金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的亞臨床乳房炎小鼠血清IL-17研究1*

敬曉棋，劉健鵬，馮 平，黃光東，張 曦，閆海龍，屈 雷*

(1.榆林學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院 陜西省絨山羊工程技術(shù)研究中心，陜西 榆林 719000；2.榆林市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，陜西 榆林，719000；3.陜西溯源農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，陜西 西安 710000)

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金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的亞臨床乳房炎小鼠血清IL-17研究1*

敬曉棋1，劉健鵬2，馮 平1，黃光東3，張 曦2，閆海龍1，屈 雷1*

(1.榆林學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院 陜西省絨山羊工程技術(shù)研究中心，陜西 榆林 719000；2.榆林市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，陜西 榆林，719000；3.陜西溯源農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，陜西 西安 710000)

細(xì)胞因子與乳腺免疫緊密相關(guān)，IL-17是否是介導(dǎo)乳腺免疫的重要細(xì)胞因子對(duì)深入研究乳腺免疫機(jī)制和乳房炎防控具有重要意義。研究以分娩后7～12 d的C57BL/6小鼠為模型動(dòng)物，將從隱性乳房炎的奶牛乳汁分離的金黃色葡萄球菌(S.aureus)50 μL(1×107CFU)或等量的無(wú)菌生理鹽水通過乳導(dǎo)管緩慢注入小鼠第四、五對(duì)乳腺，分別于感染后2 h、4 h、8 h、12 h、18 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h摘眼球采血并分離血清，通過ELISA法測(cè)定血清中IL-17A、IL-6、TGF-β的含量。結(jié)果顯示IL-17在S.aureus感染后8～24 h含量升高，其中18 h時(shí)顯著高于對(duì)照小鼠，48 h和時(shí)60 h IL-17低于對(duì)照小鼠，而IL-6和TGF-β含量無(wú)明顯變化。研究結(jié)果表明，這小鼠存在已分化的記憶性IL-17分泌細(xì)胞，S.aureus的感染誘導(dǎo)其快速的分泌了IL-17，也證實(shí)IL-17也是乳房炎病理過程中的細(xì)胞因子之一。

小鼠乳房炎;血清;IL-17;IL-6;TGF-β

乳房炎是奶牛、奶山羊最常見和危害最大的疾病，嚴(yán)重影響奶牛、奶山羊產(chǎn)業(yè)的效益及乳制品的質(zhì)量和安全。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)是自然界廣泛存在的一種能夠引起人和動(dòng)物多種疾病的條件性病原微生物，是奶牛、奶山羊等乳用動(dòng)物臨床和亞臨床型乳房炎最主要病原菌之一[1-3]。改善和提高動(dòng)物機(jī)體自身的防御機(jī)制預(yù)防和控制乳腺炎，是更為有效和安全的的措施[4]。

細(xì)胞因子是細(xì)胞與細(xì)胞交流的關(guān)鍵信使分子，并與維持機(jī)體免疫自穩(wěn)及病理過程的調(diào)節(jié)有關(guān)[5]。乳腺炎病理過程中免疫細(xì)胞的活性主要受到促炎因子的調(diào)控，其作用包括增強(qiáng)巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的殺微生物活性、促進(jìn)中性粒細(xì)胞向感染部位的遷移、刺激樹突狀細(xì)胞成熟、調(diào)控獲得性免疫反應(yīng)[6]。目前，在健康乳腺和受感染的乳腺已發(fā)現(xiàn)IL(interleukin)-1β，IL-2，IL-6，IL-8，IL-12，IL-17，集落刺激因子(colony-stimulating factors，CSF)，IFN-γ，及TNF(tumor necrosis factor)-α等多種細(xì)胞因子[7-9]。

在乳房炎研究中小鼠是組織免疫研究的最佳模型，避免了奶牛、奶山羊等家畜模型和試劑方面的不足。本研究通過乳汁分離的S.aureus誘導(dǎo)了C57BL/6小鼠的隱性乳腺炎，對(duì)乳腺炎癥過程中小鼠血清中IL-6、IL-17、TGF(transforming growth factor)-β等細(xì)胞因子進(jìn)行了系統(tǒng)性研究，探討了隱性乳腺炎循環(huán)系統(tǒng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，對(duì)將來(lái)進(jìn)一步研究乳腺免疫機(jī)制提供了有意義的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

6周齡的C57BL/6小鼠購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，于西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心飼養(yǎng)。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境恒溫(22 ℃)、恒濕，每天光照12 h，自由飲水和采食。小鼠適應(yīng)新環(huán)境1周后，雌雄合籠交配。分娩后1周時(shí)，仔鼠不少于5只的母鼠用于S.aureus乳房炎模型建立。

1.2 菌 株

本研究所用金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)是從陜西關(guān)中地區(qū)患慢性乳房炎的關(guān)中奶山羊乳汁分離，經(jīng)中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)督所鑒定為金黃色葡萄球菌，并由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3S.aureus乳腺內(nèi)注射

21只泌乳7～12 d C57BL/6的小鼠用于本次試驗(yàn)，其中18只為試驗(yàn)組，另3只為生理鹽水對(duì)照。參考Brouillette and Malouin[10]的試驗(yàn)方法進(jìn)行小鼠乳腺內(nèi)S.aureus注射，具體如下。乳腺內(nèi)注射前2 h將小鼠與仔鼠分離，小鼠按150～200 mg/kg的劑量腹腔注射注射氯胺酮，待小鼠麻醉后進(jìn)行乳腺內(nèi)注射。將小鼠用紙膠帶仰面固定于泡沫板上，對(duì)其腹部第4對(duì)和第5對(duì)乳腺用70%酒精消毒，用32G針頭通過乳導(dǎo)管將1×107CFU 的S.aureus緩慢注入乳腺，每個(gè)乳頭50 μL。對(duì)照組注射等量的無(wú)菌生理鹽水。小鼠放回籠子，自然蘇醒。對(duì)照小鼠于乳腺內(nèi)注射后24 h處死，試驗(yàn)組小鼠分別于乳腺內(nèi)注射后8 h、12 h、18 h、24 h、48 h、60 h時(shí)處死，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3只。

1.4 小鼠血清細(xì)胞因子測(cè)定

摘眼球采血, 自然凝血30 min，3000 r/min離心30 min，吸取血清，―20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

按照TGF-β ELISA試劑盒(R&D分裝)、Mouse IL-6 ELISA MAXTMStandard(Biolegend Ltd.)和Mouse IL-17A ELISA MAXTMStandard(Biolegend Ltd.)試劑盒說明書進(jìn)行小鼠血清IL-17A、IL-6、TGF-β含量的測(cè)定。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)果用GraphPad Prism 5.01進(jìn)行分析，P<0.05視為具有顯著性差異，P<0.01視為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠血清IL-17、TGF-β及IL-6水平

本試驗(yàn)通過ELISA對(duì)小鼠血清中IL-17、TGF-β及IL-6蛋白進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示IL-17在S.aureus感染后8～24 h含量升高，其中18 h時(shí)顯著高于對(duì)照小鼠(P<0.05)，8 h和時(shí)60 h IL-17低于對(duì)照小鼠(圖1)。與對(duì)照小鼠相比，S.aureus感染后試驗(yàn)小鼠血清中IL-6(圖2)和TGF-β(圖3)含量無(wú)明顯變化。

圖1 S.aureus 感染后小鼠血清IL-17A含量水平動(dòng)態(tài)變化

圖2 S.aureus 感染后小鼠血清IL-6含量水平動(dòng)態(tài)變化

圖3 S.aureus 感染后小鼠血清TGF-β(B)含量水平動(dòng)態(tài)變化

3 討 論

改善和提高動(dòng)物機(jī)體自身的防御機(jī)制預(yù)防和控制乳腺炎，是更為有效和安全的的措施[4]，其中促炎性細(xì)胞因子在介導(dǎo)抗感染免疫中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[11]。IL-17作用于造血細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞，并誘導(dǎo)分泌IL-6、G-CSF、GM-CSF、IL-1β、TGF-β、TNF-α等多種炎性細(xì)胞因子分泌[12-13]，誘導(dǎo)氣管、肺、腸道、皮膚等黏膜部位中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，清除細(xì)菌、病毒、真菌等感染的病原微生物[14]。然而，鑒于奶牛、奶山羊等大型乳用動(dòng)物的局限，深入的研究乳房炎發(fā)病過程中細(xì)胞因子等免疫效果的研究還需要通過實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型進(jìn)行。因此，本研究通過從奶山羊亞臨床型乳房炎乳中分離的金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)了小鼠乳房炎模型，對(duì)炎癥過程中外周血IL-17、IL-6、TGF-β的含量變化進(jìn)行了研究。

國(guó)內(nèi)外在奶牛、奶山羊的研究結(jié)果顯示IL-17及其分泌細(xì)胞在動(dòng)物乳腺炎中可能具有關(guān)鍵作用[15-17]。本研究結(jié)果顯示IL-17在S.aureus感染后8～24 h含量升高，其中18 h時(shí)顯著高于對(duì)照小鼠(P<0.05)，48 h和時(shí)60 h IL-17低于對(duì)照小鼠(圖1)。結(jié)果表明在S.aureus感染的早期階段，能夠誘導(dǎo)機(jī)體外周血IL-7含量的升高，然而48 h后其含量降低，這可能與乳腺炎癥反應(yīng)減弱有關(guān)。盡管乳腺上皮細(xì)胞能夠通過模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors, PPRs)家族D的Toll樣受體(toll-like-receptors, TLRs) 快速的感知S.aureus感染的信號(hào)，然而S.aureus并不能活化轉(zhuǎn)錄因子NF- κB，從而不能有效促進(jìn)促炎性細(xì)胞因子合成、免疫應(yīng)答強(qiáng)調(diào)減弱及最終導(dǎo)致隱性乳房炎[18]，這也可能是本研究中S.aureus感染后8～24 h時(shí)IL-17含量升高，而之后含量降低的原因。

IL-6與TGF-β協(xié)同是IL-17分泌細(xì)胞分化的關(guān)鍵細(xì)胞因子條件[19-20]。然而本研究中，與對(duì)照小鼠相比S.aureus感染后試驗(yàn)小鼠血清中IL-6(圖2)和TGF-β(圖3)的含量無(wú)明顯變化，這可能是由于機(jī)體本身就存在已分化的記憶性IL-17分泌細(xì)胞，S.aureus的感染誘導(dǎo)其快速的分泌了IL-17[21]，這也與乳腺IL-17免疫組織化學(xué)研究結(jié)果一致，乳腺內(nèi)天然存在一定數(shù)量的IL-17分泌細(xì)胞。

4 結(jié) 論

本研究在小鼠模型上證實(shí)了IL-17也是乳房炎病理過程中的細(xì)胞因子之一，然而IL-17及其分泌細(xì)胞是否是調(diào)控乳腺炎癥的關(guān)鍵還有待進(jìn)一步的深入研究。

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IL-17 in Sera of Mice with Subclinical Mastitis Induced withStaphylococcusaureus

JING Xiao-qi1, LIU Jian-peng2, FENG Ping1, HUANG Guang-dong3, ZHANG Xi2, YAN Hai-long1, QU Lei1*

(1.ShaanxiEngineeringTechnologyResearchCenterofCashmereGoat,LifeScienceCollege,YulinUniversity,Yulin,Shaanxi, 719000; 2.YulinCenterOfAnimalDiseasePreventionAndControl,Yulin,Shaanxi, 719000; 3.ShaanxiShuoyuanAgriculturalDevelopmentLtd,Xi'an,Shaanxi, 710000)

Cytokines is related closely with mammary gland immunity. Whether IL-17 is an important cytokines affecting mammary gland immunity means much to the study of mammary immunity mechanism and mastitis prevention . Lactating C57BL/6 mice as the research animal were challenged 7 to 12 days after parturition. A 32 G needle with a blunt end was then inserted into the fourth and fifth teat canal and a volume of 50 μL was slowly injected. Challenged mice received 1×107CFU ofS.aureusin every challenged mammary gland while control mice were inoculated with germ-free saline in all challenged glands. The concentrations of IL-17, IL-6, TGF-β in sera of mice were examined at 2 h,4 h,8 h,12 h,18 h,24 h,36 h,48 h,60 h and 72 h after infection. The results displayed that the level of IL-17 in sera increased 24 h after infection withS.aureusand its value was sifnificantly higher than that in the control mice 18 h after infection. However, the level of TGF-β and IL-6 in sera were not significantly different compared with that in control group. The results suggested that IL-17 may be an important cytokine in mediating the inflammation of mammary gland when infected withS.aureus.

mice mastitis, sera, IL-17, IL-6, TGF-β

2015-01-29

2015-04-02

2013年度陜西省教育廳項(xiàng)目(2013JK0706)；榆林學(xué)院校內(nèi)重點(diǎn)項(xiàng)目(13YK42)；榆林學(xué)院博士科研啟動(dòng)基金(14GK38)

敬曉棋(1977-)，男，陜西鳳翔人，博士，副教授，主要從事動(dòng)物疫病防控和動(dòng)物生物技術(shù)研究。E-mail：jingxiaoqi@126.com

*[通訊作者] 屈 雷(1969-)，男，陜西定邊人，博士，教授，主要從事動(dòng)物疫病防控和動(dòng)物生物技術(shù)研究。E-mail：ylqulei@126.com

S811.6

A

1005-5228(2015)08-0066-04