快速測(cè)定植物油膽固醇含量在地溝油篩查中的應(yīng)用

何文絢等

摘 要 采用皂化氣相色譜氫火焰離子檢測(cè)器法測(cè)試了多個(gè)植物油樣品，發(fā)現(xiàn)膽固醇峰被干擾比較嚴(yán)重，很難得出植物油與地溝油膽固醇含量的界定值。采用SPE進(jìn)行樣品前處理，對(duì)SPE處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化，得出優(yōu)化條件為稱樣量0.25 g ，20 mL 0.6% 乙醚正己烷 （V/V） 作為淋洗液，20 mL 15% 乙醚正己烷 （V/V） 作為洗脫液。用SPE氣相色譜氫火焰離子檢測(cè)器法分析了84個(gè)植物油樣品和13個(gè)地溝油樣品中膽固醇含量，測(cè)定結(jié)果表明，植物油膽固醇含量與地溝油膽固醇含量有明顯區(qū)別，所有植物油膽固醇含量都小于50 μg/g，13個(gè)地溝油樣中11個(gè)樣膽固醇含量大于50 μg/g。因此，采用上述植物油膽固醇測(cè)定方法，膽固醇含量超過50 μg/g可判定為疑似地溝油，反之不成立。本方法在0～760 mg/L濃度范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)R2=0.9999，方法檢出限為6.0 μg/g，兩個(gè)濃度水平（17.7和695 mg/L）的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.6% 和1.5%，回收率為103%。

關(guān)鍵詞 地溝油； 氣相色譜； 固相萃?。?植物油； 膽固醇

1 引 言

關(guān)于地溝油檢測(cè)方法研究有許多是通過分析植物油中膽固醇含量來判定是否為地溝油[1～4]，且多采用氣相色譜法測(cè)定膽固醇。雖然相關(guān)文章較多，獲得實(shí)際植物油膽固醇含量數(shù)據(jù)卻非常有限，氣相色譜法測(cè)定膽固醇鑒定地溝油在實(shí)際應(yīng)用中還存如不同制樣法分析結(jié)果相差較大、氣相色譜氫離子火焰檢測(cè)器分析結(jié)果明顯高于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法等問題。液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用或氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定膽固醇選擇性好，但由于離子化效率對(duì)準(zhǔn)確定量有很大影響，通常采用同位素內(nèi)標(biāo)彌補(bǔ)相關(guān)的不足，所以目前靈敏度、精密度、準(zhǔn)確度高的膽固醇測(cè)定方法應(yīng)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)同位素內(nèi)標(biāo)液質(zhì)聯(lián)用[5]和同位素內(nèi)標(biāo)氣質(zhì)聯(lián)用法[6]，但兩種方法成本高、操作繁瑣，擁有相關(guān)儀器的單位較少。地溝油多數(shù)情況下混有動(dòng)物脂肪，也必定含有動(dòng)物油脂的特征性甾醇——膽固醇，但若不經(jīng)篩查，直接采用上述同位素內(nèi)標(biāo)液相色譜質(zhì)譜或氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法，由于高昂的成本和相對(duì)少的儀器，實(shí)際應(yīng)用中很難操作。高效的做法應(yīng)是用相對(duì)價(jià)廉、簡(jiǎn)單、有效的方法先篩查疑似地溝油，篩出的少量疑似地溝油樣品再用成本高、準(zhǔn)確性好的方法確證，這樣建立的方法才有實(shí)際應(yīng)用基礎(chǔ)。膽固醇是地溝油的關(guān)鍵指標(biāo)之一，可以用其作為篩查指標(biāo)，篩查階段不需要太強(qiáng)調(diào)獲取準(zhǔn)確膽固醇含量數(shù)據(jù)，但需滿足以下條件：第一，測(cè)得的數(shù)據(jù)地溝油與植物油要有明顯區(qū)別；第二，方法重現(xiàn)性好，可以得到明確、誤判率低的判定設(shè)定值；第三，方法相對(duì)簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、省時(shí)?；诖?，本研究建立了測(cè)定植物油中膽固醇含量快速篩查地溝油的方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器、試劑與樣品

GC2014C氣相色譜儀，配FID檢測(cè)器（日本島津公司）。SPE硅膠柱（500 mg/3 mL，菲羅門科學(xué)儀器有限公司）。石油醚（沸程30～60 ℃）、無水硫酸鈉、無水乙醇、正己烷、無水乙醚、KOH均為分析純。

所有菜籽油、葵花油、大豆油、玉米油、芝麻油、花生油、橄欖油都購于大型超市，地溝油都是相關(guān)部們查獲、有確鑿證據(jù)的樣品。

2.2 膽固醇標(biāo)液配制

準(zhǔn)確稱取0.0192 g膽固醇（純度>99%，美國NUCHEK公司），用正己烷溶解并稀釋至25 mL，配制成760 mg/L的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，在4 ℃下保存。根據(jù)需要用正己烷稀釋成適當(dāng)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3 樣品前處理

2.3.1 皂化 稱取1.00 g（±0.01 g） 樣品，置于燒瓶中，加入1 mol/L KOH乙醇溶液10 mL，在90 ℃水浴鍋上皂化1 h，冷卻，移入60 mL分液漏斗，以10 mL去離子水洗滌，洗液并入分液漏斗，再以10 mL石油醚洗滌，洗液并入分液漏斗，輕輕振搖，靜置分層，分出有機(jī)相和水相，水相加入10 mL石油醚振搖，分層后，將石油醚層并入有機(jī)相，以10 mL石油醚再提取一次，提取的石油醚并入有機(jī)相。用2～3 mL去離子水洗滌有機(jī)相，分層，棄去水相， pH試紙檢測(cè)水相，若pH>7，重復(fù)此步驟，直至pH=7。無水Na2SO4干燥后，將石油醚層移入25 mL玻璃蒸發(fā)皿，吹干，用正己烷將殘余物轉(zhuǎn)移到1.5 mL樣品瓶，4 ℃下保存，測(cè)試時(shí)用正己烷定容。

2.3.2 SPE法條件優(yōu)化 文獻(xiàn)[6]已詳細(xì)探討用SPE法測(cè)試植物油中膽固醇條件，但未標(biāo)出所用的SPE小柱基本信息。本研究以該文獻(xiàn)為基礎(chǔ)，進(jìn)行SPE條件優(yōu)化。稱取S2（見表1）試樣0.25 g（±0.01 g） 于10 mL 具塞比色管中，加入0.1 mL膽固醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（760 mg/L）， 用5.0 mL 正己烷溶解后作為上樣液。SPE柱內(nèi)加入1 g無水Na2SO4，10 mL 正己烷活化小柱，棄去流出液，按以下步驟進(jìn)行上樣、淋洗和洗脫：（1）上樣 加入上樣液，棄去流出液，用5 mL正己烷分3次潤洗比色管，潤洗液加入柱內(nèi)，棄去流出液；（2）淋洗 將20 mL 0.6% 乙醚正己烷（V/V）溶液分2次加入，第一次加15 mL，第二次加5 mL，收集5 mL流出液，該淋洗液編號(hào)L1；（3）洗脫 將20 mL 15%乙醚正己烷溶液（V/V）分成3次加入，第一次加10 mL，后面兩次各5 mL，分別收集流出液，相應(yīng)洗脫液編號(hào)為X1、X2和X3。以上步驟都是用玻璃蒸發(fā)皿收集流出液，冷風(fēng)吹干正己烷，用適量正己烷將蒸發(fā)皿中殘留物轉(zhuǎn)移到1.5 mL試樣瓶，放置在4 ℃冰箱中，測(cè)試前用正己烷定容。

2.4 氣相色譜分析

色譜柱：Rtx5毛細(xì)管柱 （30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣：氮?dú)猓?柱流量：130 mL/min； 檢測(cè)器：FID（溫度320 ℃）； 進(jìn)樣口溫度：300 ℃； 進(jìn)樣方式： 分流（1∶90）； 程序升溫：200 ℃保持5 min； 以20 ℃/min升溫至280 ℃，并保持10 min； 再以35 ℃/min升溫至310 ℃， 保持5 min。endprint

3 結(jié)果與討論

3.1 SPE條件最佳化

固相萃取方法參照文獻(xiàn)[6]，并加以改進(jìn)：在SPE小柱中添加了無水Na2SO4，將稱樣量降低至0.25 g，洗脫液乙醚含量從10%增加至15%，采用蒸發(fā)皿收集洗脫液并用常溫空氣吹干，簡(jiǎn)化了揮干溶劑步驟，花生油318經(jīng)SPE處理后色譜圖如圖1。

實(shí)驗(yàn)表明，20 mL 0.6% 乙醚正己烷 （V/V） 淋洗液未將膽固醇洗出（L1未檢出膽固醇）；10 mL 15%乙醚正己烷 （V/V） 洗出73.5%的膽固醇（X1膽固醇回收率達(dá)73.5%）；當(dāng)15%乙醚正己烷 （V/V） 洗脫液用量達(dá)到15 mL時(shí)，膽固醇已全部被洗出（X1+X2膽固醇回收率為103.7%，X3未檢出膽固醇）。為了保證膽固醇被完全洗出，選擇20 mL 15%乙醚正己烷（V/V）作為洗脫液。

3.2 樣品前處理比較

22個(gè)樣品分別用SPE和皂化法處理，氣相色譜氫離子火焰檢測(cè)器外標(biāo)法測(cè)定膽固醇含量，分析結(jié)果見表1。由表1可知，皂化法結(jié)果高于SPE法，皂化法很難給出正常油與地溝油膽固醇含量的界定值，目前未發(fā)現(xiàn)已發(fā)表的國內(nèi)文獻(xiàn)提及該結(jié)論； SPE法測(cè)試結(jié)果中所有植物油膽固醇含量都小于50 μg/g； 地溝油皂化法和SPE法測(cè)得的膽固醇含量基本相同，且75%的地溝油樣SPE法得到的膽固醇含量高于50 μg/g。表1數(shù)據(jù)顯示許多合格植物油，皂化法測(cè)定的膽固醇含量都超過文獻(xiàn) [7] 規(guī)定的判別設(shè)定值（50 μg/g），說明皂化法不適合用于地溝油的篩查。

3.3 皂化法測(cè)試結(jié)果高于SPE法的原因探討

依據(jù)文獻(xiàn)[8，9]，植物油中甾醇有兩種狀態(tài)：酯化狀態(tài)和游離狀態(tài)，皂化法測(cè)得的是總膽固醇含量（酯化+游離），SPE法測(cè)的只是游離膽固醇含量，文獻(xiàn)[8]就是用皂化法測(cè)總膽固醇，用SPE法測(cè)游離膽固醇，不同植物油酯化和游離甾醇的比例不同，例如葡萄籽油中酯化膽固醇與游離膽固醇比例約為4∶6。皂化法測(cè)定的是酯化膽固醇+游離膽固醇含量而SPE法測(cè)定的只是游離膽固醇含量，這是皂化法結(jié)果高于SPE法的第一個(gè)原因；植物油成分復(fù)雜[10]，其他植物甾醇、植物醇、未知物等成分的保留時(shí)間與膽固醇相近[11]，用氣相色譜分析時(shí)這些成分時(shí)，無法與膽固醇分離，表1中SPE法測(cè)得的膽固醇含量明顯高于文獻(xiàn) [6]（同樣的樣品前處理方法及氣相色譜分析條件）同位素內(nèi)標(biāo)氣質(zhì)聯(lián)用法，證實(shí)了氣相色譜氫離子檢測(cè)器法測(cè)定膽固醇存在甾醇等物質(zhì)的干擾。皂化法由于釋放出了酯化甾醇（植物油中有些甾醇含量比膽固醇高1個(gè)或幾個(gè)數(shù)量級(jí)），將對(duì)膽固醇測(cè)定產(chǎn)生嚴(yán)重干擾，所以皂化法甾醇類物質(zhì)的干擾幾率和程度都比SPE法高，這是皂化法測(cè)試結(jié)果高于SPE法的第二個(gè)原因；地溝油皂化法和SPE的結(jié)果基本相同，這是因?yàn)榈販嫌驮诩庸み^程中經(jīng)歷了長時(shí)間堿煉，已將酯化的甾醇類物質(zhì)釋放成游離甾醇，所以二者測(cè)試結(jié)果基本相同，這也驗(yàn)證了前述的第一和第二個(gè)原因；皂化法無法消除植物醇的干擾，但SPE法中，植物醇在用5% 乙醚正己烷淋洗時(shí)已被除去，因此植物醇的存在是皂化法結(jié)果高于SPE法的第三個(gè)原因。

3.4 SPE樣品前處理氣相色譜分析膽固醇方法評(píng)價(jià)

3.4.1 線性范圍 配制7.6， 76， 152， 304和760 mg/L膽固醇溶液，進(jìn)行線性回歸實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，膽固醇濃度在0～760 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，所得方程為y=8.926×10 5x+2.658，R2=0.9999。

3.4.2 方法精密度 取植物油樣（A6）和地溝油樣（地溝油5#）各一個(gè)，均按前述方法制樣、檢測(cè)3次，A6樣平均膽固醇含量為17.7 mg/L，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%，地溝油5#樣平均膽固醇含量為695mg/L，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%。

3.4.3 方法回收率

分別稱取0.2513和0.2510 g 玉米油S2號(hào)樣品，其本底膽固醇含量為3.0 μg/g，添加了100 μL膽固醇儲(chǔ)備液，制樣、檢測(cè)方法同前，兩次測(cè)試結(jié)果回收率分別為103.6%和102.1%。

3.4.4 檢出限 儀器基線3倍噪音面積對(duì)應(yīng)的濃度為儀器檢出限，儀器檢出限為2.9 μg/L； 同樣的樣品處理及測(cè)試條件只是不加油樣，空白的膽固醇測(cè)試結(jié)果為1.0 mg/L，所以方法檢出限為6.0 μg/g。

3.5 大樣本量SPE法分析植物油及地溝油膽固醇含量

目前，SPE法結(jié)合GC（FID）獲得的植物油膽固醇數(shù)據(jù)十分有限，為了使測(cè)定結(jié)果更具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，選擇了84個(gè)合格植物油和13個(gè)地溝油樣，按上述方法檢測(cè)其膽固醇含量，檢測(cè)結(jié)果見表2。

表2表明，測(cè)定的84個(gè)植物油樣，其膽固醇含量都小于50 μg/g，13個(gè)地溝油樣中只有3個(gè)樣品膽固醇含量小于50 μg/g，其他都大于50 μg/g。

3.6 SPE氣相色譜法篩查植物油中地溝油

用本研究建立的SPEGC（FID）法測(cè)定7種常用植物油或由7種植物油調(diào)制的調(diào)和油膽固醇，含量超過50 μg/g可判定為疑似地溝油，其誤判率低（84個(gè)樣品中，誤判率為0），篩查出的樣品需用同位素內(nèi)標(biāo)液質(zhì)聯(lián)用，或內(nèi)標(biāo)氣質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)其膽固醇的準(zhǔn)確含量或用其他地溝油檢測(cè)方法驗(yàn)證，方可判定是否是地溝油或添加了地溝油，反之膽固醇含量低于50 μg/g無法得出其不是地溝油的結(jié)論。

4 結(jié) 論

膽固醇是動(dòng)物油的特征甾醇，本方法采用硅膠SPE小柱（500 mg/3 mL）， 稱量0.25 g（±0.01 g），正己烷溶解，1 g無水硫酸鈉加入SPE小柱除痕量水， 正己烷活化，20 mL 5% （V/V）乙醚正己烷淋洗，20 mL 10%（V/V） 乙醚正己烷 脫，氣相色譜（FID）測(cè)定植物油膽固醇，含量超過50 μg/g可判定為疑似地溝油；含量低于50 μg/g不能判定不是地溝油或未添加地溝油。本方法在0～760 mg/L濃度范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)R2=0.9999，方法檢出限為6.0 μg/g，兩個(gè)濃度水平（17.7和695 mg/L）的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.6%和1.5%，回收率為103%。本方法誤判率低、簡(jiǎn)單、測(cè)試時(shí)間短且分析成本相對(duì)低，方便大量樣本分析，適合于地溝油篩查。endprint

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Giacometti J. 熱帶農(nóng)業(yè)工程， 2001， （4）： 28-31

Abstract The contents of cholesterol in a number of vegetable oils were determined by saponificationgas chromatography （FID）. There was quite a large possibility that cholesterol peak was seriously interfered by saponificationgas chromatography （FID）， so it was difficult to set a cholesterol content value to differentiate vegetable oil from waste oil. Solid phase extraction （SPE） sample pretreatment was chosen and the process conditions were optimized. The optimal conditions were as follows： 0.25 g of oil samples， 20 mL of 0.6% ethyl etherhexane （V/V） as eluent （get rid of fatty acid glycerides） and 20 mL of 15% ethyl etherhexane （V/V） as eluent （obtain cholesterol）. An obvious cholesterolcontentdifference between vegetable oils and waste oils was found by SPEGC. The detected cholesterol contents in 84 vegetable oil samples were all less than 50 μg/g and the contents of 11 waste oil samples among the 13 waste oils were greater than 50 μg/g. Therefore， cholesterol content in vegetable oil of more than 50 μg/g could be determined as suspected waste oil， not vice versa by SPEGC. The correlation coefficient R2 was 0.9999 in 0-760 mg/L concentration range， and the detection limit was 6.0 μg/g. Relative standard deviations at two concentration levels of 17.7 and 695 mg/L were 1.6% and 1.5% respectively. The recovery was 103%.

Keywords Waste oil； Gas chromatogray； Solid phase extraction； Vegetable oil； Cholesterolendprint