血必凈注射液對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用

王彥博 趙艷琴 丁硯蘭 王 強(qiáng)

(1. 解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院全軍創(chuàng)傷修復(fù)與組織再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨皮膚損傷修復(fù)與組織再生北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048; 2.武警北京總隊(duì)醫(yī)院， 北京 100027； 3.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心， 北京 102206)

Key words Systemic lupus erythematosus Xuebijing injection T lymphocyte Cytokine

·論 著·

血必凈注射液對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用

王彥博1趙艷琴2丁硯蘭2王 強(qiáng)3

(1. 解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院全軍創(chuàng)傷修復(fù)與組織再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨皮膚損傷修復(fù)與組織再生北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048; 2.武警北京總隊(duì)醫(yī)院， 北京 100027； 3.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心， 北京 102206)

目的：探討血必凈注射液對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)小鼠T淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用。方法：以清潔級(jí)EB病毒膜抗原BLLF1基因轉(zhuǎn)基因小鼠30只為SLE模型小鼠，隨機(jī)分為模型組(8周齡和10周齡各5只)、8周齡治療組(10只)和10周齡治療組(10只)。兩治療組給予血必凈注射液6.4 ml/kg腹腔內(nèi)注射，每日1次，連續(xù)14 d。治療14 d后處死，分離脾臟，提取DC和T淋巴細(xì)胞，熒光定量PCR和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)T細(xì)胞孵育上清和脾組織勻漿液IL-2和TNF-α基因及細(xì)胞因子表達(dá)水平。結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，SLE小鼠IL-4、TNF-α含量顯著升高，而IL-2、 IFN-γ水平明顯降低，脾臟組織及T淋巴細(xì)胞IL-2的基因表達(dá)顯著下降，而TNF-α基因表達(dá)則明顯升高(P<0.05或P<0.01)。給予血必凈注射液治療后，與模型組比較，狼瘡鼠IL-4、TNF-α含量顯著降低，而IL-2、IFN-γ水平明顯升高，IL-2基因表達(dá)顯著升高，TNF-α基因表達(dá)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。兩個(gè)治療組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：血必凈治療能夠?qū)⑵⑴K的Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Th1細(xì)胞，改變Th1 /Th2的比例和機(jī)體的免疫應(yīng)答類型，對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡的免疫功能產(chǎn)生影響。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡 血必凈注射液 T淋巴細(xì)胞 細(xì)胞因子

Key words Systemic lupus erythematosus Xuebijing injection T lymphocyte Cytokine

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種免疫復(fù)合物在各種組織中沉積伴有炎癥性壞死現(xiàn)象的自身免疫性疾病。異常的T淋巴細(xì)胞過(guò)多地產(chǎn)生對(duì)B淋巴細(xì)胞刺激性的細(xì)胞因子，致B淋巴細(xì)胞高度活化，產(chǎn)生大量自身抗體,是SLE的免疫學(xué)特征。研究表明，細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡是SLE發(fā)病機(jī)制中的重要組成部分，T輔助細(xì)胞(Th)是細(xì)胞因子的重要來(lái)源，Thl/Th2平衡在SLE免疫調(diào)控中發(fā)揮重要作用[1]。血必凈注射液以古方血府逐瘀湯為基礎(chǔ)研制而成，主要成分包括赤芍、川芎、丹參、紅花、當(dāng)歸等5味中藥[2]，臨床上主要用于治療膿毒癥。血必凈注射液對(duì)膿毒癥具有免疫調(diào)節(jié)作用，并能維護(hù)機(jī)體的臟器功能。SLE作為一種典型的自身免疫性疾病，T淋巴細(xì)胞和細(xì)胞因子的紊亂貫穿整個(gè)發(fā)病過(guò)程。本研究擬以此為研究切入點(diǎn)，觀察并探討血必凈注射液對(duì)SLE模型動(dòng)物T淋巴細(xì)胞免疫功能的影響及其調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)分組 遠(yuǎn)交系昆明種雌性小鼠10只，體質(zhì)量30～40 g，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。雌性SLE模型鼠30只，體質(zhì)量30～40 g，EB病毒膜抗原BLLF1基因轉(zhuǎn)基因小鼠，購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。小鼠在室溫20～25 ℃、相對(duì)濕度40%～70%、晝夜明暗交替(12 h明/12 h暗)的條件下飼養(yǎng)5 d，隨機(jī)將小鼠平均分為3組(n=10)：模型組(8周齡和10周齡各5只)、8周齡給藥組、10周齡給藥組。兩個(gè)給藥組均每日1次腹腔內(nèi)注射血必凈注射液(天津紅日藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品)6.4 ml/kg，連續(xù)14 d。

1.2 小鼠脾臟樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)的分離與鑒定 于給藥14 d后處死小鼠，無(wú)菌操作，取小鼠脾臟組織，按照文獻(xiàn)[3-4]的實(shí)驗(yàn)方法制備單個(gè)核細(xì)胞懸液，將單個(gè)核細(xì)胞懸液與抗小鼠DC的CD11c+免疫磁珠(德國(guó)Mihenyi Biotec公司)共孵育，用MiniMACS磁化細(xì)胞分選儀(德國(guó)Mihenyi Biotec公司)分離收集DC并進(jìn)行細(xì)胞活性和純度鑒定。

1.3 小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的分離與鑒定 將上述方法獲取的單個(gè)核細(xì)胞懸液于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng) 2 h，利用單個(gè)核細(xì)胞中除T細(xì)胞外其他細(xì)胞大多貼壁生長(zhǎng)的特性，收集未貼壁細(xì)胞，離心后獲得T細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)分離細(xì)胞的活性大于97%。10%FCS-RPMI 1640完全培養(yǎng)基重懸脾T淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×106/ml。

1.4 RT-PCR試驗(yàn) 將預(yù)先獲得的小鼠脾臟組織和T淋巴細(xì)胞放置在冰浴盒中，整個(gè)操作過(guò)程在冰浴中進(jìn)行，采用RT-PCR試劑盒(美國(guó)Promega公司和北京賽百盛生物工程技術(shù)公司)。小鼠TNF-α：擴(kuò)增片段123 bp，正義鏈5’- TCTCGAACCCCGAGTGACAA-3’，反義鏈5’-ACCGCACCTCGACTCTC TAT-3’；小鼠IL-2： 擴(kuò)增片段256 bp，正義鏈5’-ACTCACCAGGATGCTCACAT-3’，反義鏈5’-AGACTTGTCTACCTAATGGA-3’。

1.4.1 RNA提取及cDNA合成 所用實(shí)驗(yàn)樣品均采用異硫氰酸胍一步提取法，預(yù)先進(jìn)行去RNAase處理。按照說(shuō)明書(shū)從脾臟組織和T淋巴細(xì)胞中提取RNA，用紫外分光光度儀測(cè)定RNA濃度及純度，然后采用逆轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

1.4.2 熒光定量PCR 在PCR產(chǎn)物與上樣緩沖液的混合液中，加入瓊脂糖凝膠，放置于電泳槽中，進(jìn)行60 min電泳。紫外燈觀察確定擴(kuò)增片段無(wú)差錯(cuò)和雜帶后進(jìn)行PCR循環(huán)。所用物品均經(jīng)高壓滅菌、去RNA酶處理，采用高溫啟動(dòng)法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR循環(huán)。PCR體系的組成：SYBR Green PCR Master MIX 12.0l，3’ 引物 (5mol/L) 1.0l，5’ 引物 (5mol/L) 1.0l以及逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 (cDNA) 1.0l。加無(wú)菌去離子水將混合液補(bǔ)至20l，混勻并封膜。在7500熒光定量PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems公司產(chǎn)品)上進(jìn)行循環(huán)檢測(cè)后，取相對(duì)定量(RQ)值進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)。

1.5 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子 根據(jù)既往的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[5]，在各組小鼠的DC與T淋巴細(xì)胞以1:100的比例相互作用3 d及5 d時(shí)，T淋巴細(xì)胞增殖活性升高幅度尤為明顯。因此選取DC與T淋巴細(xì)胞以 1:100 的比例作用3 d及5 d時(shí)的共培養(yǎng)上清液，應(yīng)用ELISA試劑盒(上海醫(yī)科賽生物制品有限公司)分別檢測(cè)上清液中IL-2、IL-4、IFN-γ和TNF-α水平，所有步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠DC對(duì)T淋巴細(xì)胞功能性極化(Th1/Th2漂移)的影響 小鼠DC與T淋巴細(xì)胞以1:100的比例相互作用3 d及5 d時(shí)，與正常對(duì)照組比較，SLE模型小鼠的IL-2、IFN-γ含量明顯降低，而IL-4、TNF-α的含量則顯著升高(除共培養(yǎng)5 d時(shí)IL-2和TNF-α兩組間差異無(wú)顯著性外，P<0.05或P<0.01)；并且共培養(yǎng)的時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)細(xì)胞因子生成也有明顯影響，IL-2、IFN-γ含量降低和IL-4、TNF-α水平升高均以第3天最為顯著(P<0.01)。與模型組比較，經(jīng)血必凈注射液治療的8周齡和10周齡給藥組小鼠IL-4、TNF-α含量顯著降低(P<0.05或P<0.01)，而IL-2、IFN-γ的水平明顯升高(P<0.05或P<0.01)，與正常對(duì)照比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩治療組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1和表2。

組別共培養(yǎng)第3天共培養(yǎng)第5天IL-2IFN-γIL-2IFN-γ正常對(duì)照組1898.735±110.657695.843±27.0181369.948±209.440203.452±24.442模型組001077.502±142.801**00499.596±16.463**1052.246±234.3410096.877±28.771*8周齡給藥組01907.556±97.751##0426.137±42.964#1387.968±189.686125.795±45.91910周齡給藥組01914.362±137.616#000480.929±10.242##1370.768±138.109177.691±52.398

注：與正常對(duì)照組比較：*P<0.05,**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01

組別共培養(yǎng)第3天共培養(yǎng)第5天IL-4 TNF-α IL-4 TNF-α 正常對(duì)照組024.754±4.9190117.703±6.676075.101±4.646120.960±12.307模型組175.315±9.776**175.011±7.004**148.715±19.219*155.724±25.5238周齡給藥組054.538±9.542##116.791±4.578##115.091±25.079107.676±24.16610周齡給藥組032.099±5.034##108.327±10.269#085.685±15.769132.809±17.724

注：與正常對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01

2.2 各組小鼠脾組織及T淋巴細(xì)胞IL-2、TNF-α基因表達(dá)的變化 與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠脾組織及T淋巴細(xì)胞IL-2 mRNA的表達(dá)顯著降低(P<0.05或P<0.01)，TNF-α mRNA的表達(dá)則顯著升高(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較，兩給藥組IL-2 mRNA的表達(dá)明顯升高，TNF-α mRNA的表達(dá)則明顯降低(P<0.05或P<0.01)，兩給藥組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說(shuō)明血必凈注射液治療能影響IL-2和TNF-α的基因表達(dá)水平。見(jiàn)表3。

組別脾組織T淋巴細(xì)胞IL-2mRNA TNF-αmRNA IL-2mRNA TNF-αmRNA 正常對(duì)照組模型組8周齡給藥組10周齡給藥組24.28±1.8413.07±1.32**31.62±3.91*##35.10±2.57*##24.28±1.8449.01±2.66**33.95±2.82#30.12±3.13#1.30±0.090.32±0.12*1.73±0.23#*2.10±0.23##*1.30±0.093.37±0.34*2.30±0.16#1.77±0.32#

注：與正常對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01

3 討 論

SLE發(fā)病機(jī)制尚不明確。研究表明SLE患者Thl/Th2失調(diào)并有向Th2漂移的現(xiàn)象。在淋巴細(xì)胞功能異常引起的免疫抑制中，作為免疫系統(tǒng)重要的調(diào)節(jié)細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞可能發(fā)揮著重要的作用[6]。

效應(yīng)性T細(xì)胞的分化方向，是由DC與T淋巴細(xì)胞相互作用的過(guò)程中釋放的細(xì)胞因子決定的。分化成Th1細(xì)胞后，主要誘導(dǎo)Ⅰ型應(yīng)答反應(yīng)，釋放干擾素(IFN)-γ、IL-12和TNF-β，介導(dǎo)細(xì)胞免疫。分化成Th2細(xì)胞后，主要誘導(dǎo)Ⅱ型應(yīng)答反應(yīng)，釋放IL-4和IL-10等細(xì)胞因子，介導(dǎo)體液免疫。

IL-2是一種具有多種生物活性的細(xì)胞因子，是由輔助性T淋巴細(xì)胞分泌的淋巴因子[7]，具有免疫增強(qiáng)作用，能夠使細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞的能力增強(qiáng)[8]，是在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中能夠參與細(xì)胞免疫的一個(gè)非常關(guān)鍵的細(xì)胞因子。它能促使T細(xì)胞活化增殖，使其分化為效應(yīng)T細(xì)胞，還可刺激TNF-α、IFN-γ等細(xì)胞因子的分泌。在T細(xì)胞的活化增殖以及轉(zhuǎn)化的過(guò)程中，IL-2均具有重要的作用。

IFN-γ是細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中的關(guān)鍵成分，其主要活性就是參與免疫調(diào)節(jié)，在體內(nèi)起到雙向調(diào)節(jié)作用。一方面，IFN-γ可激活NK等細(xì)胞，增強(qiáng)抗病毒、抗腫瘤的功能；另一方面，IFN-γ能抑制B細(xì)胞分泌IgE，還能恢復(fù)抑制性T細(xì)胞的功能，減少免疫復(fù)合物的局部沉積。

IL-4主要由活化Th2亞群產(chǎn)生，對(duì)于B細(xì)胞、T細(xì)胞、肥大細(xì)胞、單核細(xì)胞和造血細(xì)胞都有免疫調(diào)節(jié)作用，在Th1和Th2應(yīng)答類型的調(diào)控中可能還具有重要意義，IL-4不僅能促進(jìn)Th細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化，而且還具有促進(jìn)Th細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化的潛能，

TNF-α主要由受刺激的單核細(xì)胞、T細(xì)胞和細(xì)胞分裂素激活的B細(xì)胞分泌，是一種具有多重局部和系統(tǒng)生物活性的細(xì)胞因子[9]，具有免疫調(diào)節(jié)活性、抗腫瘤活性，并參與介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的許多病理生理過(guò)程[10]。

各亞群的Th細(xì)胞因子誘導(dǎo)Th0向各自細(xì)胞亞群分化，同時(shí)還促進(jìn)各自Th細(xì)胞亞群活化，這是Thl/Th2細(xì)胞效應(yīng)的自身促進(jìn)作用。IL-2誘導(dǎo)Th0細(xì)胞向Thl細(xì)胞亞群分化，TNF-α誘導(dǎo)Th0細(xì)胞向Th2細(xì)胞亞群分化。IL-4能抑制Th0 向Th1 分化，促進(jìn)Th0 分化為Th2，與IFN-γ相互作用，改變Th1 /Th2的比例和機(jī)體的免疫應(yīng)答類型。IFN-γ能促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌IL-12，IL-12又能促進(jìn)T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞產(chǎn)生大量的TNF-α、IL-2、IL-6等細(xì)胞因子，二者形成正反饋，強(qiáng)烈誘導(dǎo)Th0 分化為Th1，調(diào)節(jié)著免疫應(yīng)答的強(qiáng)弱和類型,在機(jī)體細(xì)胞免疫中發(fā)揮作用。Thl/Th2細(xì)胞效應(yīng)在生理情況下保持著相對(duì)的平衡，兩型免疫應(yīng)答之間存在著交互負(fù)反饋的調(diào)節(jié)作用，保持正常的穩(wěn)定關(guān)系。

血必凈注射液是在“菌、毒、炎并治”的理論指導(dǎo)下研制而成，主要成分包括赤芍、川芎、丹參、紅花、當(dāng)歸等5味中藥。Wu等[11]發(fā)現(xiàn)川芎嗪可明顯改善大鼠的有效循環(huán)狀況，抑制誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(iNOS)表達(dá)，降低TNF-α水平。Genfa等[12]從42味中草藥中篩選出能對(duì)抗內(nèi)毒素的8種中藥單劑，發(fā)現(xiàn)赤芍與脂質(zhì)A的親和力最強(qiáng)，具有明顯降低血漿TNF-α水平、治療膿毒癥的作用。

本研究通過(guò)SLE小鼠模型觀察了DC對(duì)脾臟T淋巴細(xì)胞免疫功能的影響，以T淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-4、IL-2和IFN-γ、TNF-α為標(biāo)志，定量觀察血必凈治療后T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組動(dòng)物脾臟T淋巴細(xì)胞與DC細(xì)胞共培養(yǎng)后IL-4和TNF-α的水平均明顯升高，而IL-2和IFN-γ則明顯降低(P<0.05或P<0.01)，說(shuō)明在SLE中，T淋巴細(xì)胞向Th2功能群漂移。給予SLE小鼠血必凈治療后，與模型組比較，IL-4和TNF-α含量顯著降低而IL-2和IFN-γ的水平明顯升高(P<0.05或P<0.01)。同時(shí)，與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠脾臟組織及T淋巴細(xì)胞IL-2 mRNA的表達(dá)顯著降低，TNF-α mRNA的表達(dá)則顯著升高(P<0.05或P<0.01)。血必凈治療后， IL-2 mRNA的表達(dá)明顯升高而TNF-α mRNA的表達(dá)則明顯降低(P<0.05或P<0.01)。

上述結(jié)果表明，血必凈注射液治療可抑制育齡早期(8周齡)和育齡晚期(10周齡)SLE小鼠脾T淋巴細(xì)胞向Th2漂移，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞向Th1漂移，改變Th1 /Th2的比例和機(jī)體的免疫應(yīng)答類型，有效改善SLE時(shí)因Th1 /Th2的比例失衡導(dǎo)致的免疫紊亂，為血必凈注射液治療SLE提供了有力的免疫學(xué)證據(jù)。

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Effect of Xuebijing injection (血必凈注射液) on immune function of T lymphocytes in systemic lupus erythematosus in mice

Wang Yanbo*, Zhao Yanqin, Ding Yanlan, Wang Qiang3.*

Key Research Laboratory of Tissue Repair and Regeneration of PLA, and Beijing Key Research Laboratory of Skin Injury, Repair and Regeneration, First Hospital Affiliated to the Chinese PLA General Hospital, Beijing 100048, China

Wang Qiang(E-mail:jason2019@sina.cn) Zhao Yanqin(E-mail:BJWLinda@sina.com.cn)

Objective:To observe the effect of Xuebijing injection (血必凈注射液) on T lymphocyte and its potential mechanisms in systemic lupus erythematosus (SLE).Methods:A widely used mouse model, SLE-prone BLLF1 mice aged 8-10 weeks, was employed. Xuebijing injection in a dose of 6.4 ml/kg was given via the intraperitoneal administration in the Xuebijing treatment group. Spleen sample was divided as following: one part was used to procure DC with MACS microbeads and T cell by using column of nylon wool, and the other part was used to determine gene and protein expressions of various cytokines. Cells were cultured and the contents of cytokines released into supernatants were determined. The mRNA expression was measured by real-time quantitative PCR. All cytokines were determined in supernatant by ELISA kits for mice.Results:In the model control group, the levels of IL-4 and TNF-α were increased significantly, but the levels of IL-2 and IFN-γ were decreased markedly. The gene expressions of IL-2 were also decreased and TNF-α were increased. Xuebijing treatment could significantly down-regulate the release of IL-4, TNF-α and decrease in IL-2, IFN-γ. Conclusions: Treatment with Xuebijing injection might influence the polarization of T cells in animals with SLE and induced Th cells to drift to Th1 cells.

10.3969/j.issn.1672-8521.2015.01.008

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81071545, 81130035)；國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2012CB518102)；創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(SKLKF200902, SKLKF201002)

王強(qiáng)， 副主任醫(yī)師 (E-mail: jason2019@sina.cn) 趙艷琴，副主任護(hù)師(E-mail:BJWJLinda@sina.com.cn)

2015-03-01)