牛DAZL基因序列分析、克隆及表達(dá)載體構(gòu)建

鄭鵬　鄭曉萌　于磊　等

摘要：利用生物信息學(xué)方法對牛DAZL基因的一級結(jié)構(gòu)和同源性進行分析，并根據(jù)牛DAZL基因序列設(shè)計引物來克隆該基因，通過酶切、連接、轉(zhuǎn)化構(gòu)建該基因的表達(dá)載體，成功克隆到了DAZL基因。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，哺乳動物的DAZL基因同源性很高。此外，構(gòu)建了牛DAZL基因的帶綠色熒光蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N3-DAZL。

關(guān)鍵詞：DAZL基因；序列；克??；表達(dá)載體

中圖分類號： S823.3文獻標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）01-0034-03

收稿日期：2014-03-21

基金項目：黑龍江省普通高等學(xué)校動物遺傳育種與繁殖重點實驗室開放課題（編號：GXZDSYS-2012-07）；東北農(nóng)業(yè)大學(xué)博士啟動基金（編號：2012RCB27）。

作者簡介：鄭鵬（1979—），男，黑龍江蘭西人，博士，講師，主要從事動物繁殖生理與繁殖技術(shù)研究。E-mail：zh-96128@163.com。

通信作者：張貴學(xué)，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事動物繁殖生理與繁殖技術(shù)研究。E-mail： gxzhang@neau.edu.cn。Deleted in azoospermia like （DAZL）基因是DAZ基因家族中的一員，最早克隆于蠅類的睪丸組織，是一個在進化上高度保守的基因，在脊椎動物的生殖細(xì)胞中特異表達(dá)，是生殖細(xì)胞形成所必須的調(diào)控因子。DAZL通過RNA識別基序與mRNA結(jié)合，并以多聚體的方式在翻譯水平發(fā)揮作用[1]。DAZL基因是BOULE基因通過基因修飾、倍增而來，廣泛分布于人類、鼠、爪蟾、蠑螈、斑馬魚、青魚等物種中[2]。許多物種的DAZL同系物對生殖細(xì)胞的分化都是非常重要的。DAZL基因的突變、微缺失以及表達(dá)下調(diào)均可引起生精障礙，導(dǎo)致雄性不育[3]。Ruggiu等發(fā)現(xiàn)，與正常鼠相比，雜合DAZL基因缺陷鼠的畸形精子率增高，但仍有正常生育力，而純合鼠表現(xiàn)為嚴(yán)重的生殖細(xì)胞減少，成熟阻滯，睪丸體積減小，不能生育[4]。此外，Schrans-Stassen等研究證實，DAZL基因敲除鼠表現(xiàn)出雙睪丸干細(xì)胞數(shù)目減少、以及減數(shù)分裂早期精原細(xì)胞分化失敗，從而導(dǎo)致不育[5]。因此，研究DAZL基因及其編碼蛋白對探索配子發(fā)生和成體生殖缺陷及修復(fù)具有重要意義。本試驗主要對DAZL基因進行克隆和開展生物信息學(xué)分析，并構(gòu)建牛DAZL基因真核表達(dá)載體pEGFP-N3-DAZL，以期為探索DAZL基因的功能和在精子發(fā)生過程中的作用提供前期基礎(chǔ)和試驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

成年牛（約40月齡）睪丸組織，取自哈爾濱成高子屠宰場；Trizol Reagent和lipofectamine2000購自Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自ABI公司，pEASY-T1 Simple Cloning Kit購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，T4 DNA連接酶購自NEB公司 DMEM/F12、胎牛血清購自Gibco公司，PrimeSTAR HS DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ及其他常規(guī)試劑均購自大連寶生物公司。

1.2試驗方法

1.2.1牛DAZL基因的生物信息學(xué)分析利用DNAStra軟件分析DAZL的一級結(jié)構(gòu)；采用Clustal X進行DAZL基因同源性多重比對；采用MEGA4程序構(gòu)建分子進化樹。

1.2.2牛DAZL基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建參照GenBank牛DAZL基因序列（NM_001081725）設(shè)計其編碼區(qū)特異性克隆引物F：CGGAATTCTATGTCTGCTGCAAATCCTGAGACTC和R：CGGATCCAACAGACTTAAGCACTGCCCGACTT（上、下游分別引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點），引物由華大基因公司合成。利用Trizol法提取成牛睪丸組織總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以其為模板，利用高保真Prime-STAR HS DNA聚合酶對牛DAZL基因全長編碼區(qū)進行RT-PCR擴增，目的片段經(jīng)凝膠回收加A后連接到pEASY-T1 simple載體上，進一步亞克隆到pEGFP-N3載體上。構(gòu)建好的質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定后，送往北京華大公司測序。

2結(jié)果

2.1DAZL基因的生物信息學(xué)分析

2.1.1DAZL基因一級結(jié)構(gòu)分析牛DAZL基因的CDS全長為888 bp，由264個腺嘌呤（A）、194個胞嘧啶（C）、187個鳥嘌呤（G）和243個胸腺嘧啶（T）組成，4種堿基的含量依次為29.73%、21.85%、21.06%、27.36%。該基因ORF位于 1 888 bp，編碼295個氨基酸，含29個強堿性氨基酸殘基（K，R），24個強酸性氨基酸（D，E），82個疏水性氨基酸殘基（A、I、L、F、W、V），103個極性氨基酸殘基（N、C、Q、S、T、Y），分子量為33.02 Ku，等電點為8.78，脯氨酸、絲氨酸、纈氨酸所占比例較高。

2.1.2DAZL基因同源性分析從NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中選取人（Homo sapiens）、大鼠（Rattus norvegicus）、小鼠（Mus musculus）、牛（Bos taurus）、中國牦牛（domestic yak）、豬（Sus scrofa）、狨猴（Callithrix jacchus）、松鼠猴（Saimiri sciureus）、小黑猩猩（Pan paniscus）、獠狨（Saguinus oedipus）、原雞（Gallus gallus）共11個物種的DAZL基因，采用Clustal X進行多重比對，結(jié)果顯示牛與中國牦牛的同源性最高，為99%，與小鼠、人、狨猴、小黑猩猩、豬、獠狨、松鼠猴、大鼠、原雞的同源性分別為98%、97%、97%、97%、97%、96%、96%、92%、80%（圖1）。

2.1.3分子進化樹構(gòu)建使用MEGA4程序，采用 Neighbor-Joining 算法，Bootstrap設(shè)為1 000，構(gòu)建分子進化樹，從樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)上來看，牛的DAZL基因與中國牦牛的關(guān)系最近，與大鼠和小鼠一同構(gòu)成了一個小群，同人、獠狨、豬共同構(gòu)成一個亞類群（圖2）。

2.2DAZL基因編碼區(qū)的克隆

提取的RNA進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，檢測內(nèi)參基因和DAZL基因的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)成年牛睪丸中有DAZL基因的表達(dá)。

以成年牛睪丸組織cDNA為模板進行PCR擴增，擴增出1條與預(yù)期長度相符的片段，得到了DAZL基因的全部編碼區(qū)（圖3-A）。將擴增出與預(yù)期長度相符的片段進行膠回收，與PMD18-T載體連接、轉(zhuǎn)化，對構(gòu)建的載體進行PCR鑒定和EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切鑒定，結(jié)果顯示在902 bp處出現(xiàn)特異條帶（圖3-B、圖3-C），與預(yù)期的插入片段大小相符。

2.3表達(dá)載體的制備與鑒定

將DAZL-PMD18-T和PEGFP-N3進行EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切、膠回收，然后按摩爾比1 ∶1的量，用T4 DNA連接酶進行連接，得到構(gòu)建的載體，然后將構(gòu)建好的DAZL表達(dá)載體進行EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切及PCR鑒定，瓊脂糖凝膠檢測為所要片段大?。▓D4）。轉(zhuǎn)化，挑菌陽性克隆進行序列測定，測序正確的質(zhì)粒用于下一步的試驗。

3討論

不同物種DAZL基因具有高度的同源相似性，參與調(diào)控生殖細(xì)胞的發(fā)育和分化。有研究表明，DAZL基因的缺失或突變會引起精子發(fā)生過程中減數(shù)分裂阻滯，導(dǎo)致精子缺乏和男性不育[3]。小鼠DAZL基因突變可影響兩性生殖細(xì)胞的功能，DAZL基因敲除鼠表現(xiàn)出不育[5]。DAZL和BOULE都是DAZ家族的重要成員，二者都具有典型的RNA識別基序（RNA recognition motifs，RRM）和DAZ重復(fù)序列[6]，能夠與一系列影響精子發(fā)生基因的mRNA結(jié)合，如CDC25A、TPX1、DDX4和TSSK3等[7]，并以多聚體的方式在翻譯水平發(fā)揮作用。

將目的基因超表達(dá)是研究基因功能的主要手段之一[8-9]，即將目標(biāo)基因與合適的載體相連接，使其在體外或體內(nèi)過量表達(dá)，觀察該基因超量表達(dá)后細(xì)胞或組織或機體所發(fā)生的表型變化，從而對該基因的功能作出評價。Yu等利用DAZL基因的超表達(dá)技術(shù)，將胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成精子樣細(xì)胞[10-11]，可見DAZL基因是精子發(fā)生的一個主要基因。本試驗擴增牛DAZL基因的編碼區(qū)，構(gòu)建了PEGFP-N3-DAZL表達(dá)載體，為進一步探討DAZL基因超表達(dá)的體細(xì)胞能否向精細(xì)胞方向分化、DAZL基因超表達(dá)的生殖干細(xì)胞能否加速分化形成精子奠定基礎(chǔ)。

4結(jié)論

本試驗成功構(gòu)建了牛DAZL基因的帶綠色熒光蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N3-DAZL，為闡明DAZL基因調(diào)控精子發(fā)生的機制奠定基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1]Moore F L，Jaruzelska J，Dorfman D M，et al. Identification of a novel gene，DZIP （DAZ-interacting protein），that encodes a protein that interacts with DAZ （deleted in azoospermia） and is expressed in embryonic stem cells and germ cells[J]. Genomics，2004，83（5）： 834-843.

[2]Saxena R，Brown L G，Hawkins T，et al. The DAZ gene cluster on the human Y chromosome arose from an autosomal gene that was transposed，repeatedly amplified and pruned[J]. Nature Genetics，1996，14（3）：292-299.

[3]Reynolds N，Cooke H J. Role of the DAZ genes in male fertility[J]. Reproductive BioMedicine Online，2005，10（1）：72-80.

[4]Ruggiu M，Saunders P T，Cooke H J. Dynamic subcellular distribution of the DAZL protein is confined to primate male germ cells[J]. Journal of Andrology，2000，21（3）：470-477.

[5]Schrans-Stassen B H，Saunders P T，Cooke H J，et al. Nature of the spermatogenic arrest in Dazl—/- mice[J]. Biology of Reproduction，2001，65（3）：771-776.

[6]Eberhart C G，Maines J Z，Wasserman S A. Meiotic cell cycle requirement for a fly homologue of human deleted in azoospermia[J]. Nature，1996，381（6585）：783-785.

[7]Liu Z，Li Q，Pan Z，et al. Comparative analysis on mRNA expression level and methylation status of DAZL gene between cattle-yaks and their parents[J]. Animal Reproduction Science，2011，126（3/4）：258-264.

[8]束婧婷，宋衛(wèi)濤，朱文奇，等. PGC-la基因在兩種類型雞骨骼肌間的表達(dá)差異[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2013，29（1）：121-125.

[9]蔣香菊，吳陽升，林嘉鵬，等. 綿羊AMH基因的克隆、序列分析與原核表達(dá)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2013，29（6）：1386-1392.

[10]Yu Z，Ji P，Cao J，et al. Dazl promotes germ cell differentiation from embryonic stem cells[J]. Journal of Molecular Cell Biology，2009，1（2）：93-103.

[11]Kee K，Angeles V T，F(xiàn)lores M，et al. Human DAZL，DAZ and BOULE genes modulate primordial germ-cell and haploid gamete formation[J]. Nature，2009，462（7270）：222-225.