鴨肝炎病毒對(duì)雛鴨腦組織損傷的研究

劉承軍 李 營(yíng) 王海麗

（1聊城市動(dòng)物醫(yī)院 山東聊城 252000 2聊城職業(yè)技術(shù)學(xué)院 山東聊城 252000）

鴨病毒性肝炎是由I型鴨肝炎病毒引起雛鴨的一種急性傳染病，該病發(fā)病急、傳播快及死亡率高[1]。1980年至今，鴨病毒性肝炎在我國(guó)多次暴發(fā)，且發(fā)病嚴(yán)重，流行區(qū)域廣、造成巨大損失，給養(yǎng)鴨業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。本文針對(duì)鴨肝炎病毒人工感染雛鴨出現(xiàn)的明顯神經(jīng)癥狀，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行病理組織學(xué)研究和分子生物學(xué)的研究，采用人工復(fù)制鴨病毒性肝炎模型，動(dòng)態(tài)取材腦組織，普通組織固定和HE染色，腦組織中NO和MDA含量的測(cè)定等方法，分析臨床癥狀、組織學(xué)病變與組織NO、MDA含量之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

752紫外可見光分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、NO試劑盒（南京建成生物有限公司）、MDA試劑盒（南京天成生物科技有限公司）、離心機(jī)（上?；C(jī)械）、切片機(jī)（上?；C(jī)械）。

1.2 毒株

接種材料I型鴨肝炎病毒（DHV-1）由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)病理實(shí)驗(yàn)室保存。毒株的復(fù)壯過程為：接種敏感、抗體陰性的健康櫻桃谷鴨5只，每只腿部肌肉注射0.2mL。收集死亡鴨的肝臟進(jìn)行勻漿，5倍生理鹽水稀釋，加雙抗（青霉素、鏈霉素），過濾后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

50羽1日齡鴨肝炎抗體陰性的健康櫻桃谷鴨，購(gòu)自武漢市天綠農(nóng)業(yè)科技有限公司，常規(guī)飼喂正大牌肉鴨料，自由飲水采食。4日齡后隨即分為2組，每組25羽，其中第一組為對(duì)照組，另外一組為試驗(yàn)組。在試驗(yàn)過程中死亡的鴨，及時(shí)取材腦組織，用于HE染色。

1.4 方法

1.4.1 人工感染模式的復(fù)制及取材

試驗(yàn)組雛鴨進(jìn)行腿部肌肉注射DHV-I病毒懸液0.2mL/羽，對(duì)照組25只，相同部位注射等量生理鹽水。飼養(yǎng)于隔離器內(nèi)。觀察期臨床癥狀，并與感染后0、3、6、12、24和48h按照3羽/組進(jìn)行靜脈放血處死，剖檢觀察病變，采集腦組織，1份甲醛固定用于石蠟切片制作，常規(guī)的HE染色；另一份研磨制成10%腦勻漿，用于NO和MDA濃度等的測(cè)定。

1.4.2 腦勻漿的制備

濾紙吸干腦組織表面的血液，準(zhǔn)確稱取1g腦組織塊，用冷生理鹽水沖洗，加入10mL冰凍磷酸鹽緩沖液（pH7.2），制成100g/L組織勻漿，3000r/min離心15min，取上清液，-20℃保存待用。

1.4.3 測(cè)定方法

MDA含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法；NO濃度利用硝酸還原酶特異性將硝酸根還原為亞硝酸根，通過顯色深淺測(cè)定。所有試劑盒均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

1.4.4 數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)結(jié)果均以平均數(shù)表示，用t檢驗(yàn)法分析對(duì)照組和試驗(yàn)組間的差異顯著性。

1.4.5 脫水及染色嚴(yán)格按有關(guān)程序?qū)M織塊脫水及HE染色。

2 結(jié)果及分析

2.1 臨床變化

臨床觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組鴨沒有發(fā)現(xiàn)特征性表現(xiàn)，在攻毒24h后，試驗(yàn)組雛鴨表現(xiàn)呆滯，離群獨(dú)立，行動(dòng)遲緩，精神沉郁，垂翅縮頸，部分鴨出現(xiàn)抽搐和運(yùn)動(dòng)失調(diào)等癥狀；48h時(shí)部分雛鴨死亡，并于攻毒后72h全部死亡，死鴨呈典型角弓反張狀態(tài)，剖檢發(fā)現(xiàn)，肝臟腫大、質(zhì)脆、色暗或發(fā)黃，表面有大小不等的斑點(diǎn)狀出血；雛鴨的大腦、腎臟、脾及胰腺的表面有點(diǎn)狀或塊狀出血，腸黏膜腫脹、充血。

2.2 組織病理學(xué)變化

圖1 感染雛鴨大腦病理變化（感染3小時(shí)后，血管水腫）

圖2 感染雛鴨大腦病理變化（感染3h后，神經(jīng)元壞死）

圖3 感染雛鴨大腦病理變化（感染24h后，腦膜下充血）

圖4 感染雛鴨大腦病理變化（感染24h，神經(jīng)元壞死）

圖5 死亡雛鴨腦組織病理變化（神經(jīng)元壞死后的小膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)節(jié)）

圖6 死亡雛鴨腦組織病理變化（血管周圍淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)）

圖7 感染雛鴨腦組織病理變化（感染80h后，典型的壞死灶）

大腦于攻毒后3h出現(xiàn)輕度水腫(圖1)，3h到12h出現(xiàn)個(gè)別神經(jīng)元死亡和血管淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2、圖4）。24h神經(jīng)細(xì)胞和血管周圍出現(xiàn)明顯的水腫，血管充血并見輕度出血（圖3），48h后及死亡鴨只的腦組織，膠質(zhì)細(xì)胞呈局造型增生，神經(jīng)元形成壞死結(jié)節(jié)（圖5），血管周圍淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)（圖6），出現(xiàn)典型的神經(jīng)元壞死病灶（圖7）。

對(duì)照組神經(jīng)組織如大腦、小腦等基本正常，偶爾見有輕度充血和水腫。

2.3 NO、MDA測(cè)定結(jié)果

表1 腦組織中NO、MDA含量的測(cè)定結(jié)果（n=3）

試驗(yàn)組雛鴨腦組織中NO含量測(cè)定結(jié)果見表1。腦組織中NO含量在接種后12h開始逐步升高，48h到達(dá)測(cè)定最大值，隨后雛鴨開始死亡。腦組織中MDA含量從12h開始逐步增高，到48h達(dá)到測(cè)定最大值，和腦組織中NO含量變化一致。對(duì)照組腦組織中NO和MDA含量均變化不顯著。這2項(xiàng)數(shù)據(jù)的一致性可以一定程度反映出，隨著NO含量的增加，腦組織過氧化反應(yīng)也在加劇，腦組織損傷不斷推進(jìn)。

2.4 結(jié)論

試驗(yàn)組雛鴨臨床癥狀和剖檢病變及組織學(xué)病理變化相一致，可以一定程度反映出腦組織病變和雛鴨神經(jīng)癥狀之間的關(guān)聯(lián)程度。經(jīng)過腦組織中NO和MAD的測(cè)定顯示，NO含量隨時(shí)間的變化規(guī)律和MDA隨時(shí)間的變化相一致，可以反映出NO在腦組織病變中發(fā)揮了一定作用。縱向來看，NO在雛鴨病毒性肝炎的發(fā)生、發(fā)展的過程中發(fā)揮了一定作用；NO可能是雛鴨出現(xiàn)神經(jīng)癥狀和腦組織病變的原因之一。

3 討論

自由基是機(jī)體正常生化過程的產(chǎn)物，參與生物體許多病理、生理過程[2]。正常情況下，自由基的產(chǎn)生與清除保持著動(dòng)態(tài)平衡。任何增強(qiáng)氧化作用和（或）降低抗氧化能力的因素均可打破這一平衡，致氧自由基增加。試驗(yàn)結(jié)果表明，氧自由基可以介導(dǎo)腦組織的損傷，導(dǎo)致疾病的發(fā)生、發(fā)展。生物體內(nèi)的自由基，與過氧化氫反應(yīng)所產(chǎn)生的羥自由基可引發(fā)脂類過氧化，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，使細(xì)胞膜破壞，通透性增加，蛋白質(zhì)及DNA變形[2]。

有研究結(jié)果表明，鴨肝炎病毒對(duì)雛鴨神經(jīng)組織的損傷，早期以水腫為主，后期以變形、壞死增生為主，與本試驗(yàn)結(jié)果相同。

PUFA在ROS的作用下，可在不飽和雙鍵上不斷發(fā)生過氧化反應(yīng)，MDA為脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物之一，它可反映脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映自由基變化程度。本試驗(yàn)結(jié)果表明，腦組織中MDA含量隨著時(shí)間的發(fā)展不斷增加，且在攻毒后48h時(shí)含量最高，腦組織中的MDA含量增加規(guī)律同鴨的臨床癥狀和組織學(xué)病變的發(fā)展規(guī)律一致，一定程度上反應(yīng)了組織損傷的發(fā)展規(guī)律，同時(shí)也驗(yàn)證了腦組織的損傷一定程度上是由自由基反應(yīng)引起的。

NO是常見的炎癥介質(zhì)。研究表明，NO參與了各種原因引起的組織損傷，既有保護(hù)性作用，又有細(xì)胞毒性作用。NO生成過多，將通過機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)、脂肪和核酸等生物分子的作用，損傷組織細(xì)胞，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒性作用。試驗(yàn)組腦組織中NO含量隨著時(shí)間的增加而不斷增加，表明NO在疾病發(fā)生發(fā)展過程中扮演了重要的角色，在腦組織損傷方面發(fā)揮了一定的作用。NO作為一種重要的自由基，在腦組織生理、病理方面都扮演了重要的角色；MDA作為自由基脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的一種重要產(chǎn)物，其測(cè)定從反應(yīng)細(xì)胞膜損傷方面具有一定意義[3]。但是NO和MDA之間具體的量化關(guān)系尚不明確，NO引起腦組織細(xì)胞其他方面的病變（比如增生、核酸和蛋白質(zhì)損傷）尚不明確，需要我們進(jìn)一步研究。

[1]王丙云,黃興國(guó),陳志勝,等.雛鴨感染鴨病毒性肝炎后神經(jīng)系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)病理學(xué)觀察[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2003(1)：14-15.

[2]鄭艷華,胡薛英,程國(guó)富,等.感染新型鴨肝炎病毒雛鴨的SOD活性和MDA含量變化[J].中國(guó)獸醫(yī)科技，2004(12),6-9.

[3]叢濤,趙霖,鮑善芬.臨床營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究中脂質(zhì)過氧化的評(píng)價(jià)方法 [J].中國(guó)臨床營(yíng)養(yǎng)雜志，2004(2)：127-131.