低氧培養(yǎng)對間充質(zhì)干細胞生存與生長的影響*

張　君，汪保和

（1.湖南科技職業(yè)學(xué)院，湖南長沙410004；2.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖南長沙410081）

低氧培養(yǎng)對間充質(zhì)干細胞生存與生長的影響*

張君1，汪保和2*

（1.湖南科技職業(yè)學(xué)院，湖南長沙410004；2.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖南長沙410081）

低氧培養(yǎng)能影響間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）細胞活力、增殖能力、衰老、死亡等生存和生長相關(guān)特性，其分子機制復(fù)雜多重，涉及能量代謝途徑、低氧誘導(dǎo)因子（HIFs）信號通路以及諸多其他信號通路、調(diào)控和轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。目前受限于MSCs來源、分離純化方法、篩選標(biāo)記以及低氧體系構(gòu)建方法等因素，低氧培養(yǎng)對MSCs的影響結(jié)果還無法做統(tǒng)一性的概括。綜述現(xiàn)有研究結(jié)果，為今后最佳MSCs培養(yǎng)體系構(gòu)建，以及MSCs的臨床應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。

低氧；間充質(zhì)干細胞；生存；增殖

doi:10.3969/j.issn.1007-7146.2015.04.002

氧是細胞生物學(xué)行為和生理功能的重要調(diào)節(jié)因子，也是干細胞壁龕（Stem cell niche）中必要環(huán)境因素之一?，F(xiàn)認為人組織間液的氧濃度約為2%-9%，就干細胞壁龕而言，可能更低［1］。適宜的氧濃度已被看成是維持若干種類的干細胞和祖細胞特有功能的必要因素［1］。近年來間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）作為細胞治療和再生醫(yī)學(xué)的理想工具已成為研究熱點。已有研究結(jié)果顯示，體外低氧培養(yǎng)對MSCs生存、生長、分化、遷移等多方面生物學(xué)特性產(chǎn)生影響。然而這些研究結(jié)果存在矛盾，目前還不能明確低氧對MSCs這些特性的影響是有利還是有害。本文旨在總結(jié)現(xiàn)階段關(guān)于低氧對MSCs體外培養(yǎng)時生存與生長兩方面的影響，以及相關(guān)信號通路和分子機制的研究進展。

1　低氧培養(yǎng)對MSCs生存的影響

多種來源的MSCs在不同低氧濃度條件下培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)其基因組完整性、衰老、死亡等細胞生存相關(guān)指標(biāo)受到影響。大氣氧濃度下體外培養(yǎng)過程中，MSCs出現(xiàn)非整倍體染色體和DNA斷裂、損傷等現(xiàn)象［2，3］。Estrada等發(fā)現(xiàn)在低氧下培養(yǎng)會減少這種情況［2］，而Tarte等則認為此現(xiàn)象跟細胞供體有關(guān)，與培養(yǎng)條件不相關(guān)［3］。健康成人骨松質(zhì)來源、人臍帶來源、綿羊骨髓來源MSCs其低氧組與常氧組比衰老細胞量較少［4-6］。Dos Santos F等觀察到人骨髓MSCs從P3代開始，2%低氧使其端粒變短，盡管此現(xiàn)象與衰老有關(guān)，但同時卻伴隨高增殖［7］。另外，也有關(guān)于低氧對某些人源（人骨髓和健康成人骨松質(zhì)來源）的MSCs細胞活力和死亡率沒影響的報道［4，8，9］。值得注意的是Deschepper等在極端低氧（pO2＜1.5 mm-Hg相當(dāng)于0.1%-0.2%）條件下長時間（12 d）培養(yǎng)羊MSCs時觀察到:即使培養(yǎng)過程中不換液，但保證葡萄糖供應(yīng)，MSCs仍能保持細胞活力和增殖能力；若不補給葡萄糖，第六天開始細胞活力下降，因此認為缺血導(dǎo)致細胞死亡，而非單純?nèi)毖跻蛩兀?0］。

為探索MSCs對低氧的早期反應(yīng)，部分研究者針對體外短時程（少于72 h）低氧對MSCs生存狀態(tài)的影響開展了相關(guān)研究。Chacko和Peterson兩個研究小組均發(fā)現(xiàn)大鼠MSCs分別于0.5%和1%氧濃度下短時程培養(yǎng)后，細胞凋亡率增高，但卻有利于MSCs移植后存活［11，12］。Chang等報道大鼠MSC 24 h極度低氧體積分數(shù)下（0%）引起細胞死亡（凋亡+壞死）率達70%［13］。而Efimenko等發(fā)現(xiàn)48 h低氧沒有引起小鼠脂肪來源的間充質(zhì)干細胞（ADSC）凋亡和活力的變化，也沒有影響端粒長度［14］。Lavrentieva等更是認為人臍帶MSCs在1.5%O2條件下，細胞凋亡率僅輕微提高，而細胞損傷和壞死顯著下降［15］。

綜上，現(xiàn)有研究結(jié)果趨向于認為體外低氧或生理氧培養(yǎng)有益于MSCs生存，能保持其細胞基因組完整性、延緩MSCs衰老、維持或促進其活力、對細胞死亡率影響不大。但短時程低氧對MSCs影響的相關(guān)研究結(jié)果存在矛盾，似乎MSCs短時間內(nèi)需在促凋亡/抗凋亡之間作出選擇。

2　低氧培養(yǎng)對MSCs生長的影響

近年來有一批研究者嘗試用近似生理氧濃度替換傳統(tǒng)體外細胞培養(yǎng)時采用的大氣氧濃度來培養(yǎng)不同來源的MSCs。目前來看，雖然低氧培養(yǎng)MSCs有利于其生長的報道居多，但也不乏低氧對MSCs生長抑制或影響不定的研究報道。

綿羊骨髓來源和大鼠骨髓來源的MSCs在5%的氧體積分數(shù)條件下培養(yǎng)能促進其體外增殖，其集落形成能力顯著提高［6，10，16］。2%-3%氧體積分數(shù)下的分別培養(yǎng)小鼠骨髓和脂肪組織來源的MSCs時也有類似結(jié)果［17-20］。在人源MSCs研究方面，因骨髓中MSCs含量最為豐富，且取材方便等優(yōu)勢，目前關(guān)于人骨髓來源MSCs研究報道最多。這些研究于1%、2%、3%、5%氧體積分數(shù)下培養(yǎng)了hBM-MSCs，發(fā)現(xiàn)低氧能促增殖，促進集落形成［7-9，21-25］。低氧同樣能促進人臍帶、胎盤、脂肪組織以及健康人骨髓穿刺液來源的MSCs增殖［5，26-31］。對比慢性淋巴性白血病患者骨髓MSCs在周圍大氣環(huán)境氧濃度下和生理氧濃度（5%）下培養(yǎng)情況，發(fā)現(xiàn)5%氧體積分數(shù)下培養(yǎng)時恢復(fù)和生長較快［32］。

但是數(shù)個低氧下培養(yǎng)MSCs研究實驗，其結(jié)果與上述描述的主流結(jié)果不一致。Zhang等將大鼠MSCs低氧下培養(yǎng)7 d后卻發(fā)現(xiàn)其活力下降［33］。Anokhina等報道當(dāng)培養(yǎng)基中氧含量顯著減少時（培養(yǎng)氣相環(huán)境中的O2濃度為0%），大鼠骨髓MSCs培養(yǎng)數(shù)天后，細胞的形態(tài)無明顯變化，同樣維持活力和增殖能力，無氧條件下的繼續(xù)培養(yǎng)會導(dǎo)致凋亡激活和進行性壞死［34］。人源MSCs方面:Wang等認為人皮下脂肪來源的MSC在5%低氧環(huán)境中增殖受阻［35］；Holzwarth等研究發(fā)現(xiàn)1%氧濃度下hMSCs沒有常氧組生長快，細胞聚集在G1期［36］；Hung等將人骨髓來源MSC在1%氧體積分數(shù)下培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)增殖受阻，集落形成能力也降低，低氧后再常氧培養(yǎng)，能修復(fù)低氧對增殖的負影響，常氧第3天增殖速率與常氧組趨于一致［23］。另外，Karlsen等采用三維支架培養(yǎng)，當(dāng)氧體積分數(shù)變至6%和二氧化碳濃度變至7.5%時，MSCs增殖結(jié)果無影響，因此認為室內(nèi)空氣的高氧濃度對MSCs的增殖無損害作用［37］。

還有些研究者認為低氧培養(yǎng)對MSCs生長狀態(tài)的影響會因為細胞供體不同或細胞代數(shù)不同而異。比如，Adesida及其同事于3%氧氣濃度條件下培養(yǎng)hBM-MSCs，其集落生成數(shù)均高于常氧條件，隨供體不同高出8%到38%不等［21］。Efimenko等分析48 h低氧后小鼠脂肪來源的間充質(zhì)干細胞（ADSC）的生長狀況因小鼠年齡而異:常氧下低齡小鼠ADSC生長比老齡快，但是低氧下，低齡ADSC會生長變緩，老齡的生長速率未降低［14］。Basciano等則認為5%氧體積分數(shù)對不同代數(shù)的hBM-MSCs的生長影響不一，原代細胞生長受低氧抑制，細胞數(shù)量明顯降低；P1代改善，P2代之后MSCs在低氧中生長比在常氧中好。相應(yīng)的，原代克隆數(shù)量和平均克隆大小都明顯小于其在常氧中；P1低氧與常氧集落情況差異沒有原代顯著，到了P2 CFU-F數(shù)量提高［38］。Grayson等也有類似報道［22］。而Dos Santos等研究2%O2下hBMMSCs會較早進入細胞周期，早期呈指數(shù)生長，其延滯期較短，之后生長速率雖然放緩，但數(shù)量顯著超過常氧組；低氧組P4-6代中大部分細胞活力很強，克隆形成能力也較強［7］；同時MSCs低氧下分裂開始較早［7］；Grayson則認為低氧組和常氧組分裂開始時間無明顯差異［22］，這可能跟Dos Santos使用P3-4代細胞，Grayson則用P2-7代細胞，或者其他的實驗體系、條件不一致有關(guān)。

因此，目前還缺乏足夠的證據(jù)來支持“低氧培養(yǎng)促進MSCs的生長”這一觀點。這些矛盾結(jié)果，可能是由于MSCs來源、細胞代數(shù)、低氧體積分數(shù)、低氧時間、低氧體系構(gòu)建手段等原因造成的。

3　低氧培養(yǎng)對MSCs生存與生長相關(guān)代謝途徑和分子的影響

氧氣影響細胞生理學(xué)特性的機制是復(fù)雜的，多重的，其可通過參與代謝反應(yīng)以及修飾其他因子來直接或間接地影響細胞命運。

3.1能量代謝

在內(nèi)部和外部綜合因素的影響下，細胞會在以無氧糖酵解供能為主還是線粒體呼吸供能為主之間做出選擇。如，當(dāng)胚胎干細胞處于未分化狀態(tài)時以糖酵解途徑為主，而有氧代謝途徑激活對其能成功分化很關(guān)鍵；腫瘤細胞即使在有氧的情況下，其快速增殖過程也會傾向選擇糖酵解途徑（瓦博格效應(yīng)，Warburg effect）［39］。目前關(guān)于幾種產(chǎn)生ATP的代謝途徑對MSCs特性和功能的重要性還知之甚少。低氧環(huán)境有可能激活MSCs糖酵解，從而有利于其生長和基因組穩(wěn)定，相對地常氧下的MSCs可能會在氧化應(yīng)激過程中生理失調(diào)［2］。

低氧微環(huán)境往往意味著MSCs的線粒體活力降低。短時程低氧（或低氧早期）能顯著降低線粒體跨膜電位［33，40，41］，引起細胞色素C釋放［33，41］，ATP水平下降［10，13］，糖酵解提高，葡萄糖消耗量增加，乳酸產(chǎn)量增加［10，15］。相應(yīng)地，無氧酵解相關(guān)基因GLUT-1、LDH和PDK1表達增加［15］。而長時程（72 h以上）低氧研究發(fā)現(xiàn)MSCs能量代謝也如同低氧早期反應(yīng)。Dos Santos等分析長期低氧下MSCs的代謝活動發(fā)現(xiàn)，營養(yǎng)物質(zhì)（葡萄糖、谷氨酰胺）消耗量增加，乳酸產(chǎn)量增加；但代謝阻礙物不多，一周內(nèi)（指數(shù)生長期）葡萄糖消耗大；Ylac/glu在低氧中較低，說明其代謝途徑不是以線粒體氧化磷酸化為主，而以糖酵解為主［7］。Grayson的研究小組和Buravkova等均有類似發(fā)現(xiàn)［22，26］。

3.2缺氧誘導(dǎo)因子（HIFs）

就低氧環(huán)境而言，最為關(guān)鍵的低氧適應(yīng)的調(diào)控因子是HIFs（尤其是HIF-1）［39］。HIF-1是由一個120 kD的α亞單位和一個91-94 kD的β亞單位構(gòu)成的異二聚體。其中HIF-1β不受低氧誘導(dǎo)，為組成性表達；α亞單位受氧濃度調(diào)控，常氧下（21%O2）也有表達，但很快即被細胞內(nèi)氧依賴性泛素蛋白酶降解途徑所降解，只有在缺氧條件下HIF-1α才可穩(wěn)定表達，轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，并與HIF-1β結(jié)合組成異二聚體。HIF-1與目標(biāo)基因的低氧應(yīng)答元件（HRE）結(jié)合，在諸如CBP/p300的輔助下，調(diào)控與代謝、生長、分化等相關(guān)的70多個基因的轉(zhuǎn)錄，維持細胞在缺氧環(huán)境的內(nèi)部穩(wěn)態(tài)［39］。

有研究者甚至將引起HIF-1α表達上調(diào)的條件稱為真低氧狀態(tài)［37］。MSCs經(jīng)低氧誘導(dǎo)，能快速上調(diào)HIF-1α［5，29］，HIF-1能迅速轉(zhuǎn)移至核內(nèi)。分別于低氧1 h、6-12 h、24 h和72 h后在核內(nèi)檢測到HIF-1［10-12，15，42-44］。然而Berniakovich I和Giorgio M認為3%氧體積分數(shù)不足以誘導(dǎo)出可檢測的HIF-1α量，但HIF-1α下游基因—Vegfr1表達提高［17］。

HIF-2分布不及HIF-l廣泛，局限于某些細胞類型中，對HIF-1的功能有補充作用?，F(xiàn)認為HIF-1可能與急性低氧反應(yīng)有關(guān)，而HIF-2則可能參與長期慢性的低氧適應(yīng)［39］。數(shù)個關(guān)于較長期低氧對MSCs影響的實驗結(jié)果顯示:顯著上調(diào)的是HIF-2α而不是HIF-1α［20-22，45］。HIF-2α能激活Oct-4的表達，其與干細胞增殖相關(guān)。Grayson等發(fā)現(xiàn)低氧能提高Oct-4水平［22］，但Valorani等則認為低氧能上調(diào)MSC的HIF-2α水平，但未檢測到Oct-4，而一些其他的干性基因下調(diào)，如Nanog，Sox2［20］。Grayson等低氧培養(yǎng)人源BM-MSCs時，Oct-4表達提高是從第3 d到7 d［22］，相反結(jié)果出現(xiàn)在低氧（8%）培養(yǎng)6天的鼠源的BM-MSCs中［46］。可能細胞種類和培養(yǎng)時間不同能解釋這一矛盾。

3.3活性氧簇（Reactive oxygen species，ROS）

ROS水平能影響一些細胞凋亡和增殖相關(guān)激酶的表達，如ERK1/2、Akt、p38 MAPK、SAPK/JNK等。理論上，低氧使HIF-1α穩(wěn)定，從而使GLUT、LDH和PDK表達提高，線粒體呼吸抑制，無氧酵解提高，進而ROS下降。然而，一些短時程低氧影響的研究顯示:ROS實際升高。Guzy和Schumacker分析低氧作為一個刺激因素，使得MSCs產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，ROS升高源自線粒體呼吸鏈復(fù)合體III［47］；Peterson等認為ROS水平提高可能源于氧化應(yīng)激酶NAD（P）H氧化酶在低氧環(huán)境下表達提高，也可能與抗氧化酶-過氧化氫酶（主要代謝ROS的酶）的表達降低有關(guān)。而同時超氧化物歧化酶（SOD）水平和其亞基在低氧環(huán)境均沒有變化，導(dǎo)致細胞內(nèi)過氧化氫聚集，對細胞有負面影響［12］。因此短時程低氧使ROS水平升高，可能說明MSCs在早期氧氣剝奪階段，產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，線粒體功能失調(diào)，導(dǎo)致細胞損傷。

3.4其他相關(guān)通路和因子

一些研究也對低氧早期階段的一些信號分子加以分析:Busletta等發(fā)現(xiàn)24 h 1%低氧即可引起生存素survivin下降，進而導(dǎo)致凋亡增加［48］。但Chacko等在同樣條件下，卻檢測到這種抗凋亡蛋白升高［11］；Bcl-2/Bax比值上升，對細胞凋亡起負調(diào)控作用。Nekanti等的研究發(fā)現(xiàn)六個樣本中有四個低氧培養(yǎng)時，上調(diào)Notch受體和Notch配體Jagged1基因以及Notch下游靶基因HES1（48 h低氧后即發(fā)現(xiàn)上調(diào)）［5］。另一個涉及急性低氧反應(yīng)的因子是NF-κB，低氧下NF-κB提高，進而VEGF、FGF2、HGF和IGF-1表達提高［49］。

絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）級聯(lián)激活是細胞內(nèi)多種信號通路的中心，參與細胞多種生理過程調(diào)節(jié)。目前已就低氧對MAPKs幾個亞家族中的多個關(guān)鍵的信號傳遞分子的影響進行研究，所得結(jié)果不統(tǒng)一:Lee等發(fā)現(xiàn)p38 MAPK上調(diào)［44］，而Peterson等則認為下調(diào)［12］；有研究顯示低氧能誘導(dǎo)c-Jun氨基末端激酶（SAPK/JNK）［44，48］，但也有發(fā)現(xiàn)低氧阻止此酶表達［13，33］；低氧還使磷酸化/去磷酸化ERK 1-2（細胞外信號調(diào)節(jié)的蛋白激酶）下降［12，50］。

低氧能使MSCs中pAkt/Akt（Akt蛋白充分活化后，能參與介導(dǎo)細胞生長增殖）溫和上升［11，12］；PI3K/PTEN比值上升［12］；de Meester C及其研究小組發(fā)現(xiàn)MSCs與心肌細胞不同，即使在單磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）失活情況下，長時間低氧下培養(yǎng)，也不會導(dǎo)致細胞死亡，并認為這種低氧耐受現(xiàn)象可能說明MSCs在低氧下偏好酵解途徑，而不依賴氧供應(yīng)和AMPK信號通路［50］。

Basciano等為解釋低氧情況下MSCs原代生長受阻而至P3代增殖速率顯著提高的現(xiàn)象進行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，GO分析結(jié)果顯示:早期生長受阻是符合預(yù)期的，低氧會下調(diào)與DNA修復(fù)、代謝相關(guān)基因（POLQ，RRM2，XRCC2，F(xiàn)ANCD2）、上調(diào)細胞周期基因（E2F8，MKI67）和染色體組織基因（CENPB，AURKB，KLF4），這些可以解釋為何增殖和克隆形成會降低。并認為生長受阻可維持MSC處于靜息期，抑制線粒體活動，防止細胞凋亡；后期促生長的可能原因是細胞對血清中的生長因子更敏感，因此低氧是否有利增殖，取決于細胞在特定環(huán)境下是否激活增殖通路或表達細胞因子受體和生長因子受體［38］。

4　總結(jié)

現(xiàn)有研究更傾向于認為低氧對間充質(zhì)干細胞生存和生長兩方面都是有益。似乎可以這樣認為:短時間內(nèi)氧氣限制可引起MSCs凋亡，而短時間低氧預(yù)處理或多或少可提高MSCs其移植后存活率；隨著低氧時間延長，MSCs可通過代謝調(diào)節(jié)，激活信號通路，提高適應(yīng)能力，并實現(xiàn)比常氧狀態(tài)更好的增殖能力。然而，這種結(jié)論還缺乏足夠的證據(jù)。

MSCs沒有所謂標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)規(guī)程，各個實驗室應(yīng)用的分離純化方法、篩選標(biāo)記、培養(yǎng)基、輔助因子、氧體積分數(shù)、換液頻次等等都不相同。各實驗室構(gòu)建低氧體系的方法也不盡相同，大多研究對于期間觀察、換液、傳代等必要的細胞學(xué)實驗步驟，是否間斷低氧，時間有多長等技術(shù)問題沒有詳盡報道。同時，各研究采用的MSCs來源不一，即使來源一致，MSCs本身并不具有均一性，其中不同類型細胞對氧氣敏感度可能不一樣，這也許是造成結(jié)果不一致的最為關(guān)鍵的原因。

雖然這些研究結(jié)果缺乏一致性，但可以明確的是低氧培養(yǎng)對MSCs的生存、生長等生物學(xué)作用及其在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用極為重要。間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)與擴增最佳氧體積分數(shù)以及低氧在各時間段影響MSCs的機制等諸多問題急需進一步探索。

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Effects of Hypoxia on Survival and Growth of Mesenchymal Stem Cells

ZHANG Jun1，WANG Baohe2*
（1.Hunan Vocational College of Science and Technology，Changsha 410004，Hunan，China；2.College of Life Sciences，Hunan Normal University，Changsha 410081，Hunan，China）

Cultruing mesenchymal stem cells（MSCs）under hypoxia condition could influence their characteristics of survival and growth，such as vitality，proliferation，senesce，dealth，and so on.The mechanism of MSCs resistance/ sensitivity to hypoxia impact is complex and multiple.It involves in energy metabolism，HIFs signal pathway and others signal pathways and kinds of molecules of regulation or transduction.Because of the difference of MSCs source，the methods of isolation，the cell surface markers，the way of establishing hypoxia environment and others methodological factors.It seems that the currently available experimental data on hypoxia impact to MSCs are so contradictory.It is necessary to summarize recent researches on the survival and the growth of MSCs under low oxygen conditions in order to lay the foundation for establishing the best culture system of MSCs in future and the research of the clinical application of MSCs.

Hypoxia；MSCs；survival；proliferation

Q955

A

1007-7146（2015）04-0314-05

2014-10-14；

2015-01-08

湖南科技職業(yè)學(xué)院科研一般項目資助（KJ13203）

張君（1976-），女，湖南長沙人，講師，碩士，主要從事干細胞調(diào)控研究。（電話）18774996690；（電子信箱）498766488@qq.com

汪保和（1954-），男，湖南岳陽人，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事干細胞生物學(xué)方面研究。（電話）0731-88615806；（電子信箱）baohewang@126.com