DNA損傷在去分化源性表皮干細(xì)胞安全性評(píng)價(jià)中的作用及相關(guān)機(jī)制的研究

潘 宇 余細(xì)勇 吳漫茵 付小兵 蔡 颯

(1.廣東省人民醫(yī)院，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)研究中心， 廣東 廣州 510080；2.深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部，廣東 深圳 518060；3.解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院全軍創(chuàng)傷修復(fù)與組織再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨皮膚損傷修復(fù)與組織再生北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100048)

·論 著·

DNA損傷在去分化源性表皮干細(xì)胞安全性評(píng)價(jià)中的作用及相關(guān)機(jī)制的研究

潘 宇1余細(xì)勇1吳漫茵2付小兵3蔡 颯2

(1.廣東省人民醫(yī)院，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)研究中心， 廣東 廣州 510080；2.深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部，廣東 深圳 518060；3.解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院全軍創(chuàng)傷修復(fù)與組織再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨皮膚損傷修復(fù)與組織再生北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100048)

目的：從分子、細(xì)胞及在體水平評(píng)估DNA損傷和非DNA損傷因素誘導(dǎo)所得去分化源性表皮干細(xì)胞的安全性，探討DNA損傷及其應(yīng)答分子對(duì)其安全性評(píng)估的意義與機(jī)制。方法：分別采用紫外線(UV)照射和bFGF處理誘導(dǎo)方案誘導(dǎo)表皮細(xì)胞去分化。采用MTT法比較正常培養(yǎng)和血清培養(yǎng)條件下的兩組去分化源性表皮干細(xì)胞的增殖能力；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡情況；Western blotting檢測(cè)各組去分化過(guò)程中DNA損傷應(yīng)答分子γ-H2AX、激活型caspase、p53、p21表達(dá)的變化；在雌性BALB/c裸小鼠右側(cè)腋窩皮下注射人黑色素瘤細(xì)胞及兩種去分化源性表皮干細(xì)胞，同時(shí)設(shè)生理鹽水注射對(duì)照，30 d后取瘤塊稱(chēng)重，評(píng)估兩種去分化源性干細(xì)胞的成瘤性。結(jié)果：①兩種去分化源性表皮干細(xì)胞均表現(xiàn)出較強(qiáng)的增殖能力，UV照射所得干細(xì)胞具有較強(qiáng)的血清耐受性；②UV照射可導(dǎo)致表皮細(xì)胞DNA損傷和細(xì)胞凋亡，影響表皮細(xì)胞中p53和p21水平，而bFGF處理組無(wú)此作用；③兩種去分化源性表皮干細(xì)胞均無(wú)體內(nèi)成瘤性。結(jié)論：去分化過(guò)程中細(xì)胞DNA損傷與否是評(píng)價(jià)去分化源性干細(xì)胞安全性的較敏感的關(guān)鍵指標(biāo)，因此bFGF處理誘導(dǎo)與UV照射所得的表皮干細(xì)胞相比更為安全可靠。

表皮干細(xì)胞 去分化 DNA損傷 安全性評(píng)價(jià)

表皮干細(xì)胞是皮膚及其附屬器發(fā)生及修復(fù)的源泉。通過(guò)誘導(dǎo)表皮細(xì)胞去分化獲得表皮干細(xì)胞對(duì)臨床治療大面積深度燒傷等皮膚損傷的患者具有重要臨床意義[1-4]。目前研究表明，包括表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及汗腺細(xì)胞在內(nèi)的多種皮膚細(xì)胞可在相應(yīng)誘導(dǎo)條件下發(fā)生去分化，從而獲得從表皮干細(xì)胞到誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPSCs)等的具有不同分化潛能的干細(xì)胞類(lèi)型[3-6]。其中，報(bào)道顯示表皮細(xì)胞可被成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)與熱損傷及紫外線(ultraviolet，UV)照射等因素誘導(dǎo)去分化為表皮干細(xì)胞，使已分化的表皮細(xì)胞重新獲得表皮干細(xì)胞表面標(biāo)志物并表現(xiàn)出干細(xì)胞相關(guān)功能[2-3, 5, 7-8]。盡管如此，由于不同因素引發(fā)去分化過(guò)程的機(jī)制及作用差異尚未闡明，因此如何從這些去分化誘導(dǎo)方案中選擇一種可高效安全的獲得表皮干細(xì)胞的方法亦尚無(wú)定論。

隨著近年關(guān)于iPSCs及成體細(xì)胞重編程研究的深入，去分化過(guò)程與腫瘤發(fā)生的密切關(guān)系也日益受到關(guān)注[8]。目前對(duì)于干細(xì)胞致瘤性評(píng)價(jià)方法主要是動(dòng)物致瘤性實(shí)驗(yàn)，此方法成本高、耗時(shí)長(zhǎng)且敏感性受動(dòng)物和細(xì)胞狀態(tài)影響大。本研究通過(guò)比較DNA損傷和非DNA損傷因素誘導(dǎo)的表皮細(xì)胞去分化模型在去分化過(guò)程中細(xì)胞生物學(xué)表現(xiàn)的差異，從DNA損傷及相關(guān)分子的變化機(jī)制等方面進(jìn)行評(píng)價(jià)，與傳統(tǒng)的動(dòng)物致瘤性實(shí)驗(yàn)比較，為去分化源性干細(xì)胞的安全性評(píng)價(jià)，以及為進(jìn)一步尋找決定細(xì)胞進(jìn)入去分化過(guò)程或腫瘤化過(guò)程的關(guān)鍵因素提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 表皮細(xì)胞培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)所用成人包皮來(lái)自外科包皮環(huán)切術(shù)患者，患者均簽署知情同意書(shū)。無(wú)菌工作臺(tái)中將包皮剪成小塊，中性蛋白酶消化24 h。去除真皮層，將保留的表皮層用胰酶消化，篩網(wǎng)濾除組織碎片。將過(guò)濾的細(xì)胞懸液接種至包被Ⅳ型膠原的培養(yǎng)板中，用含2% 角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充液(HKGS)的EpiLife培養(yǎng)基(Cascade Biologics公司)，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)傳代。

1.2 表皮細(xì)胞去分化 采用本課題組已報(bào)道的方法，分別用bFGF和UV照射方案處理表皮細(xì)胞[5]。bFGF組：將培養(yǎng)的表皮細(xì)胞傳代至35 mm2培養(yǎng)皿中，去除培養(yǎng)基，PBS洗3次，細(xì)胞置于43 ℃水浴1 h，用EpiLife培養(yǎng)基洗滌2次，加入bFGF(100 ng/m1)作用24 h，加入表皮細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)14 d。UV組[9]：采用Sigma便攜式UVC燈(波長(zhǎng)254 nm，劑量8 J/m2)照射細(xì)胞10 min，每日1次，連續(xù)照射3 d，之后同前述方法培養(yǎng)細(xì)胞。

1.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況。將去分化誘導(dǎo)后的兩組細(xì)胞按103個(gè)/孔分別接種至96孔板。常規(guī)培養(yǎng)48 h后，去除培養(yǎng)基，每孔加入 20 μl MTT溶液，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育 4～5 h。每孔加入100 μl Formanzan溶解液，培養(yǎng)箱中孵育3 h。使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Model3550，Bio-Rad)在570 nm處測(cè)定吸光度值(A值)。1.4 血清耐受性實(shí)驗(yàn) 將去分化誘導(dǎo)后的兩組細(xì)胞分別接種至96孔板，用含10%胎牛血清(FBS)的EpiLife培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，48 h后進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 具體方法按照Biovision公司(CA, USA)Annexin V/PI雙染試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。大致步驟為：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化為單細(xì)胞懸液，用PBS洗3次；用200 μl的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，室溫孵育10～15 min；加入10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，輕輕混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.6 Western Blotting檢測(cè)DNA損傷標(biāo)志物γ-H2AX、凋亡相關(guān)基因激活型 caspase3及腫瘤相關(guān)或抑癌基因p53、p21的蛋白表達(dá)水平 用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，按Bradford法測(cè)蛋白濃度；將定量后的蛋白標(biāo)本行SDS-PAGE電泳；轉(zhuǎn)膜后孵育抗體，一抗室溫孵育2 h、相應(yīng)的二抗孵育1 h。洗膜后按照試劑說(shuō)明用Santa Cruz Biotechnology公司化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑顯影。所用一抗包括兔抗鼠γ-H2AX (Ser139,CST公司)、鼠抗鼠p53(BD Pharmingen公司)、兔抗鼠p21(Abcam公司)、兔抗鼠激活型 caspase3(Abcam公司)及鼠抗鼠β-actin(Abcam公司)，HRP-羊抗兔及HRP-羊抗鼠等二抗購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司。1.7 動(dòng)物成瘤性實(shí)驗(yàn) 將5周齡雌性BALB/c裸小鼠隨機(jī)分為5組，每組6只，分別為：陰性對(duì)照組、人黑色素瘤細(xì)胞(HMCBs，本室傳代保存)對(duì)照組、表皮細(xì)胞(原代分離培養(yǎng))對(duì)照組、bFGF處理組和UV照射組。各組細(xì)胞分別用生理鹽水以5×106個(gè)/200 μl重懸，在動(dòng)物右側(cè)腋窩行皮下注射，陰性對(duì)照組注射200 μl生理鹽水，觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況，30 d后于接種部位取出腫塊稱(chēng)重。

2 結(jié) 果

注：與表皮細(xì)胞組比較：**P<0.01；與表皮細(xì)胞+血清組比較：ΔP<0.05，ΔΔP<0.01

圖2 不同去分化誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)的表皮干細(xì)胞γ-H2AX和激活型caspase3水平的Western blotting檢測(cè)結(jié)果

圖3 不同去分化誘導(dǎo)方法對(duì)去分化源性表皮干細(xì)胞γ -H2AX(A)和激活型caspase3(B)蛋白表達(dá)水平的影響

注：與未處理組比較：*P<0.05

2.1 兩種方案誘導(dǎo)去分化所得表皮干細(xì)胞增殖能力及血清耐受性的差異 bFGF組和UV組所得的去分化細(xì)胞均表現(xiàn)出較強(qiáng)細(xì)胞增殖能力。根據(jù)表皮干細(xì)胞不能耐受血清、而腫瘤細(xì)胞適應(yīng)血清環(huán)境的特點(diǎn)，我們同時(shí)檢測(cè)不同去分化源性細(xì)胞對(duì)于血清的耐受性差異，結(jié)果顯示UV組血清耐受性更強(qiáng)。見(jiàn)圖1。2.2 兩種誘導(dǎo)方案對(duì)細(xì)胞DNA損傷及細(xì)胞凋亡的影響 Western blotting結(jié)果顯示，bFGF誘導(dǎo)去分化并不導(dǎo)致DNA損傷標(biāo)志物γ-H2AX水平升高，即無(wú)DNA損傷作用，通過(guò)檢測(cè)Annexin V/PI雙染細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞中激活型caspase3水平顯示無(wú)明顯細(xì)胞凋亡表現(xiàn)；而UV照射方案則會(huì)引起γ-H2AX升高和細(xì)胞凋亡，其水平在照射后3 d逐漸下降。見(jiàn)圖2～5。2.3 DNA損傷應(yīng)答通路在不同方式誘導(dǎo)去分化過(guò)程中的作用差異 對(duì)兩種方法誘導(dǎo)的表皮干細(xì)胞中p53和p21表達(dá)水平的測(cè)定結(jié)果顯示，bFGF處理對(duì)這兩種蛋白水平無(wú)顯著影響，說(shuō)明bFGF誘導(dǎo)細(xì)胞去分化過(guò)程與p53和p21水平無(wú)關(guān)。而UV照射可增強(qiáng)細(xì)胞中p53和p21表達(dá)水平，這與前述細(xì)胞DNA損傷及凋亡結(jié)果相符，證實(shí)UV照射誘導(dǎo)的DNA損傷是通過(guò)p53/p21這條通路誘導(dǎo)凋亡，從而修復(fù)或清除DNA損傷的細(xì)胞。見(jiàn)圖6和圖7。2.4 動(dòng)物成瘤性實(shí)驗(yàn) 接種細(xì)胞后第10天，HMCBs組已出現(xiàn)明顯瘤塊，第30天時(shí)瘤塊重(1.796 ± 0.636)g；而其他各組始終未出現(xiàn)瘤塊。

3 討 論

去分化，即逆行性分化，是指終末分化的成體細(xì)胞在誘導(dǎo)因素作用下發(fā)生細(xì)胞重編程而重新獲得增殖及分化潛能等祖細(xì)胞或干細(xì)胞特性的過(guò)程。自從2007年日本科學(xué)家通過(guò)誘導(dǎo)皮膚成纖維細(xì)胞重編程獲得具有胚胎干細(xì)胞特性的iPSCs以來(lái)，因其在干細(xì)胞治療、疾病模型建立、組織器官重建等應(yīng)用領(lǐng)域的重大意義，成體細(xì)胞去分化及其相關(guān)細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制的研究引起空前關(guān)注。本課題組成員曾經(jīng)通過(guò)UV照射、生長(zhǎng)因子、胚胎提取液誘導(dǎo)等方式成功建立多個(gè)表皮細(xì)胞去分化的誘導(dǎo)模型。然而，用于誘導(dǎo)重編程獲得iPSCs的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Oct4、Sox2、Myc、Klf4)及促發(fā)因素多與腫瘤發(fā)生有密切關(guān)系[10]。去分化與腫瘤發(fā)生在分子機(jī)制上的相似性也引發(fā)人們對(duì)去分化源性細(xì)胞安全性的憂慮。

圖4 不同去分化誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)的去分化源性表皮干細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果

注：與未處理組比較：*P<0.05

圖6 不同去分化誘導(dǎo)方法對(duì)去分化源性表皮干細(xì)胞p53和p21表達(dá)影響的Western blotting檢測(cè)結(jié)果

注：與未處理組比較：*P<0.05

本研究中，bFGF處理和UV照射誘導(dǎo)的去分化源性表皮干細(xì)胞均有較強(qiáng)的增殖能力。同時(shí)，利用表皮干細(xì)胞無(wú)法耐受動(dòng)物血清培養(yǎng)環(huán)境的特性，我們進(jìn)一步比較了兩種去分化來(lái)源細(xì)胞對(duì)動(dòng)物血清的耐受性，雖然結(jié)果顯示兩種去分化來(lái)源的表皮干細(xì)胞均不能耐受動(dòng)物血清培養(yǎng)環(huán)境，但相比之下UV照射誘導(dǎo)所獲得的表皮干細(xì)胞對(duì)血清的耐受性要強(qiáng)于bFGF誘導(dǎo)的細(xì)胞，提示UV照射在促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖的同時(shí)，還使細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化從而獲得能在含血清培養(yǎng)基中持續(xù)生存的能力，說(shuō)明其可能具有發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的潛能。

UV照射和bFGF處理的最大差異在于前者可引起細(xì)胞DNA損傷，而DNA損傷的累積是腫瘤發(fā)生的主要原因。因此我們認(rèn)為DNA是否發(fā)生損傷是決定細(xì)胞去分化過(guò)程中是否發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的主要因素，也是決定表皮細(xì)胞去分化過(guò)程是否穩(wěn)定安全的關(guān)鍵，可作為去分化源性表皮干細(xì)胞安全性評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)[10]。H2AX是組蛋白H2A家族成員，可應(yīng)答于UV等誘導(dǎo)的DNA損傷而發(fā)生Ser139位點(diǎn)磷酸化，即γ-H2AX。γ-H2AX 可迅速聚集于細(xì)胞核DNA損傷部位，且其磷酸化水平可反應(yīng)DNA損傷程度。本研究中，UV照射可引起γ-H2AX水平的增加，表明細(xì)胞出現(xiàn)DNA損傷并引發(fā)細(xì)胞凋亡，而bFGF誘導(dǎo)的表皮干細(xì)胞γ-H2AX水平?jīng)]有明顯變化，說(shuō)明bFGF誘導(dǎo)對(duì)DNA穩(wěn)定性不產(chǎn)生影響，是較為安全的誘導(dǎo)方式。DNA損傷與細(xì)胞耐受性評(píng)價(jià)結(jié)果均提示bFGF誘導(dǎo)方案是更為安全的誘導(dǎo)方式。

p53和p21信號(hào)通路是細(xì)胞應(yīng)答DNA損傷的主要調(diào)控機(jī)制，可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡和衰老等方式清除損傷細(xì)胞，從而保證DNA穩(wěn)定性以防止細(xì)胞惡變的發(fā)生[9,11-13]。因此，癌前細(xì)胞在最終完成惡性轉(zhuǎn)化前，往往要選擇性地誘導(dǎo)p53通路等DNA損傷應(yīng)答機(jī)制失調(diào)。此外，多個(gè)研究表明p53具有促進(jìn)干細(xì)胞分化和抑制細(xì)胞去分化的作用[10, 14-15]。本研究中，盡管bFGF處理組中有通過(guò)熱損傷刺激細(xì)胞的步驟，但細(xì)胞中p53和p21水平始終未發(fā)生變化；而UV照射可顯著增加p53及p21水平，直至UV照射撤除之后第3天其水平才顯著下降。以上結(jié)果提示在損傷因素撤除后，細(xì)胞才能發(fā)生去分化，這種損傷因素的刺激對(duì)于去分化的發(fā)生具有重要作用。DNA損傷因素刺激導(dǎo)致細(xì)胞中p53相關(guān)因子的活化對(duì)去分化過(guò)程中細(xì)胞DNA穩(wěn)定性提供了保障。

動(dòng)物成瘤性實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)干細(xì)胞安全性及腫瘤細(xì)胞成瘤能力的常用方法。但細(xì)胞成瘤性受動(dòng)物及細(xì)胞狀態(tài)影響較大，即便是腫瘤組織中分出的原代惡性細(xì)胞懸液也往往表現(xiàn)不出成瘤性，也就是說(shuō)成瘤性并不能完全反應(yīng)惡性潛能。雖然本研究中去分化源性表皮干細(xì)胞的動(dòng)物成瘤性實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性，但由于UV照射誘導(dǎo)過(guò)程中出現(xiàn)了DNA損傷、p53及p21等腫瘤相關(guān)基因的變化，所以成瘤性實(shí)驗(yàn)的陰性結(jié)果也并不能敏感的排除惡性潛能細(xì)胞的存在。

總之，本研究采用DNA損傷和非DNA損傷因素誘導(dǎo)表皮細(xì)胞去分化模型，從分子、細(xì)胞及在體三個(gè)層次對(duì)不同來(lái)源的去分化源性干細(xì)胞進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)。結(jié)果提示，與成瘤性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相比，DNA損傷及相關(guān)應(yīng)答分子的變化可更為敏感地反應(yīng)誘導(dǎo)所得干細(xì)胞的安全性。通過(guò)比較bFGF處理和UV照射兩種方案誘導(dǎo)所得干細(xì)胞的穩(wěn)定性，bFGF處理方案顯得更為可靠。

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Safety evaluation of dedifferentiation-derived epidermal stem cells after damage to DNA and investigation of related molecular mechanisms

Pan Yu*, Yu Xiyong, Wu Manyin, Fu Xiaobing, Cai Sa.*

Medical Research Center of Guangdong General Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences, Guangzhou 510080, Guangdong, China

Cai Sa(E-mail:cai_sa@sina.com)

Objective:To evaluate the safety of the dedifferentiation-derived epidermal stem cells generated either by damage to DNA or non-DNA-damage with protocols of molecular, cellular andinvivostudy, and to investigate the mechanisms of DNA-damage responsers in the process of epidermal cells dedifferentiation.Methods:Two types of dedifferentiation-derived epidermal stem cell were generated individually using the ultraviolet (UV) radiation or basic fibroblast growth factor (bFGF) treatment protocol. The proliferation ability and serum tolerance of different dedifferentiation-derived epidermal stem cells were compared by MTT assay. Apoptosis of dedifferentiated cells was detected by flow cytometry. The changes in occurrence of DNA damage and related molecular elements (phospho-histone γ-H2AX，cleaved caspase, p53, p21) were detected by Western blotting. Different epidermal stem cells, human melanoma cells, or normal saline were injected subcutaneously into right armpits of female nude mice, and their tumorigenic potential was assessed.Results:①The proliferation of dedifferentiation-derived epidermal stem cells were increased in either UV radiation or bFGF-treated group, while cells from UV radiation group appeared to be more tolerant to serum than those from bFGF-treated group.② UV radiation, but not bFGF treatment, caused DNA damage and apoptosis in epidermal cells and the levels of p53 and p21 were increased. ③ No tumor formation was found in dedifferentiation-derived epidermal stem cells of UV radiation nor bFGF-treated group.Conclusions:The occurrence of DNA damage in the process of dedifferentiation is sensitive and crucial in evaluating the safety of dedifferentiation-derived epidermal stem cells. The induced epidermal stem cells from bFGF-treated group are more reliable than those from UV radiation group.

Epidermal stem cells Dedifferentiation DNA damage Safety evaluation

10.3969/j.issn.1672-8521.2015.01.006

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81000011，81272080，81000835)；深圳市科技研發(fā)資金基礎(chǔ)研究計(jì)劃(JC201005280429A，JCYJ20120613101917373)

蔡颯，副教授(E-mail：cai_sa@sina.com)

2015-02-03)