與家蠶絲氨酸蛋白酶抑制劑serpin—3相互作用蛋白的篩選

王明慧　毛鈺霞　許雅香

摘要：絲氨酸蛋白酶抑制劑超基因蛋白質(zhì)家族，參與調(diào)節(jié)昆蟲體內(nèi)多種生理反應(yīng)。本研究在體外原核表達(dá) 6His-Bmserpin-3，以此作為餌蛋白，采用His-pull down技術(shù)及SDS-PAGE分析，從家蠶血液中篩選出了能與 Bmserpin-3 結(jié)合的2個(gè)蛋白質(zhì)，分子量分別為83.04、83.57 ku。對(duì)家蠶幼蟲sp-2、sp-3在不同組織的表達(dá)變化分析可知，sp-2 在脂肪體、血淋巴中表達(dá)量比較高，sp-3在精巢、脂肪體、血淋巴里表達(dá)量比較高。

關(guān)鍵詞：家蠶；pull-down；蛋白相互作用

中圖分類號(hào)： S881.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）01-0037-03

收稿日期：2014-03-03

基金項(xiàng)目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（編號(hào)：CARS-22）；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目。

作者簡(jiǎn)介：王明慧（1986—），女，山東濱州人，碩士，主要從事家蠶資源與功能基因組學(xué)研究。E-mail：wangminghui.219@163.com。

通信作者：許雅香，副教授，主要從事家蠶資源與功能基因組學(xué)研究。Tel：（0512）65880260；E-mail：xuyaxiang@suda.edu.cn。Serpin全稱為serine protease inhibitor，是一類能夠抑制絲氨酸蛋白酶活性的超家族蛋白質(zhì)，參與調(diào)節(jié)生物體內(nèi)多種生理反應(yīng)，包括血液凝集、纖維蛋白溶解、補(bǔ)體激活、免疫黑化、生長(zhǎng)發(fā)育過程中組織構(gòu)建等[1-5]。Serpin在昆蟲各組織中均有分布，對(duì)昆蟲的生命活動(dòng)起到重要作用，目前關(guān)于家蠶Serpin的研究很多，但是幾乎沒有關(guān)于家蠶Serpin相互作用蛋白方面的研究，生物的生命活動(dòng)主要體現(xiàn)在蛋白質(zhì)水平，許多蛋白是通過與其他蛋白相互作用來發(fā)揮作用的，因此，研究蛋白質(zhì)相互作用能更好地理解生物的生命活動(dòng)。本研究原核表達(dá)并純化了Bmserpin-3蛋白，應(yīng)用pull-down及質(zhì)譜技術(shù)篩選到Bmserpin-3的相互作用蛋白，并通過熒光定量PCR技術(shù)初步探索了這2個(gè)基因的組織分布，旨在為深入探討 Bmserpin-3 的功能機(jī)制提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

家蠶品種為筆者所在研究室保存的大造，正常桑葉育，取5齡4 d幼蟲的脂肪體，-70 ℃保存?zhèn)溆?。Trizol RNA提取及M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑等化學(xué)常規(guī)試劑均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2重組表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定

采用反轉(zhuǎn)錄的家蠶5齡4 d幼蟲脂肪體的cDNA模板，PCR擴(kuò)增serpin-3基因。引物為F：5′-CTAGCTAGCAACATAGATCCGAACACCCTAAG-3′（下劃線為NheⅠ酶切位點(diǎn)）和R：5′-ACGCGTCGACCTATAGTACTTTATAATCCCCATCG-3′（下劃線為SalⅠ酶切位點(diǎn)）。擴(kuò)增條件是：95 ℃ 預(yù)變性 3 min；95 ℃變性30 s，60.4 ℃退火35 s，72 ℃延伸3 min，33個(gè)循環(huán)；最后72 ℃終延伸10 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pET-28a（+）進(jìn)行雙酶切，然后再將其目的片段與 pET-28a（+） 連接，轉(zhuǎn)化至E.coli Top10中，挑選陽性克隆進(jìn)行酶切鑒定及測(cè)序檢驗(yàn)。

1.3重組表達(dá)載體的誘導(dǎo)表達(dá)

含家蠶serpin-3全長(zhǎng)cDNA的陽性菌株在含30 mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)劑異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）至終濃度為0.5 mmol/L，37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h后，4 ℃ 5 000 r/min離心10 min收集菌體，用PBS重懸，在冰浴中超聲破碎，直到溶液變澄清。4 ℃ 5 000 r/min離心 10 min，收集沉淀即得包涵體形式的6His-Bmserpin-3。

1.4重組蛋白的純化、鑒定

4 ℃ 5 000 r/min離心20 min收集細(xì)胞，以1 ∶20比例添加0.01 mol/L PBS （pH值為 8.0），在PBS中懸浮細(xì)胞，冰上超聲后添加等量的蛋白loading buffer，蛋白樣品煮沸5 min，5 000 r/min 離心20 min。上清通過SDS-PAGE（沒有梳子）來純化，鋅染后，將膠條切成1 cm的條帶，裝到透析袋里，4 ℃ 透析過夜。用Brandford法檢測(cè)蛋白含量后，-20 ℃保存?zhèn)溆?，將純化好的蛋白用SDS-PAGE來鑒定。

1.5pull-down篩選與Bmserpin-3重組蛋白相互作用蛋白

按照每100 mg組織加入1 mL裂解液的比例加入RIPA裂解液（使用前數(shù)分鐘加入PMSF使PMSF終濃度為1 mmol/L），通過強(qiáng)烈的渦旋使樣品裂解充分，5 000 r/min離心5 min，取上清，儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱中備用。用10 mL binding buffer 平衡250 μL樹脂，將純化后的Bmserpin-3蛋白與樹脂在4 ℃下緩慢搖晃結(jié)合5 h，使Bmserpin-3蛋白與樹脂充分結(jié)合，讓蛋白液流出，用含50 mmol/L咪唑的Tris洗脫Ni2+柱，祛除未結(jié)合的Bmserpin-3蛋白，將1 mL血液總蛋白加入Ni2+柱中，與Bmserpin-3蛋白復(fù)合物共同4 ℃孵育過夜，使血液內(nèi)靶蛋白與Bmserpin-3蛋白結(jié)合，從而形成樹脂-Bmserpin3-血液總蛋白的復(fù)合物，用含50 mmol/L咪唑的Tris洗脫Ni2+柱，祛除未結(jié)合的血液總蛋白，用含 200 mmol/L 咪唑的 elution buffer洗脫液，將Bmserpin3-血液總蛋白復(fù)合物與樹脂分離，收集洗脫液，12% SDS-PAGE分析收集的洗脫液。

1.6靶標(biāo)蛋白基因的分布

采用Primer 5.0軟件，引物如表1所示。采用SYBR PrimeScriptTM RT-PCR試劑盒測(cè)定，具體步驟按照說明書進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火 30 s，循環(huán)45次。反應(yīng)體系為：SYBRPremix Ex TaqTM（2×） 10 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×） 0.4 μL，DNA模板 2 μL，ddH2O 6.8 μL。反應(yīng)過程由ABI7300熒光定量PCR儀（Applied Biosystems公司）軟件自動(dòng)設(shè)定，每個(gè)樣品重復(fù)3次。表1實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)基因、內(nèi)參照基因的引物

基因名稱引物序列Tm（℃）Actin3F：5′-CGGCTACTCGTTCACTACC-3′；R：5′-CCGTCGGGAAGTTCGTAAG-3′59.27Bmsp-2F：5′-TTAATTCTGGCTGGGCTTGT-3′；R：5′-TTAGTTGGCTCACATCTTGG-3′ 55.80Bmsp-3F：5′-GATTTTAGCGGGGCTTATTG-3′；R：5′-AGTCCTGGGCGACTTTGTAG-3′ 55.80

2結(jié)果與分析

2.1重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

含有酶切位點(diǎn)NheⅠ、SalⅠ的引物擴(kuò)增serpin-3基因的ORF，得到1 300 bp左右的條帶，PCR純化的目的片段與 pET-28a（+）連接后，轉(zhuǎn)化至E.coli Top10中，挑選陽性克隆進(jìn)行酶切鑒定（圖1），條帶約1 300 bp，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，命名為pET-28a-Bmserpin-3。

2.2重組蛋白的純化與鑒定

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組 Bmserpin-3 蛋白，表達(dá)的蛋白多是以包涵體方式存在，用鋅染、透析的方式進(jìn)行純化，結(jié)果如圖2所示，SDS檢測(cè)到1條單一的約49 ku的蛋白條帶。

2.3重組蛋白相互作用蛋白的鑒定

樣品組內(nèi)形成樹脂-Bmserpin-3-血液總蛋白的復(fù)合物后，先用含50 mmol/L咪唑的Tris洗脫，祛除非特異性結(jié)合，然后用含200 mmol/L咪唑的elution buffer洗脫液使 Bmserpin-3-血液總蛋白復(fù)合物與樹脂分離，收集樣品，后期用SDS-PAGE分析（圖3）?？梢娕cBmserpin-3相互作用的3條蛋白條帶。從SDS-PAGE膠上將3條蛋白條帶切下，放入EP管中，加入胰蛋白酶進(jìn)行膠內(nèi)酶切，然后用LC-MS/MS技術(shù)對(duì)獲得的3條蛋白條帶進(jìn)行分析（圖4）。鑒定出的蛋白是家蠶儲(chǔ)存蛋白、性別特異儲(chǔ)存蛋白2，相關(guān)蛋白信息見表2。

2.4家蠶幼蟲Bmsp-2，3在不同組織的表達(dá)變化

由圖5可以看出，sp-2、sp-3在各個(gè)組織都有分布，且sp-2在脂肪體、血淋巴中表達(dá)量比較高；sp-3在精巢、脂肪體、血淋巴中表達(dá)量比較高。

4結(jié)論與討論

蛋白質(zhì)是生物生命活動(dòng)的重要體現(xiàn)者之一，幾乎參與生物所有的生命過程、細(xì)胞活動(dòng)。它在體內(nèi)主要通過與自身或其他蛋白質(zhì)及核酸形成復(fù)合體來進(jìn)行基因調(diào)節(jié)、免疫應(yīng)答、信

表2相互作用蛋白相關(guān)信息

蛋白質(zhì)名稱基因登錄號(hào)得分等電點(diǎn)分子量

（ku）性別特異儲(chǔ)存蛋白2gi|1244307251015.7083.57家蠶儲(chǔ)存蛋白gi|3793278111785.9083.04

號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞組裝等生物學(xué)功能[6-7]。通過研究蛋白質(zhì)之間的相互作用可獲得更多的細(xì)胞功能信息。目前蛋白質(zhì)相互作用的主要研究方法有酵母雙雜交技術(shù)、免疫共沉淀法、噬菌體展示技術(shù)、pull-down技術(shù)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）技術(shù)及生物信息學(xué)分析法等。已有學(xué)者利用pull-down 方法鑒定已知的2種蛋白質(zhì)間的相互作用，或采用少量Ni2+-NTA agarose beads 在Eppendorf 管中進(jìn)行小體積的pull-down[8-9]。筆者采用Ni2+-NTA agarose beads 柱使整個(gè)體系放大，更利于蛋白質(zhì)的結(jié)合、洗脫，并結(jié)合質(zhì)譜分析來篩選與Bmserpin-3相互作用的蛋白質(zhì)。絲氨酸蛋白酶抑制劑在生物體內(nèi)分布廣泛，參與調(diào)節(jié)生物體內(nèi)多種生理反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，云杉卷葉蛾serpin-1在表皮中高表達(dá)，且在蛻皮期間的轉(zhuǎn)錄水平高于蛻皮期。煙草天蛾serpin-1mRNA在5齡幼蟲脂肪體中含量豐富，但在蛻皮、化蛹時(shí)mRNA水平驟然降低[10]。岡比亞按蚊serpin-2與絲氨酸蛋白酶CLIPB9結(jié)合調(diào)節(jié)黑化反應(yīng)，此外CLIPB9與serpin2的相互作用還影響雌性成蟲壽命[11]。果蠅serpin27A與serpin28D都參與了先天性免疫反應(yīng)，但果蠅serpin28D只參與由創(chuàng)傷引起的酚氧化酶激活產(chǎn)生的黑化，serpin27A在酚氧化酶激活路徑中調(diào)節(jié)病毒或病原菌引起的黑化[12-13]。果蠅中serpin43AC參與了toll途徑調(diào)節(jié)的先天性免疫反應(yīng)[14-15]。研究發(fā)現(xiàn)，岡比亞按蚊中serpin10在中腸上皮細(xì)胞聚集與瘧疾病原體的傳播有關(guān)[16]。Serpin家族在昆蟲的表皮、頭部、血淋巴、脂肪體、絲腺、中腸、精巢、卵巢中均有分布，對(duì)家蠶的各種生理活動(dòng)起到調(diào)節(jié)作用[17]。董照明等認(rèn)為，serpin-16在維持絲腺穩(wěn)定的泌絲環(huán)境中發(fā)揮重要作用[18]。查宏賢研究表明，家蠶serpin-4參與了先天性免疫反應(yīng)[19]。王彥云等證實(shí)serpin-6與家蠶表皮黑化、蛻皮變態(tài)、先天性免疫等生理過程有關(guān)[20]。李國(guó)勝等推測(cè)serpin-5與家蠶的生殖生理有關(guān)，可能參加了家蠶的先天免疫反應(yīng)[21]。serpin-3是以單體的形式發(fā)揮作用還是與伴侶分子一起作用或是與其他蛋白質(zhì)形成復(fù)合物來發(fā)揮作用還不得而知。本研究選擇適宜大分子量蛋白質(zhì)的六聚組氨酸作為標(biāo)簽，構(gòu)建了家蠶serpin-3六聚組氨酸蛋白，并以此為餌蛋白，采用His-pull down技術(shù)，從家蠶血液中調(diào)取了2個(gè)與該蛋白相互作用的蛋白。它們均是血液儲(chǔ)存蛋白，同源性很高，與β-芳基儲(chǔ)存蛋白亞基（煙草天蛾）、芳基儲(chǔ)存蛋白（棉鈴蟲）、血清儲(chǔ)存蛋白2（印度蠶）具有很高的同源性，功能也相似，主要是參與免疫、信號(hào)傳導(dǎo)。對(duì)家蠶幼蟲sp-2、sp-3在不同組織的表達(dá)變化分析可知，sp-2在脂肪體、血淋巴中表達(dá)量比較高，sp-3在精巢、脂肪體、血淋巴里表達(dá)量比較高。

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