淺析微生物鑒定在污染調(diào)查中的應(yīng)用

鮑方名 沈海英

（蘇州市食品藥品檢驗(yàn)所，蘇州 215004）

淺析微生物鑒定在污染調(diào)查中的應(yīng)用

鮑方名 沈海英

（蘇州市食品藥品檢驗(yàn)所，蘇州 215004）

通過對(duì)生化水平、基因水平和質(zhì)譜微生物鑒定系統(tǒng)的分析介紹，比較了不同微生物鑒定系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)，討論其在污染調(diào)查中的應(yīng)用。針對(duì)生化水平和質(zhì)譜微生物鑒定系統(tǒng)不能鑒定的微生物，不一定要選擇基因水平鑒定，可以選擇進(jìn)行圖譜溯源和消毒劑殺滅試驗(yàn)達(dá)到清除污染的效果。

微生物；鑒定；污染調(diào)查；

按照我國(guó)GMP要求，藥品生產(chǎn)企業(yè)對(duì)生產(chǎn)環(huán)節(jié)的微生物污染需要定期監(jiān)控?，F(xiàn)有的藥典和潔凈室環(huán)境檢測(cè)要求，通過微生物限度檢查、無菌檢查、沉降菌監(jiān)測(cè)、浮游菌監(jiān)測(cè)、接觸碟和手套等多種手段收集污染微生物，得到量化的數(shù)據(jù)。而微生物鑒定通過鑒定不同來源的微生物種類，起到溯源調(diào)查、從源頭控制污染和選擇合適的消毒劑的作用[1]。

隨著對(duì)鑒定效率的不斷提高，自動(dòng)化程度較高的商業(yè)化微生物鑒定系統(tǒng)逐步占據(jù)市場(chǎng)。法國(guó)梅里埃公司的Vitek 2 Compact在2005版藥典中被提及。2014年10月，美國(guó)Biolog公司GEN III MicroStation型自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)在中國(guó)食品藥品檢定研究院化學(xué)藥品檢定所微生物檢測(cè)室正式投入使用。2013年8月，F(xiàn)DA批準(zhǔn)首個(gè)質(zhì)譜儀系統(tǒng)VITEK MS用于鑒定細(xì)菌和真菌。微生物鑒定所需時(shí)間從小時(shí)正式進(jìn)入分鐘計(jì)算。但是，這些種類繁多的微生物鑒定系統(tǒng)真正能達(dá)到100 %鑒定嗎？鑒定出的結(jié)果如何能更好的利用于污染調(diào)查？本文將介紹不同的微生物鑒定系統(tǒng)及其在污染調(diào)查中的應(yīng)用。

1 生化水平鑒定

目前市場(chǎng)上用的比較多的生化反應(yīng)鑒定系統(tǒng)有API，Phoenix-100，VITEK 2 Compact和Biolog。從基本原理上，API，Phoenix-100，VITEK 2 Compact系統(tǒng)就是生理生化方法的儀器化操作。通過固定在不同種類檢測(cè)卡的數(shù)十種生化反應(yīng)底物與待檢菌進(jìn)行反應(yīng)，將待檢菌的生理生化結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)中的結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，得出相似度在一定數(shù)值的鑒定結(jié)果。優(yōu)點(diǎn)是可同時(shí)進(jìn)行多種生理生化測(cè)試，不需要人工配制多種生化反應(yīng)底物；全程機(jī)器培養(yǎng)判讀，避免經(jīng)驗(yàn)不足影響人工判讀；檢測(cè)時(shí)間縮小到小時(shí)級(jí)別。而Biolog系統(tǒng)通過檢測(cè)待測(cè)細(xì)菌對(duì)95種不同碳源的代謝情況，分析細(xì)菌的代謝過程，并通過對(duì)系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)純系菌株的快速鑒定。

通過使用發(fā)現(xiàn)，由于還是生理生化反應(yīng)的結(jié)果，不同培養(yǎng)時(shí)間的菌落檢測(cè)結(jié)果不一致；不同系統(tǒng)的生化反應(yīng)由于公司壁壘互有不同，鑒別結(jié)果有不一致的現(xiàn)象；各菌種數(shù)據(jù)庫(kù)比較小，只有幾百種左右，如表1所示，最多的Biolog系統(tǒng)也僅有2 700種；鑒定結(jié)果的相似度也有高有低，甚至不能鑒定。遇到相似度比較低或不能鑒定的情況，無法判斷鑒定結(jié)果是否有效。要想起到溯源的效果，可以手動(dòng)將卡位中的生理生化結(jié)果記錄下來。

表1 不同鑒定系統(tǒng)菌種數(shù)據(jù)庫(kù)比較Tab.1 Microbial database comparison of different identification systems

2 基因水平鑒定

16S rRNA基因序列在微生物中有著廣泛的保守性和序列多態(tài)性，可以顯示微生物的親緣關(guān)系和進(jìn)化特征，是現(xiàn)有條件下微生物分類學(xué)研究的重要手段。鑒定流程是菌落基因組提取，通過16S rRNA通用引物擴(kuò)增得到16S rDNA，用T-克隆載體進(jìn)行PCR產(chǎn)物克隆，送測(cè)序公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，得到相似度從高到低的鑒定結(jié)果。

由于最后的測(cè)序結(jié)果要用于比對(duì)，為了減少基因突變，必須選擇保真度高的PCR聚合酶。New England Biolabs的科學(xué)家測(cè)定Taq聚合酶的錯(cuò)誤率為2.7×10-4± 0.8×10-4，或每3 700個(gè)堿基1個(gè)錯(cuò)誤。這些數(shù)據(jù)表明，利用Taq以25個(gè)PCR循環(huán)擴(kuò)增400 bp的片段，可能一半的克隆都帶有錯(cuò)誤。對(duì)于較大的片段如1 kb左右的16S rRNA基因序列，每個(gè)克隆都可能帶有不想要的突變。

鑒定流程中會(huì)涉及很多分子生物學(xué)物料，如果仔細(xì)研究說明書，會(huì)發(fā)現(xiàn)很多有“本產(chǎn)品僅供科研使用”或“This product is intended to be used for research only.They are not to be used for drug or diagnostic purpose.”的警示標(biāo)志。 能否用于最后的判定還是僅作為參考還有待商榷。

BLAST比對(duì)的數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank為公用序列數(shù)據(jù)庫(kù)，收錄基因來源門檻極低，存在收錄的基因質(zhì)量不穩(wěn)定，某些序列命名錯(cuò)誤等種種問題。陳源源等從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中收集了細(xì)菌16S rDNA序列、絲狀真菌ITS序列以及酵母26S rDNA D1/D2區(qū)域序列共88條，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有17條序列（19.3 %）的長(zhǎng)度過短，無法提供足夠的系統(tǒng)發(fā)育信息；5條序列（5.6 %）存在錯(cuò)誤命名或測(cè)序不準(zhǔn)確問題；58條序列（65.9 %）沒有相關(guān)文章發(fā)表；62條序列（70.4 %）無法獲取對(duì)應(yīng)的微生物保藏物[2]。從而提示了GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的有限參考價(jià)值。Life公司等也根據(jù)自有的PCR體系及測(cè)序系統(tǒng)準(zhǔn)備了商業(yè)化數(shù)據(jù)庫(kù) 但是數(shù)量還是不能與GenBank相比，而且是搭配機(jī)器購(gòu)買，收費(fèi)昂貴。

3 MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定

MALDI-TOF質(zhì)譜實(shí)現(xiàn)軟電離，借助化學(xué)基質(zhì)分析蛋白質(zhì)。DHB（dihydroxybenzoic acid）最適合分析糖苷和糖蛋白，芥子酸最適合高分子量蛋白，CHCA（α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid）最適合低分子量蛋白。激光造成樣本和基質(zhì)的揮發(fā)，形成的離子被高電壓加速并在飛行管中以不同質(zhì)量分開，在飛行管末端進(jìn)行檢測(cè)，得到全細(xì)胞的蛋白譜。

2013年8月21日美國(guó)食品和藥品監(jiān)督管理局（FDA）允許第一個(gè)質(zhì)譜系統(tǒng)VITEK MS為自動(dòng)鑒定已知在人類中致嚴(yán)重疾病的細(xì)菌和酵母菌。VITEK MS可鑒定193種不同的微生物和可在單一自動(dòng)化測(cè)試系列中進(jìn)行至192種不同的測(cè)試，每個(gè)測(cè)試花費(fèi)約1 min。一般認(rèn)為，不同菌種具有不同圖譜。但是蛋白質(zhì)譜是否能等同于基因圖譜具有唯一性，還有待進(jìn)一步研究。至于新型申請(qǐng)，F(xiàn)DA決議是基于一項(xiàng)7 068種微生物研究結(jié)果，相比排序和生化檢測(cè)，VITEK MS可以將87.5 %的微生物鑒別到種屬的水平。研究中VITEK MS為對(duì)3.2 %的微生物提供“無標(biāo)識(shí)”結(jié)果。在所有的測(cè)試結(jié)果中，只有0.8 %的微生物鑒別是不正確的，也只有2.4 %鑒別結(jié)果與正確結(jié)果有低的區(qū)分力。孟冬婭等在比較并評(píng)價(jià)兩種商業(yè)化MALDI-TOF MS系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)，VITEK MS會(huì)對(duì)表2中的3種菌鑒別出錯(cuò)誤結(jié)果[3]。由于在嚴(yán)重疾病診斷過程中體現(xiàn)出極大的時(shí)間優(yōu)勢(shì)，MALDI-TOF質(zhì)譜已經(jīng)被各大醫(yī)院配置使用。

表2 VITEK MS鑒定錯(cuò)誤結(jié)果Tab.2 False identification result from VITEK MS

4 微生物鑒定在污染調(diào)查中的應(yīng)用

通過以上各種鑒定方法的比較，不難發(fā)現(xiàn)不論是生化水平鑒定還是質(zhì)譜鑒定，在現(xiàn)有的條件下都存在一定的不足，儀器廠家也在針對(duì)這些問題進(jìn)行不懈的研究和進(jìn)一步的開發(fā)。而基因水平的檢測(cè)由于專業(yè)性較高，操作難度較大，還不能大范圍地應(yīng)用。而且基因檢測(cè)的結(jié)果是否具有判斷的效力還需要行業(yè)更進(jìn)一步的規(guī)范。但是，如果我們?cè)谖廴菊{(diào)查中遇到無法鑒定或者鑒定相似度不高的結(jié)果時(shí)，應(yīng)該如何處理呢？其實(shí)，在污染調(diào)查中我們進(jìn)行微生物鑒定，主要目的是想獲得菌種的詳細(xì)信息：便于發(fā)現(xiàn)在其他地方或者過去是否出現(xiàn)過，可以調(diào)查污染出現(xiàn)的源頭。而且可以根據(jù)菌種的類型選擇合適的消毒劑達(dá)到清除污染的效果。如果無法獲得鑒定結(jié)果，以質(zhì)譜系統(tǒng)為例，可以獲得待檢菌的質(zhì)譜圖用于溯源比對(duì)。同時(shí)，選擇一些不同類型的消毒劑進(jìn)行殺滅試驗(yàn)，獲得有效的消毒劑種類和作用濃度，也可以達(dá)到殺滅的效果。

如圖1所示，微生物污染調(diào)查可以按照流程圖進(jìn)行。同時(shí)，必須強(qiáng)調(diào)革蘭氏染色和鏡檢在商業(yè)化檢測(cè)之前的重要性[4]。正確的形態(tài)學(xué)結(jié)果是選擇不同鑒定卡（生化鑒定）和不同基質(zhì)（質(zhì)譜鑒定）的基礎(chǔ)，選擇錯(cuò)誤將直接導(dǎo)致鑒定無效（無法鑒定或鑒定錯(cuò)誤）。在一些生化鑒定儀器的專家系統(tǒng)中，也常常要求進(jìn)行補(bǔ)充生化試驗(yàn)來提供更進(jìn)一步的判斷依據(jù)。

圖1 微生物污染調(diào)查流程圖Fig.1 Microbial contamination investigation flowchart

5 結(jié)束語(yǔ)

隨著藥品行業(yè)和監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì)微生物污染的不斷重視，微生物鑒定的手段在不斷推陳出新，鑒定的速度在飛速提高。但是，面對(duì)名目繁多的鑒定手段，一定不要忘記為什么鑒定的本來目的。從單一的藥品生產(chǎn)企業(yè)來說，也沒有必要建立那些比較大型的鑒定系統(tǒng)，如何利用好自己的鑒定手段建立自己的判斷規(guī)則才是明智之選。如果遇到特別頑固的污染菌污染，可以選擇專業(yè)的鑒定機(jī)構(gòu)進(jìn)行基因水平的鑒定。

[1] 范一靈，房蕊，蔣波，等.微生物鑒定分型技術(shù)應(yīng)用于醫(yī)藥企業(yè)微生物污染調(diào)查[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2010，41（11）：810-822.

[2] 陳源源，沈微，樊游，等.GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中微生物rDNA序列準(zhǔn)確性研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38（3）：29-31.

[3] 孟冬婭，任微，羅艷萍，等.兩種MALDI-TOF質(zhì)譜儀對(duì)臨床分離細(xì)菌鑒定結(jié)果的比較[J/CD].中華實(shí)驗(yàn)和臨床感染病雜志：電子版，2014，8（2）：178-182.

[4] 陳東科.加強(qiáng)形態(tài)學(xué)檢查提高細(xì)菌鑒定的準(zhǔn)確性[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)：2012，30（5）：419-422.

中國(guó)醫(yī)藥工程設(shè)計(jì)協(xié)會(huì)召開《醫(yī)藥工業(yè)潔凈廠房設(shè)計(jì)規(guī)范》送審稿審查會(huì)

2015年7月22日，由中國(guó)醫(yī)藥工程設(shè)計(jì)協(xié)會(huì)組織，中石化上海工程有限公司主編的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《醫(yī)藥工業(yè)潔凈廠房設(shè)計(jì)規(guī)范》送審稿召開審查會(huì)。全國(guó)醫(yī)藥設(shè)計(jì)、生產(chǎn)、施工及監(jiān)管部門的22位專家參加會(huì)議。

2009年6月1日正式實(shí)施的GB 50457—2008《醫(yī)藥工業(yè)潔凈廠房設(shè)計(jì)規(guī)范》是我國(guó)醫(yī)藥工程領(lǐng)域第一本設(shè)計(jì)規(guī)范。隨著我國(guó)《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》（GMP）2010版的頒布實(shí)施，以及近年來國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥工程建設(shè)和醫(yī)藥潔凈技術(shù)的不斷發(fā)展，國(guó)家住建部將修訂《醫(yī)藥工業(yè)潔凈廠房設(shè)計(jì)規(guī)范》列入國(guó)家計(jì)劃。編寫組在總結(jié)我國(guó)醫(yī)藥工業(yè)潔凈廠房設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，認(rèn)真收集意見，開展調(diào)研測(cè)試，完成了規(guī)范修訂版的征求意見稿。2015年2月，在公示并廣泛收集社會(huì)意見的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步修改完成了送審稿。

與會(huì)專家認(rèn)真審閱了《醫(yī)藥工業(yè)潔凈廠房設(shè)計(jì)規(guī)范》送審稿，一致認(rèn)為：此次修編工作對(duì)規(guī)范我國(guó)醫(yī)藥工業(yè)潔凈廠房設(shè)計(jì)水平起到了提升的作用，同時(shí)使醫(yī)藥工程設(shè)計(jì)有章可循，具有指導(dǎo)意義，代表了國(guó)內(nèi)該領(lǐng)域設(shè)計(jì)規(guī)范的最新水平；本次修訂工作思路清晰，其條文較好地反映了目前我國(guó)醫(yī)藥工業(yè)潔凈廠房的特點(diǎn)，體現(xiàn)了與GMP宗旨的一致性。該規(guī)范在吸收國(guó)外醫(yī)藥工程設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合國(guó)情，注意與各相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)協(xié)調(diào)一致，對(duì)醫(yī)藥工業(yè)潔凈廠房設(shè)計(jì)中專業(yè)設(shè)計(jì)作了切合實(shí)際的規(guī)定，具有較好的實(shí)用性和可操作性。

中石化上海工程有限公司編寫組成員表示將對(duì)該規(guī)范作進(jìn)一步修改、完善，盡快完成報(bào)批稿。

（魏永忠）

第一、二屆制藥裝備企業(yè)高管培訓(xùn)班圓滿舉辦

為了讓國(guó)內(nèi)制藥裝備企業(yè)能更好地適應(yīng)轉(zhuǎn)型期的變化，提高企業(yè)的核心競(jìng)爭(zhēng)力，中國(guó)制藥裝備行業(yè)協(xié)會(huì)開展了教育培訓(xùn)服務(wù)工作。近期的培訓(xùn)內(nèi)容為了解《新經(jīng)濟(jì)時(shí)代的商業(yè)模式設(shè)計(jì)與創(chuàng)新》、《企業(yè)上市新機(jī)遇——新三板實(shí)務(wù)》方面，行業(yè)協(xié)會(huì)特邀請(qǐng)中國(guó)本土商業(yè)模式、營(yíng)銷策劃專家黃宏教授和投融資與企業(yè)上市實(shí)踐專家徐京教授授課、培訓(xùn)。

中國(guó)制藥裝備行業(yè)協(xié)會(huì)舉辦的第一、二屆制藥裝備企業(yè)高管培訓(xùn)班，于2015年7月和8月分別在浙江瑞安和江蘇常州開班。中國(guó)制藥裝備行業(yè)協(xié)會(huì)理事長(zhǎng)高川等領(lǐng)導(dǎo)與來自全國(guó)各地制藥機(jī)械企業(yè)的一百多位高管一起進(jìn)行了為期兩天的第一屆學(xué)習(xí)培訓(xùn)。

第一屆培訓(xùn)班開班儀式由趙琳副秘書長(zhǎng)主持，理事長(zhǎng)高川先生致辭。高理事長(zhǎng)闡述本次高管培訓(xùn)班開班的意義時(shí)說：當(dāng)前正值經(jīng)濟(jì)下行，制藥裝備行業(yè)發(fā)展的拐點(diǎn)期，企業(yè)如何創(chuàng)新，如何穩(wěn)定長(zhǎng)足地發(fā)展，企業(yè)如何利用資金市場(chǎng)的變革，進(jìn)行資本運(yùn)作走向新生，成了擺在各位企業(yè)家面前必然要思考的課題。抓住這個(gè)契機(jī)，為企業(yè)發(fā)展做些微薄服務(wù)，促進(jìn)行業(yè)的發(fā)展，是協(xié)會(huì)存在的根本。本屆培訓(xùn)班是首次嘗試，將來還要把培訓(xùn)作為常態(tài)工作，在各個(gè)方面為企業(yè)提供服務(wù)。

（陳曦）

“大型偶聯(lián)反應(yīng)器工程技術(shù)開發(fā)及國(guó)產(chǎn)化研制”等3個(gè)項(xiàng)目通過技術(shù)鑒定

近期，中石化上海工程有限公司承擔(dān)的中國(guó)石化科技開發(fā)項(xiàng)目——“大型丙烯腈裝置污水回用處理成套技術(shù)開發(fā)”和“安全降耗密相輸送工程技術(shù)開發(fā)”，以及與湖北化肥、江蘇中圣共同承擔(dān)的中國(guó)石化科技開發(fā)項(xiàng)目——“大型偶聯(lián)反應(yīng)器工程技術(shù)開發(fā)及國(guó)產(chǎn)化研制”3個(gè)項(xiàng)目通過中國(guó)石化集團(tuán)公司組織的技術(shù)鑒定。3個(gè)項(xiàng)目共獲得授權(quán)專利14項(xiàng)，具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)，整體技術(shù)均達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平。

（魏永忠）

Analysis of Use of Microbial Identification in Pollution Investigation

Bao Fangming, Shen Haiying
（Suzhou Institute of Food and Medicine Inspection Suzhou, 215004）

Through analysis of biochemical level, gene sequencing and mass spectrum identification system, the cons and pros of different microbial identification systems were compared, and their applications in contamination investigation were discussed.It is unnecessary to select gene sequencing method for the microbial which cannot be identified with biochemical level and mass spectrum identification system, but identification data and disinfection test may be used for cleaning contamination.

microbial identification; contamination investigation

TQ 460.38

：A

：2095-817X（2015）04-0060-003

2015-03-03

鮑方名（1982—），男，主管藥師，主要從事藥品微生物檢測(cè)及凈化工程檢測(cè)。