雞白痢沙門氏菌的分離鑒定

吳翠蘭 （廣東省深圳市龍崗街道動物防疫監(jiān)督所 廣東深圳 518001）

雞白痢沙門氏菌?。ê喎Q雞白?。┦俏：﹄r雞和成年雞的一種典型垂直傳播性疾病。該病呈急性或慢性敗血癥過程。在雛雞和成年雞中所表現(xiàn)的癥狀和病程有所不同。雛雞主要表現(xiàn)為腸炎，呼吸困難和灰白下痢。成年雞感染后呈纖維素性腹膜炎，肝腫大，腸道腫脹出血等特征[1-3]，死亡率較高。其傳播途徑有多種，最常見的是通過帶菌卵而傳播。多種禽類（如雞、火雞、鴨、雛鵝、珠雞、野雞、麻雀和鴿等）都有自然感染的報導(dǎo)。但流行主要限于雞和火雞，尤其雞對本病較敏感。在哺乳動物中，兔特別是乳兔有較高的易感性。豚鼠、小白鼠和貓也能被感染，大鼠則有很強的抵抗力。有人曾在豬體內(nèi)分離到該菌，兒童亦偶有感染本病的報導(dǎo)。

雞白痢沙門氏菌對雞品種間易感性也有差異。一般而言，褐羽產(chǎn)褐殼蛋雞敏感，輕型雞較其他品種的雞敏感，地面平養(yǎng)的雞群發(fā)生此病較網(wǎng)上和籠養(yǎng)的雞要多。母雞的陽性率高于公雞，在雛雞常表現(xiàn)為急性全身性感染。在種雞群中，其不僅影響成年雞的生產(chǎn)性能，而且可經(jīng)垂直傳播和水平傳播導(dǎo)致胚胎死亡率增高，但以2～3周齡以內(nèi)的雛雞的發(fā)病率與死亡率最高，常呈流行性暴發(fā)。新發(fā)病的雛雞死亡率可高達100%，老疫區(qū)一般為20%～40%。嚴重影響雛雞成活率。隨著日齡的增加，雞對本病的抵抗力增強，如4周齡后的雞發(fā)病率和死亡率顯著下降。成年禽感染后常呈局限性、慢性感染或隱性感染。1899年首次報導(dǎo)了此病的病原，1929年正式命名為“雞白痢”[4]，并一直沿用至今。在檢測上，其易與大腸桿菌、禽傷寒沙門氏菌相混淆，這便又給診斷該病帶來一定的困難，給養(yǎng)雞業(yè)帶來一定的損失。農(nóng)業(yè)部將該病列為14種重點監(jiān)測的動物疫病之一[5]。目前國內(nèi)尚未報導(dǎo)有在雞群使用疫苗預(yù)防雞白痢，因此通過提高分離檢測水平，對雞場特別是種雞場凈化雞白痢有著現(xiàn)實的意義。

對于本病，其預(yù)防措施主要有定期檢疫，凈化種雞群。及時剔除陽性雞及可疑雞。對已感染的雞群應(yīng)每隔2～4周檢疫1次，直至把帶菌雞全部檢出淘汰。同時還要采用全進全出和自繁自養(yǎng)的管理措施及生產(chǎn)模式。加強飼養(yǎng)管理，每次入雞前都要對雞舍、設(shè)備、用具及周圍環(huán)境進行徹底消毒并至少空置1周。種蛋入孵前要做好孵房、孵化機用所有用具的清掃、沖洗和消毒工作。用藥方面也要合理，防止出現(xiàn)耐藥菌株。

本試驗是通過傳統(tǒng)方法如細菌的顯微鏡檢，幾種培養(yǎng)基下的生長情況觀察、運動性觀察和生化試驗進行檢測判定，再進行藥敏試驗來檢測其耐藥性，從而指導(dǎo)生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源

病料來源為某場的一個送檢雞只。臨床觀察病雞形態(tài)，尾部毛染有白色糞便，精神沉郁，站立不穩(wěn)。剖檢可見心、肝和肺都有灰白色結(jié)節(jié)，肝臟有點狀白色壞死。

1.1.2 培養(yǎng)基

麥康凱瓊脂培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。按麥康凱培養(yǎng)基使用說明書配制好，放入高壓蒸汽滅菌器進行滅菌。待溫度降到50℃左右時，無菌分裝至高壓滅菌處理的平皿中，冷卻至室溫，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

SS培養(yǎng)基：北京市陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。按照SS培養(yǎng)基的使用說明進行配制，待溫度降到50℃左右時，無菌分裝至高壓滅菌處理的平皿中，冷卻至室溫，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

XLD培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。按照XLD培養(yǎng)基的使用說明進行配制，待溫度降到50℃左右時，無菌操作分裝至高壓滅菌處理的平皿中，冷卻至室溫，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

科瑪嘉培養(yǎng)基：鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司。按照科瑪嘉培養(yǎng)基的使用說明進行配制，待溫度降到50℃左右時，無菌分裝至高壓滅菌處理的平皿中，冷卻至室溫，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

DHL培養(yǎng)基：杭州天和微生物試劑有限公司。按照DHL培養(yǎng)基的使用說明進行配制，待溫度降到50℃左右時，無菌分裝至高壓滅菌處理的平皿中，冷卻至室溫，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 生化反應(yīng)管

分別有葡萄糖生化反應(yīng)管、乳糖生化反應(yīng)管、蔗糖生化反應(yīng)管、甘露醇生化反應(yīng)管、麥芽糖生化反應(yīng)管、衛(wèi)矛醇生化反應(yīng)管、鳥氨酸生化反應(yīng)管、吲哚生化反應(yīng)管、尿素生化反應(yīng)管和半固體生化反應(yīng)管10種，均為杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 儀器與設(shè)備

潔凈工作臺：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，型號04012。光學(xué)顯微鏡：Nikon YS100。革蘭氏染液；Kovacs試劑等。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離及純化

用無菌操作方法，對?。ㄋ溃╇u的心、肝和脾進行細菌分離。分別接種于麥康凱培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基、科瑪嘉培養(yǎng)基、DHL培養(yǎng)基和XLD培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，觀察各平板上生長情況并進行純化。

1.2.2 革蘭氏染色顯微鏡檢

在潔凈工作臺上，取一塊潔凈的玻璃片，在玻璃片中間加1滴滅菌的雙蒸水，用滅菌后的接種環(huán)取1個菌落在玻璃片上均勻涂布，將菌落分散為單個細菌，按照革蘭氏染色程序染色。油鏡下觀察細菌的形態(tài)。

1.2.3 運動性檢查

將“1.2.1”.獲得的待檢純化菌落用滅菌接種棒垂直中心穿刺接種于半固體動力培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。

1.2.4 氧化酶試驗

將待檢菌株接種于LB固體培養(yǎng)基平板上，置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24h時在培養(yǎng)菌落表面滴加Kovacs試劑3滴，在15s內(nèi)觀察結(jié)果看是否有顏色變化。

1.2.5 生化試驗

1.2.5.1 糖發(fā)酵試驗

將“1.2.1”中獲得的疑似雞白痢沙門氏菌的分離株用滅菌接種棒分別接種于含有葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、麥芽糖及衛(wèi)矛醇的微量發(fā)酵管中，盲端向上30～45°角 放置，37℃培養(yǎng)24h培養(yǎng)觀察。

1.2.5.2 MR試驗

將“1.2.1”獲得的疑似雞白痢沙門氏菌的分離株用滅菌接種棒接種于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)72h，取出后于培養(yǎng)液中加入甲基紅指示劑5滴，觀察結(jié)果。

1.2.5.3 尿素酶試驗

將“1.2.1”中獲得的疑似雞白痢沙門氏菌的分離株接種于尿素微量發(fā)酵管中，37℃培養(yǎng)24h培養(yǎng)觀察。

1.2.5.4 吲哚試驗

將“1.2.1”中獲得的疑似雞白痢沙門氏菌的分離株接種于生化蛋白胨水培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)24h培養(yǎng)觀察。

1.2.5.5 鳥氨酸試驗

將“1.2.1”中獲得的疑似雞白痢沙門氏菌的分離株接種于生化鳥氨酸微量生化管中，同時設(shè)置氨基酸對照管，上面加一層滅菌液體石蠟，置37℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。

1.2.6 藥敏試驗

按照國外常用的Kirby－Bauer法（簡稱K-B法）進行。在無菌操作的條件下，將鑒定為細菌的純培養(yǎng)物接種于緩沖蛋白胨水中，置于37℃溫箱中培養(yǎng)24h，稀釋菌液至0.5標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)媳葷峁?，用滅菌棉簽蘸取稀釋過的菌液并擠去多余的液體，在MHA平板上均勻涂布，蓋上平板，置室溫數(shù)分鐘至培養(yǎng)基的表面無明顯液體，用無菌小鑷子夾取藥敏紙片平貼于瓊脂平板表面，然后翻轉(zhuǎn)倒置于37℃恒溫箱培養(yǎng)24h，測量抑菌環(huán)直徑并判定結(jié)果。

本實驗所選用的藥敏紙片共有18種：氨芐青霉素（AMP）、羧芐青霉素（CAR）、阿莫西林（AMX）、頭孢他啶（CAZ）、頭孢噻肟（CTX）、鏈霉素（STR）、慶大霉素（GEN）、卡那霉素（KAN）、壯觀霉素（SPT）、環(huán)丙沙星（CIP）、恩諾沙星（ENR）、氟哌酸（NOR）、萘啶酸（NAL）、四環(huán)素（TCY）、氯霉素（CHL）、羅紅霉素（RXT）、利福平（RFP）和磺胺甲噁唑（SMZ）。以抑菌圈直徑的大小判斷敏感性的高低，采用WHO質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌的敏感性及抑菌圈大小劃分方法報告結(jié)果,即敏感、中度敏感和耐藥。藥敏紙片種類及判定標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 藥敏紙片種類及判定標(biāo)準(zhǔn)（mm）

2 結(jié)果

2.1 細菌的形態(tài)觀察

該分離菌在麥康凱培養(yǎng)基上長出無色、透明、細小圓形、光滑、濕潤、邊緣整齊及露滴狀的菌落。在SS培養(yǎng)基上，形成無色透明圓形光滑菌落。在DHL培養(yǎng)基上，形成紅色、圓形光滑細小菌落，如圖1。在XLD培養(yǎng)基上，形成粉紅色、圓形光滑菌落，如圖2。在科瑪嘉培養(yǎng)基上,形成紫色、圓形光滑濕潤菌落,如圖3。

圖1 該菌株在DHL培養(yǎng)基上生長情況

圖2 該分離菌株在XLD培養(yǎng)基上生長情況

圖3 該分離菌株在科瑪嘉培養(yǎng)基上生長情況

2.2 革蘭氏染色鏡檢

在1000倍光學(xué)顯微鏡下，該分離菌菌株為兩端鈍圓、粉紅色、革蘭氏陰性桿菌，如圖4。

圖4 該分離菌菌株在光學(xué)顯微鏡下(1 000倍)

2.3 運動性檢查

該分離菌在半固體中培養(yǎng)無刷狀向外擴散現(xiàn)象，即無運動性。

2.4 氧化酶試驗

該分離菌株培養(yǎng)物在加入Kovacs試劑后沒有出現(xiàn)明顯反應(yīng)，判斷該分離株的氧化酶試驗結(jié)果為陰性。

2.5 生化試驗

生化試驗結(jié)果如表2。

該菌株能夠發(fā)酵葡萄糖、甘露醇，產(chǎn)酸產(chǎn)氣。不發(fā)酵乳糖、蔗糖、麥芽醇和甘露醇，鳥氨酸陽性，吲哚、尿素和MR試驗為陰性。

2.6 藥敏試驗

藥敏試驗結(jié)果如表3。

如表3所示，該菌株對青霉素類的氨芐青霉素、羧芐青霉素、阿莫西林、喹諾酮類的萘啶酸、大環(huán)內(nèi)酯類的羅紅霉素、其他抗生素類的利福平和磺胺類的磺胺異噁唑完全耐藥。對頭孢菌素類的頭孢他啶、頭孢噻肟及氨基糖苷類的慶大霉素、卡那霉素和壯觀霉素都敏感，其抑菌圈分別為：22mm、28mm、21mm、25mm和21mm。對氨基糖苷類的鏈霉素，喹諾酮類的環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氟哌酸，酰胺酮類的氯霉素為中敏，其抑菌圈分別為：13mm、19mm、20mm、11mm和21mm。

3 分析討論

（1）經(jīng)上述鑒別培養(yǎng)、運動性觀察、氧化酶試驗、生化試驗和藥敏試驗結(jié)果表明，該菌株為雞白痢沙門氏菌。

3.2 關(guān)于選擇培養(yǎng)

傳統(tǒng)培養(yǎng)基的特異性較低，使對于沙門氏菌分離時常出現(xiàn)大量的假陰性。有研究表明，XLD和科瑪嘉培養(yǎng)基在表現(xiàn)測試菌落敏感性和現(xiàn)場分離過程中對疑似菌落的篩選鑒別準(zhǔn)確性明顯優(yōu)于WS、SS和HE培養(yǎng)基[6]。曾經(jīng)有報導(dǎo)，XLD和科瑪嘉培養(yǎng)基配合使用的敏感性達到100%[7]。XLD培養(yǎng)基又名木糖-賴氨酸-去氧膽酸鹽培養(yǎng)基，是以指示劑變化為原理的選擇性培養(yǎng)基，可以用于分離臨床標(biāo)本中的腸道致病菌。該培養(yǎng)基含有的木糖、乳糖和蔗糖，有助于鑒別腸細菌，去氧膽酸鈉能夠抑制革蘭氏陽性菌，酚紅作為菌落酸堿指示劑，硫代硫酸鈉和檸檬酸鐵銨能使H2S陽性的腸細菌產(chǎn)生黑色菌落。雞白痢沙門氏菌在XLD培養(yǎng)基上生長時，可見到淡紅色濕潤菌落?？片敿物@色培養(yǎng)基是一種新型培養(yǎng)基，是酶底物顯色型專一性沙門氏菌分離培養(yǎng)基，無需通過任何儀器，僅通過肉眼觀察菌落顏色，即能對病原菌進行定性分析[8]。雞白痢沙門氏菌在科瑪嘉培養(yǎng)基上生長時，可見到呈現(xiàn)淺紫紅色、圓形、光滑突起而濕潤的菌落，特征明顯，辨認比較便捷。鑒于上述原因，目前采用XLD培養(yǎng)基和科瑪嘉顯色培養(yǎng)基對沙門氏菌進行初步分離，可以明顯提高陽性樣品的分離效率，也大大減少了后期鑒定的工作量。

表2 該分離菌株生化試驗結(jié)果

表3 該菌株的藥敏試驗結(jié)果

3.3 關(guān)于生化特性鑒定

雞白痢沙門菌和雞傷寒沙門氏菌在生化特性方面的相同點多于不同點。2者都可以發(fā)酵阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露醇、鼠李糖和木糖，產(chǎn)酸、產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣。不發(fā)酵乳糖、蔗糖。2者細菌的生化特性的重要區(qū)別是，雞傷寒沙門氏菌發(fā)酵衛(wèi)矛醇而雞白痢沙門氏菌不發(fā)酵；雞白痢沙門氏菌培養(yǎng)可以迅速使鳥氨酸脫羧，而雞傷寒沙門氏菌則不然。

3.4 藥敏試驗

在藥敏試驗中，該菌株對氨芐青霉素、羧芐青霉素、阿莫西林、萘啶酸、羅紅霉素、利福平和磺胺異噁唑完全耐藥；對鏈霉素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氟哌酸和氯霉素為中敏；對頭孢他啶、頭孢噻虧、慶大霉素、卡那霉素和壯觀霉素都敏感。以往由于臨床中養(yǎng)殖場用藥的差異等因素，使得各地區(qū)、各養(yǎng)殖場雞白痢沙門氏菌的耐藥譜呈現(xiàn)很大差異[9]。

另外，尚應(yīng)當(dāng)注意，即使經(jīng)藥敏試驗篩選出了一些敏感藥物用于臨床雞白痢的防控，效果并不見得理想，此時，一要考慮是否混合感染大腸桿菌等其他病原[10]，二要注意藥物體外與體內(nèi)作用環(huán)境不同等問題，在實際用藥選擇上應(yīng)作更多科學(xué)、全面的考慮。

[1]Calnek BW Disease of Poultry[M]Icwa:Iowa State University Press,1997:93-107.

[2]中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所.獸醫(yī)微生物學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社,1998:108-113.

[3]王初秀，雞鴨鵝幼雛疾病防治[M].哈爾濱：黑龍江科學(xué)技術(shù)出版社，1991：36-40.

[4]辛朝安.禽病學(xué)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2003：148-150.

[5]黃文宇，柳陳堅.食源性沙門菌株檢測方法的研究進展[J]生物技術(shù)2009，19（3）：95-98.

[6]許學(xué)斌，顧寶柯，楊蘭萍，等.5種沙門菌分離培養(yǎng)基的應(yīng)用和比較[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志.2005.7(15):773-776.

[7]陳茂義，胡婕，劉建昭，等.科瑪嘉顯色培養(yǎng)基和XLD、SS、HE分離食品中沙門氏菌效果比較[J].公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué)，2008，19(4).

[8]周春紅,畢昊容，王蘇華，等.科瑪嘉顯色培養(yǎng)基在檢測飼料中沙門氏菌的應(yīng)用評價[J].獸藥與飼料添加劑.2004.09（5）：25-27.

[9]譚春紅,林居純,陳雅莉,等.四川地區(qū)雞源沙門氏菌耐藥性檢測[J].中國家禽,2010,32(4):55-56.

[10]雷崇良.雞沙門氏菌、大腸桿菌和傳支混合感染的診治[J].中國家禽,2004,26(6):24.