結(jié)果一致。

關(guān)鍵詞 微滴數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)； 大腸桿菌O157∶H7； 拷貝數(shù)

1 引 言

大腸桿菌O157∶H7（E. coli O157∶H7）是腸出血性大腸桿菌常見的血清型，是以食物為主要的傳播途徑的致病菌，牛、羊、豬和雞等家畜家禽是其主要宿主[1，2]?？梢饑?yán)重并發(fā)癥， 甚至導(dǎo)致死亡，死亡率可達(dá)5%～10%。近年，腸出血性大腸桿菌O157∶H7感染在世界各地都有不同規(guī)模的爆發(fā)和流行，在世界范圍內(nèi)都受到普遍關(guān)注。此外，E. coli O157∶H7的感染劑量極低，在食入不足10個(gè)細(xì)菌就可能引起疾病[2，3]。目前還沒有一種特效藥或有效的治療手段，因此建立快速、有效的檢測方法對E. coli O157∶H7的預(yù)防工作顯得尤為重要。

目前，檢測腸出血性E. coli O157∶H7的方法可分為傳統(tǒng)方法、免疫方法和分子檢測方法。傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法和生化鑒定時(shí)間長，靈敏度低； 免疫學(xué)方法雖然檢測時(shí)間相對較短[4]，但是容易發(fā)生于大腸桿菌的多種血清型的交叉反應(yīng)。劉霞等[5]采用納米金標(biāo)記抗體增強(qiáng)表面等離子體共振（SPR）傳感器對E. coli O157∶H7進(jìn)行檢測。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）方法被廣泛用于E. coli O157∶H7 疾病的快速診斷中。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real time quantitative PCR，qPCR）[6，7]技術(shù)以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、速度快等優(yōu)點(diǎn)在基因表達(dá)、病原體基因檢測等方面得到廣泛應(yīng)用，已經(jīng)成為當(dāng)前細(xì)菌快速檢測的重要方法，并已成功用于不同來源的E. coli O157∶H7的檢測中[8～12]。如Fratamico等[10]建立了不同食品中針對stx1、stx2、wzyO157、eae和 fliC目標(biāo)基因檢測E. coli O157∶H7的多重定量PCR方法。Bonetta等[12]建立了一步富集法結(jié)合PCR方法檢測地表水中的E. coli O157∶H7，解決了由于方法靈敏度的限制而難以檢測地表水中的E. coli O157∶H7，檢測限低至3 CFU/L。

微滴數(shù)字PCR方法（Droplet digital PCR， ddPCR）是近年來發(fā)展起來的快速、準(zhǔn)確、可實(shí)現(xiàn)DNA絕對定量的PCR方法。其原理是通過把稀釋到一定濃度的DNA分子分布在一定數(shù)目的微滴中，使大部分微滴中的DNA分子數(shù)目為1或0，然后通過PCR擴(kuò)增和熒光信號(hào)的累計(jì)讀取陽性微滴數(shù)目，再根據(jù)泊松分布計(jì)算出樣本中的DNA分子數(shù)[13～15]。本方法無需依賴外部核酸標(biāo)準(zhǔn)，可實(shí)現(xiàn)核酸絕對定量分析。ddPCR與qPCR方法相比，本方法無需核酸標(biāo)準(zhǔn)品，又兼具qPCR方法的優(yōu)點(diǎn)，用于環(huán)境微生物[16]和病原體基因的檢測具有更廣闊的應(yīng)用前景。因此， 研究和建立E. coli O157∶H7的ddPCR方法，對E. coli O157∶H7的快速、 準(zhǔn)確的定性和定量檢測具有重大意義。本研究在之前建立的qPCR方法[17]基礎(chǔ)上，進(jìn)行ddPCR檢測E. coli O157∶H7方法的建立和優(yōu)化。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Nanodrop 2000超微量紫外分光光度計(jì)（美國賽默飛世爾公司）； Roche Light Cycle 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（瑞士羅氏診斷公司）； QX100微滴式數(shù)字PCR儀（美國伯樂公司）。

E. coli O157∶H7（ATCC 35150）、志賀氏菌、霍亂弧菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌等非大腸桿菌菌株和5 株非O157∶H7 血清型大腸桿菌基因組DNA由北京基因組研究所提供。實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（美國Life Technology公司）。微滴數(shù)字PCR定量試劑盒（美國伯樂公司）。肉類樣品購自本地超市和集貿(mào)市場。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 引物探針設(shè)計(jì) 根據(jù)E. coli O157∶H7編碼脂多糖的rfbE特異性基因序列，設(shè)計(jì)的引物和探針序列見表1，采用設(shè)計(jì)好的引物和探針建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，包括擴(kuò)增循環(huán)條件的優(yōu)化及引物和探針濃度的優(yōu)化。

2.2.2 探針濃度優(yōu)化 PCR體系中上下游引物濃度分別為400 nmol/L，設(shè)置探針濃度分別為100， 200， 300和400 nmol/L，然后加入12.5 μL PCR mastermix，DNA模板5 μL，用1×TE0.1補(bǔ)足25 μL。然后進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件確定為：95 ℃，4 min，40個(gè)循環(huán)； 95 ℃，15 s； 60 ℃，1 min。

2.2.3 微滴數(shù)字PCR線性范圍 將E. coli O157∶H7基因組DNA進(jìn)行梯度稀釋，分別標(biāo)記為S0～S8，根據(jù)紫外分光光度計(jì)測定結(jié)果計(jì)算，在總體積為20 μL的ddPCR反應(yīng)體系中加入稀釋好的S0～S8的DNA模板4 μL，使稀釋后的濃度分別為1.08×106， 2.63×105， 1.07×105， 1.05×104， 1.04×103， 1.06×102 ， 21.2， 10.6和1.01拷貝/20 μL ddPCR反應(yīng)液，進(jìn)行ddPCR方法的線性范圍研究[16]。ddPCR擴(kuò)增的循環(huán)條件為：95 ℃，4 min，40個(gè)循環(huán)； 95 ℃，15 s； 60 ℃，1 min； 98 ℃，10 min。

在考察本方法的線性范圍時(shí)，每個(gè)濃度梯度設(shè)置4次重復(fù)。以4次重復(fù)測量結(jié)果的RSD值表示ddPCR測定O157∶H7時(shí)相應(yīng)濃度下的精密度，以E. coli O157∶H7基因組DNA濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)濃度下測定的ddPCR方法的精密度為縱坐標(biāo)作圖，研究ddPCR方法精密度與目標(biāo)基因組濃度之間的相關(guān)性。

2.2.4 方法特異性驗(yàn)證 分別提取購自ATCC的菌株E. coli O157∶H7 參考株、沙門氏菌、軍團(tuán)菌、霍亂弧菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌和5 株非O157 血清型大腸桿菌的純培養(yǎng)物菌液的基因組DNA，濃度分別為：4.1×103拷貝、3.8×103拷貝、4.2×103拷貝、5.1×103拷貝、4.1×103拷貝、5.2×103拷貝、5.7×103拷貝、4.8×103拷貝、4.7×103拷貝、5.2×103拷貝和5.4×103拷貝，按照優(yōu)化的條件進(jìn)行ddPCR檢測，驗(yàn)證其特異性。

2.2.5 實(shí)際樣品分析 無菌條件下取10 g樣品于90 mL含20 mg/L新生霉素的改良EC肉湯中， 42 ℃培養(yǎng)，取適量培養(yǎng)液參考文獻(xiàn)[18]的方法進(jìn)行基因組DNA的提取。然后進(jìn)行ddPCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR[19]兩種方法檢測。

3 結(jié)果與討論

3.1 探針濃度的確定

由于ddPCR方法對結(jié)果的判讀是基于反應(yīng)終點(diǎn)閱讀到的微滴的熒光信號(hào)強(qiáng)度，熒光信號(hào)高于閾值的反應(yīng)判定為陽性反應(yīng)，低于閾值的反應(yīng)則判定為陰性反應(yīng)，然后根據(jù)得到的陽性微滴和陰性微滴的數(shù)目，利用泊松分布公式[16]計(jì)算出目標(biāo)DNA分子的濃度。因此ddPCR方法中所有反應(yīng)擴(kuò)增后累積的熒光信號(hào)的強(qiáng)弱直接決定了該方法的準(zhǔn)確性，而熒光信號(hào)的累積與PCR擴(kuò)增效率密切相關(guān)。在沒有PCR抑制因子的情況下，PCR擴(kuò)增效率與PCR擴(kuò)增體系中的引物、探針濃度密切相關(guān)。通常qPCR方法的擴(kuò)增體系可以直接用到ddPCR方法上，但如果微滴數(shù)字PCR擴(kuò)增結(jié)果不夠理想，需要對探針濃度進(jìn)行調(diào)整。

采用qPCR對探針的濃度進(jìn)行了優(yōu)化和確定。探針濃度分別為100， 200， 300和400 nmol/L時(shí)，qPCR擴(kuò)增的Ct值分別為27.85， 28.49， 28.80和29.05，即探針濃度在100 nmol/L時(shí)，Ct值最小。從熒光信號(hào)強(qiáng)度來看，探針濃度為300 nmol/L時(shí)， qPCR熒光信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到最高，探針濃度在400 nmol/L時(shí)，熒光信號(hào)強(qiáng)度與300 nmol/L時(shí)的熒光信號(hào)強(qiáng)度無顯著差異。綜合考慮熒光信號(hào)強(qiáng)度和Ct值兩個(gè)指標(biāo)，確定探針濃度為300 nmol/L。

3.2 微滴數(shù)字PCR擴(kuò)增

ddPCR對E. coli O157∶H7 DNA擴(kuò)增的一維散點(diǎn)圖和直方圖見圖1。經(jīng)過優(yōu)化的PCR體系對O157∶H7基因組DNA擴(kuò)增結(jié)果良好，其中陽性微滴和陰性微滴明顯分成兩簇（圖1a），而且中間彌散的微滴數(shù)目很少； 直方圖（圖1b）中陽性峰和陰性峰顯著分開，中間沒有任何干擾，表明經(jīng)過優(yōu)化確定的ddPCR探針濃度和擴(kuò)增體系適合對E. coli O157∶H7進(jìn)行定量分析。

3.3 微滴數(shù)字PCR線性范圍

所有反應(yīng)（32個(gè)）生成的平均微滴數(shù)目為14101±1759，每個(gè)濃度下產(chǎn)生的可接受的平均微滴數(shù)目均大于10000（圖2a），表明所有反應(yīng)微滴生成正常，保證了后續(xù)定量分析的準(zhǔn)確性。從S1至S8生成的可接受總微滴數(shù)和陽性微滴數(shù)分布圖（圖2a）還可看出，DNA樣品從高濃度至低濃度經(jīng)過擴(kuò)增后，陽性微滴數(shù)目隨著濃度的降低而逐漸減少，但陰性微滴數(shù)目卻逐漸增加。在S0中，陽性微滴數(shù)與微滴總數(shù)接近，表明所有的微滴有DNA分子分布，該濃度下所有微滴均被DNA飽和，無陰性微滴存在，這可在一維散點(diǎn)圖（圖2b）上得到證實(shí)。如果DNA濃度過高，微滴不滿足泊松分布，定量結(jié)果將顯著偏離真實(shí)值，無法實(shí)現(xiàn)ddPCR的準(zhǔn)確定量。因此在圖3中，S0不在線性直線上。此外，NTC中沒有檢測到陽性微滴，可見該體系中沒有污染或非特異性擴(kuò)增，方法的特異性較好。

由圖3可知，從S7至S1，E. coli O157∶H7基因組DNA濃度范圍在4.16拷貝/20 μL ～1.25×105拷貝/20 μL， 線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)為0.999，因此可以確定ddPCR方法對E. coli O157∶H7定量檢測的線性范圍為5個(gè)數(shù)量級(jí)。這與之前的研究結(jié)果[20]一致。

3.4 微滴數(shù)字PCR方法測定大腸桿菌O157∶H7基因組DNA的定量限（LOQ）和檢出限（LOD）

由圖3可見，S7為可準(zhǔn)確定量的最低濃度，ddPCR測定的S7在PCR反應(yīng)液中的濃度為0.2 拷貝/μL，因此該方法檢測E. coli O157∶H7基因組DNA的定量限為4拷貝/20 μL。對于檢測限的確定，當(dāng)20 μL ddPCR反應(yīng)液中含1拷貝、2拷貝、3拷貝和4拷貝DNA時(shí)，經(jīng)ddPCR檢測后，3拷貝和4拷貝的樣品檢測結(jié)果均為陽性，因此ddPCR方法測定E. coli O157∶H7的檢測限確定為3 拷貝/20 μL。

3.5 微滴數(shù)字PCR方法的精密度與目標(biāo)基因組DNA濃度之間的關(guān)系

由圖4可見，ddPCR方法的精密度和所測定的DNA濃度有很好的相關(guān)性，R2=0.91。當(dāng)每個(gè)反應(yīng)中DNA量由低到高逐漸增加時(shí)，測定結(jié)果的精密度逐漸增高，即RSD降低； 但DNA量增加到一定值時(shí)，方法精密度不再增加，之后隨著每個(gè)反應(yīng)中的DNA量的增加，精密度降低，即RSD增加。由圖4可知，當(dāng)DNA濃度為4拷貝/20 μL時(shí)，測量結(jié)果的RSD=51%，而當(dāng)濃度增加到759拷貝/20 μL時(shí)，測定結(jié)果的重復(fù)性達(dá)到5%， DNA濃度為8419拷貝/20 μL時(shí)，測定結(jié)果的精密度達(dá)到最好（RSD為0.39%）。當(dāng)DNA濃度在760拷貝/20 μL～88400拷貝/20 μL時(shí)，測量結(jié)果的RSD小于5%。因此，采用ddPCR對E. coli O157∶H7基因組DNA進(jìn)行絕對定量時(shí)，將DNA濃度控制在759～88417拷貝/20 μL范圍內(nèi)，可保證ddPCR測量結(jié)果的精密度好、準(zhǔn)確度高。

3.6 特異性檢測

采用5株非大腸桿菌和5株大腸桿菌非O157∶H7血清型的菌株基因組DNA進(jìn)行ddPCR方法特異性驗(yàn)證，結(jié)果表明，除了E. coli O157∶H7得到了特異性擴(kuò)增，其它菌株的檢測均為陰性，表明建立的ddPCR方法特異性良好。

3.7 肉類樣品檢測

從市場和超市共采集肉類樣品13份，其中豬肉7份、牛肉3份、雞肉3份。分別采用我國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的qPCR方法和本研究建立的ddPCR方法對肉類樣品進(jìn)行E. coli O157∶H7檢測。檢測結(jié)果表明，13份樣品中，豬肉和雞肉各1份樣品為E. coli O157∶H7陽性，兩種方法檢測結(jié)果一致。

豬肉、牛肉和雞肉各1份陰性樣品，各添加高、中、低3個(gè)濃度（5.25×103，5.25×102和1.20 CFU）的標(biāo)準(zhǔn)E. coli O157∶H7菌液后，經(jīng)ddPCR測定后的回收率均大于96%，表明肉類基質(zhì)對ddPCR測定E. coli O157∶H7無顯著影響。

3.8 腸出血性E. coli O157∶H7 dd PCR方法的優(yōu)點(diǎn)

采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法進(jìn)行腸出血性E. coli O157∶H7的鑒定和檢測至少需要4～7天，檢出限約為104 CFU/mL。郭小英等[21]利用化學(xué)發(fā)光磁酶免疫分析法，將食品中腸出血性E. coli O157∶H7的檢出限降低至850 CFU/mL。徐義剛等[22]利用對退火溫度不敏感的DPOPCR技術(shù)，檢測E. coli O157∶H7的檢出限達(dá)到94 CFU/mL。通常，在無預(yù)增菌的情況下，普通的PCR技術(shù)可檢測30 CFU/mL的E. coli[12]。姜君等[17]針對E. coli O157∶H7的同一基因（rfbe）建立了特異性更好的TaqMan探針熒光定量PCR方法，在無需富集的情況下，檢出限可達(dá)到10 拷貝/20 μL（3 CFU/mL）。本研究中針對O157∶H7的rfbe基因所建立的ddPCR方法的檢測限可到3拷貝/20 μL（1CFU/mL）?？梢?，ddPCR方法檢測腸出血性E. coli O157∶H7的靈敏度非常高。

由于前期研究[18]中用經(jīng)生化鑒定和血清學(xué)鑒定為陽性的13 株O157∶ H7 大腸桿菌、50 株非O157∶H7大腸桿菌對針對同一基因的熒光定量PCR方法的特異性進(jìn)行了驗(yàn)證，本研究中ddPCR方法所使用的引物和探針與之前研究相同，而PCR方法的特異性主要取決于引物和探針的特異性，經(jīng)過驗(yàn)證，本研究建立的ddPCR方法的特異性與qPCR方法的特異性表現(xiàn)一致。

ddPCR測定E. coli O157∶H7基因組含量的結(jié)果與紫外吸收法測定結(jié)果相比顯著偏低，方法的特異性更強(qiáng)。而紫外方法測定的是所有在260 nm處有吸收的物質(zhì)，無法區(qū)分DNA與RNA、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)[23，24]，通常會(huì)導(dǎo)致測定結(jié)果偏高，這與文獻(xiàn)＼[20＼]的結(jié)果一致。

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Abstract A droplet digital polymerase chain reaction （ddPCR） method for quantifying E. coli O157∶H7 by targeting rfbE gene was developed. The probe concentration in ddPCR was optimized and the linearity range， precision， limit of detection （LOD） and limit of quantification （LOQ） were also evaluated. The optimized probe concentration was 300 nmol/L. The ddPCR response was linear over the E. coli O157∶H7 genome DNA concentration range from 4 to 1.25×105 copies in 20 μL ddPCR system and the linear correlation coefficient （R2） was 0.999. The ddPCR precision （RSD） was less than 5% over the DNA concentration range from 760 to 88400 copies/20 μL. The LOD and LOQ was 3 copies in 20 μL and 4 copies in 20 μL， respectively. Specificity test showed that the ddPCR was specific for detecting E. coli O157∶H7. Both ddPCR and standard real time quantitative PCR showed the same results for 16 real samples of chicken meat， pork and beef， which indicated that ddPCR method was suitable for detection of E. coli O157∶H7 in food.

Keywords Droplet digital polymerase chain reaction； Escherichia coli O157∶H7； Copy number

（Received 3 July 2014； accepted 1 December 2014）