分子生物學(xué)技術(shù)在產(chǎn)甲烷古菌多樣性研究中的應(yīng)用

張瑞　雍曉雨　周俊　等

摘要：產(chǎn)甲烷菌在自然界中分布廣泛，是一類重要的嚴(yán)格厭氧原核微生物，其參與的產(chǎn)甲烷作用通常發(fā)生在厭氧發(fā)酵過程的最后一步，可將無機(jī)物或有機(jī)化合物最終轉(zhuǎn)化成甲烷和二氧化碳。由于產(chǎn)甲烷菌獨(dú)特的厭氧代謝機(jī)制，使其在自然界碳素循環(huán)過程中起著重要作用，因此對于產(chǎn)甲烷菌的多樣性以及代謝機(jī)制的研究越來越受到人們的關(guān)注。相對于傳統(tǒng)的培養(yǎng)檢測方法，分子生物學(xué)技術(shù)對于產(chǎn)甲烷菌的多樣性及其群落結(jié)構(gòu)的檢測更為便捷、準(zhǔn)確和科學(xué)。介紹了產(chǎn)甲烷古菌的系統(tǒng)分類學(xué)發(fā)展，系統(tǒng)地闡述了產(chǎn)甲烷菌定性和定量的分子生物學(xué)檢測方法，總結(jié)了不同技術(shù)在產(chǎn)甲烷菌多樣性研究中的最新成果，最后提出多種技術(shù)的復(fù)合應(yīng)用將成為研究的熱點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：產(chǎn)甲烷古菌；生物多樣性；分子生物學(xué)技術(shù)；檢測；復(fù)合應(yīng)用

中圖分類號： Q939.97文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）01-0016-05

收稿日期：2014-03-07

基金項(xiàng)目：國家“973”計(jì)劃（編號：2013CB733502）；國家自然科學(xué)基金（編號：21307058、21207065）；中國科學(xué)院環(huán)境與應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金（編號：KLCAS-2013-05）；江蘇省農(nóng)業(yè)自主創(chuàng)新資金[編號：CX（13）3045]；江蘇省高校自然科學(xué)研究面上項(xiàng)目（編號：13KJB610006）。

作者簡介：張瑞（1990—），女，江蘇連云港人，碩士，主要從事微生物和分子生物學(xué)的研究。E-mail：zhangrui1030@njtech.edu.cn。

通信作者：鄭濤，男，教授，主要從事生物能源、生物材料方向的研究。Tel：（025）58139929；E-mail：zhengtao@njtech.edu.cn。能源和環(huán)境是制約當(dāng)今世界經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展的兩大關(guān)鍵問題，可再生生物質(zhì)能源的研究顯得尤為重要。沼氣是最早被人們開發(fā)并獲得廣泛應(yīng)用的一類可再生能源。沼氣所產(chǎn)生的能量不僅能夠減少化石能源的消耗，而且可以大大減少溫室氣體的排放，同時(shí)具有極大的經(jīng)濟(jì)效益，因此關(guān)于沼氣的研究在世界范圍內(nèi)引起廣泛的關(guān)注[1]。

微生物群落結(jié)構(gòu)的組成決定其所具有的生態(tài)功能，對參與某一特定生物化學(xué)轉(zhuǎn)化作用的微生物菌群的定性和定量研究對于探討其參與反應(yīng)的機(jī)理及關(guān)鍵步驟的解析具有重要的意義。沼氣的產(chǎn)生是由多種微生物菌群協(xié)同參與的復(fù)雜轉(zhuǎn)化過程，參與菌群可大致分為3類：水解和發(fā)酵細(xì)菌、專性產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌和產(chǎn)甲烷古菌[2]。產(chǎn)甲烷菌作為厭氧發(fā)酵過程最后一步的關(guān)鍵菌群，其群落的組成和數(shù)量的變化將直接影響沼氣發(fā)酵速率和最終的產(chǎn)氣量。

產(chǎn)甲烷古菌大多以甲酸、甲基化合物、乙酸、H2/CO2為底物原料。近年來，隨著Hungate厭氧操作技術(shù)的發(fā)展，人們對于產(chǎn)甲烷菌的研究越來越多。產(chǎn)甲烷菌存在于各種極端厭氧環(huán)境中，且在不同的生態(tài)環(huán)境下，產(chǎn)甲烷菌的群落組成也存在差異，其代謝過程也隨著環(huán)境的不同而體現(xiàn)出多樣性[3]。自然界中甲烷主要由3 種途徑產(chǎn)生：乙酸發(fā)酵途徑、氫營養(yǎng)型途徑 （亦稱CO2還原途徑） 和甲基營養(yǎng)型途徑。不同條件下，各個(gè)途徑對甲烷生成的貢獻(xiàn)率不同。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，如16S rRNA克隆文庫技術(shù)、變性梯度凝膠電泳技術(shù)、限制性酶切片段長度多態(tài)性分析技術(shù)和穩(wěn)定同位素核酸探針技術(shù)等多種分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法所帶來的的形態(tài)和生理的變化及不可培養(yǎng)微生物種群缺失的缺陷，使得人們對于產(chǎn)甲烷菌的群落組成及其代謝機(jī)制、動力學(xué)研究越來越深入。全面準(zhǔn)確地了解參與沼氣發(fā)酵的微生物種群結(jié)構(gòu)，特別是產(chǎn)甲烷古菌的群落組成和結(jié)構(gòu)變化規(guī)律，能夠?yàn)檎託獍l(fā)酵過程的設(shè)計(jì)優(yōu)化、微生物代謝調(diào)控等提供可靠的技術(shù)參數(shù)。

1產(chǎn)甲烷古菌的系統(tǒng)分類學(xué)發(fā)展

1974年，Bryant 首次提出了產(chǎn)甲烷菌（Methanogen）這一概念，將其與以甲烷為能量來源的嗜甲烷菌（Methanotrophs）區(qū)分開來[4]。2001年，《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》將產(chǎn)甲烷菌放在寬廣古生菌門（Euryarchaeota）中。他們廣泛存在于各種厭氧環(huán)境中，如海水沉積物、湖泊沼澤及動物瘤胃、盲腸等自然生態(tài)系統(tǒng)環(huán)境中；也存在于廢水、稻草秸稈、禽畜糞便等非自然生態(tài)環(huán)境中[5]。產(chǎn)甲烷菌分類形式多樣，傳統(tǒng)的分類是基于微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化特性等為依據(jù)進(jìn)行的，鑒于產(chǎn)甲烷菌生長條件苛刻，生長速率一般較低，生物量也較少，培養(yǎng)方法特別，其所能利用的底物種類較少，且染色、形態(tài)特征也比真細(xì)菌易變和難確定，給傳統(tǒng)分類法帶來極大的挑戰(zhàn)。迄今為止，僅有200多種產(chǎn)甲烷菌被分離鑒定出來，歸屬于3綱5目10科29個(gè)屬[6]。其中5目分別為甲烷桿菌目（Methanobacteriales）、甲烷球菌目（Methanococcales）、甲烷微菌目（Methanomicrobiales）、甲烷八疊球菌目（Methanosarcinales）、甲烷火菌目（Methanopyrales）[7]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們更多地利用系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分類法，依據(jù)物種間小亞基核糖體核苷酸的差異性對產(chǎn)甲烷菌進(jìn)行鑒定和分類[8]。

2分子生物學(xué)技術(shù)在產(chǎn)甲烷古菌多樣性中的應(yīng)用

產(chǎn)甲烷古菌群生活在極端厭氧環(huán)境中，對溫度、pH值、底物濃度等因素非常敏感。Hungate厭氧操作技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展使得產(chǎn)甲烷古菌的純培養(yǎng)成為可能。然而傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法較為繁瑣，且無法保持微生物生態(tài)環(huán)境的一致性，而分子生物技術(shù)因其在非培養(yǎng)條件下對微生物遺傳信息進(jìn)行研究，從而被認(rèn)為是產(chǎn)甲烷菌研究的重要且有效的手段。1996年，伊利諾伊大學(xué)第一次完成了產(chǎn)甲烷菌Methanococcus jannaschii的基因組測序。近年來，人們越來越多地以基因組遺傳信息為依據(jù)，并運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)來研究物種的種群多樣性、群落結(jié)構(gòu)組成、菌群功能及其代謝機(jī)理。這些分子生物學(xué)技術(shù)，例如變性梯度凝膠電泳 （denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）、限制性片段長度多態(tài)性分析（restrictionfragment length polymorphism，RFLP）、末端限制性片段長度多態(tài)性分析（terminal-restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）、熒光原位雜交技術(shù)（florescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）等的引入，將產(chǎn)甲烷古菌這一重要環(huán)境微生物的研究帶入了一個(gè)新時(shí)代。

2.116S rRNA/mcrA 基因克隆文庫分析

16S rRNA基因克隆文庫分析是在生物多樣性研究中最常用的分子手段之一。1990年，Giocannoni等首次應(yīng)用該方法分析馬尾藻海海面的浮游微生物多樣性[9]。該方法是基于對樣品總DNA進(jìn)行PCR克隆獲得目的基因16S rRNA片段，將其連入載體導(dǎo)入宿主菌中，挑選陽性克隆進(jìn)行測序，構(gòu)建克隆文庫，對所獲得的克隆序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，從而獲得樣品微生物系統(tǒng)多樣性。這些種系或者分類操作單元（operational taxonomic units，OTU）的數(shù)目直接反映了某一種生物類的豐富度[10]。

甲基輔酶M還原酶 （methyl coenzyme-M reductase，MCR） 是甲烷生成過程中的關(guān)鍵酶，其α亞基 （McrA，由mcrA基因編碼） 催化甲烷化反應(yīng)中的最后一步，存在于所有產(chǎn)甲烷菌中[11]?；谄浯呋磻?yīng)的獨(dú)特性，可作為檢測和區(qū)分產(chǎn)甲烷菌的分子標(biāo)記[12]。1995年，Springer等成功驗(yàn)證了mcrA探針用于產(chǎn)甲烷古菌多樣性分析的可行性[13]。Nolla-Ardèvol等利用mcrA基因序列分析中亞堿湖中產(chǎn)甲烷菌群，從而研究其作為高pH甲烷反應(yīng)器接種物的適用性[14]。mcrA克隆文庫技術(shù)已日趨完善，并且在產(chǎn)甲烷菌的研究中發(fā)揮著不可替代的作用。產(chǎn)甲烷古菌多樣性分析中常用的引物序列可查閱文獻(xiàn)獲得（表1）。表1產(chǎn)甲烷古菌多樣性分析中常用的引物序列

引物名稱引物序列（5′→3′）PCR產(chǎn)物長度

（bp）參考文獻(xiàn)16S rDNAArchaeal21Fa：TTCCGGTTGATCCYGCCGGA；Archaeal958Ra：YCCGGCGTTGAMTCCAATT900Delong[15]MEME1：GCMATGCARATHGGWATGTC；ME2：TCATKGCRTAGTTDGGRTAGT760Hales等[16]MCRMCRf：TAYGAYCARATHTGGYT；MCRr：ACRTTCATNGCRTARTT500Springer等[13]

近年來，16S rRNA/mcrA基因的克隆文庫分析在沼氣工程中的應(yīng)用越來越廣泛。2008年，Nettmann等首先將16S rRNA和mcrA分析應(yīng)用于利用牲畜糞便以及玉米秸稈作為底物的中溫商業(yè)沼氣工程產(chǎn)甲烷古菌多樣性的研究中[17]。研究中發(fā)現(xiàn)超過70%的古菌OTU都屬于Methanomicrobiales，即耗氫型產(chǎn)甲烷菌，而乙酸型產(chǎn)甲烷菌占了很小的比重。從而推測CH4主要由H2和CO2途徑產(chǎn)生。然而基于 16S rRNA/mcrA 基因克隆測序分析的方法仍然存在其固有缺點(diǎn)，為了更全面地分析樣品的多樣性，需要構(gòu)建大量的克隆，耗時(shí)較長，且成本昂貴[18]。隨著指紋識別技術(shù)的發(fā)展，通常將其二者結(jié)合使用來降低測序的費(fèi)用[19]。

2.2變性梯度凝膠電泳

變性梯度凝膠電泳 （denatured gradient gel electrophoresis，DGGE） 最早由Fischer等提出，是用于檢測DNA片段點(diǎn)突變的一種技術(shù)[20]。DGGE是根據(jù)長度相同但堿基序列不同的DNA片段在不同濃度梯度變性劑中解鏈行為不同而在電泳時(shí)遷移速率不同這一機(jī)理，從而將某一樣品中不同種屬菌株的DNA片段區(qū)分開。凝膠不同位置所形成的條帶與樣品中的優(yōu)勢菌群相關(guān)，再加以測序以及系統(tǒng)發(fā)育分析，進(jìn)而可直接反映了樣品的生物多樣性。1993年，Muyzer等首次將其用于分析土壤環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)研究中[21]。由于其可避免培養(yǎng)法所帶來的偏向性，在不改變樣品環(huán)境的情況下，對樣品微生物群落組成及其多樣性進(jìn)行分析，因此又被廣泛應(yīng)用到海洋、高溫、高鹽、厭氧污泥、污水處理等環(huán)境微生物多樣性的研究中。然而Hwang等利用DGGE對活性污泥厭氧反應(yīng)器中的產(chǎn)甲烷菌群多樣性進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，基于古細(xì)菌的16S rRNA基因擴(kuò)增的DGGE分析不能完全反映出樣品中所存在的產(chǎn)甲烷菌分類[22]。這些差異性可能是由于PCR擴(kuò)增、DNA提取或者是菌群本身的豐富度所造成的。因而DGGE一般并不單獨(dú)作為分析技術(shù)應(yīng)用，而是輔以其他的方法，例如與原位分子雜交技術(shù)復(fù)合使用，應(yīng)用于硫酸鹽還原菌的研究中[23]。Zakaria等利用FISH和DGGE發(fā)現(xiàn)Methanosaeta concilii是POME厭氧消化中的優(yōu)勢菌群，它是乙酸型產(chǎn)甲烷的重要菌群以及屬于Methanosaeta潛在新菌的存在[24]。但當(dāng)某種產(chǎn)甲烷菌含量較少，其DNA占總DNA量不足1%時(shí)，利用該技術(shù)很難檢測出。

2.3熒光原位雜交技術(shù)

熒光原位雜交技術(shù)是用已知的被熒光標(biāo)記的單鏈核苷酸片段作為探針，按照DNA堿基互補(bǔ)的原則，與待測樣品基因組DNA 分子雜交，從而檢測該特異微生物種群的存在與豐度的一種方法。探針的特異性適用于任一分類學(xué)水平的測定，甚至可以區(qū)分個(gè)體間的差異。16S rRNA基因的寡核苷酸探針是比較常用的一類探針，其使用對微生物生態(tài)學(xué)具有重大意義。1993年，Wagner等率先將此技術(shù)應(yīng)用于活性污泥微生物群落檢測中，之后此技術(shù)在應(yīng)用中不斷得到完善[25]。劉春等采用熒光原位雜交技術(shù)對阿維菌素廢水工業(yè)化UASB反應(yīng)器中顆粒污泥產(chǎn)甲烷菌群進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)甲烷菌在不同粒徑的顆粒污泥表面和內(nèi)部剖面中分布形態(tài)相同但分布豐度存在差異。同時(shí)，該技術(shù)也在不斷改進(jìn)中，使其具有更大的適用性。Stoecker等用雙標(biāo)記的寡核苷酸探針來替代單標(biāo)記探針，在一定程度上加強(qiáng)了待測微生物種群的信號強(qiáng)度，同時(shí)提高了探針的有效性[26]。

2.4限制性酶切片段長度多態(tài)性

限制性酶切片段長度多態(tài)性（RFLP）是根據(jù)DNA在限制性內(nèi)切酶酶切后形成特定DNA片段的大小不同而發(fā)展起來的一種DNA標(biāo)記技術(shù)。然而酶切位點(diǎn)變異經(jīng)常會受到一些因素影響而突變，從而導(dǎo)致RFLP結(jié)果的準(zhǔn)確度降低。末端限制性酶切片段長度多態(tài)性（T-RFLP）是基于RFLP發(fā)展起來的一種方法，由于其利用特定的標(biāo)記引物對樣品DNA進(jìn)行特異擴(kuò)增，之后進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切，利用自動DNA測序儀對所獲熒光標(biāo)記T-RFS的大小以及相對豐度進(jìn)行測定，大大避免了RFLP的不足。T-RFLP作為一種高通量指紋識別技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)以及組成的變化研究中[27]。1997年，Liu等利用此技術(shù)研究復(fù)雜環(huán)境微生物多樣性，之后該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于各種生態(tài)系統(tǒng)中[28]。Lueders等采用T-RFLP和富集培養(yǎng)的方法研究水稻土壤中產(chǎn)甲烷菌的多樣性，發(fā)現(xiàn)大部分的產(chǎn)甲烷菌屬于Methanosarcinaceae、Methanosaetaceae和Methanobacteriaceae，并且鑒定出未被辨別的mcrA序列屬于RC-Ⅰ古菌成員[29]。Chin等利用 T-RFLP 技術(shù)和克隆文庫結(jié)合的方法分析了溫度對水稻土壤中產(chǎn)甲烷古菌結(jié)構(gòu)和功能的影響，發(fā)現(xiàn)15 ℃和30 ℃時(shí)，種群結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，Methanosarcinacaeae由原來的7%上升到77%（30 ℃）和33%（15 ℃）[30]?；诰W(wǎng)頁的一些工具的開發(fā)，大大促進(jìn)了T-RFLP引物以及限制性內(nèi)切酶的選擇[31]。如新工具restriction endonuclease picker （REPK） 可以根據(jù)研究者提供的不同樣品序列來選擇合適的限制性內(nèi)切酶，使得基因的選擇可以是多變的，而不是局限于16S rRNA。T-RFLP 應(yīng)用也越來越廣泛，包括真菌核糖體基因[32]，細(xì)菌16S rRNA基因[33]，古菌16S rRNA基因[34]及功能基因如固氮基因[35]、甲烷氧化基因[36]。

2.5實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)

實(shí)時(shí)定量PCR（real-time quantitative PCR）是基于PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)。實(shí)時(shí)定量PCR是基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的原理，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累對整個(gè)PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對待測未知模板進(jìn)行定量分析的方法。在實(shí)時(shí)定量PCR中，CT值是一個(gè)重要的參數(shù)。研究表明，每個(gè)模板的CT值與該模板起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而只要獲得未知樣品的Ct值，就可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了DNA模板定量的同時(shí)，還具有靈敏度高、準(zhǔn)確性強(qiáng)、能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)、無污染性和具實(shí)時(shí)性等優(yōu)點(diǎn)。1992年，由Higuchi等首次提出實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)[37]，此后該技術(shù)在很多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。Sawayama等采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對固定床厭氧反應(yīng)器中固定化產(chǎn)甲烷菌系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)大部分固定化產(chǎn)甲烷菌屬于甲烷八疊球菌屬，自由存在的產(chǎn)甲烷菌大部分屬于甲烷八疊球菌屬和甲烷桿菌屬，并成功實(shí)現(xiàn)了對固定化與自由存在產(chǎn)甲烷菌的定量分析[38]。Nettmann等利用實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)合FISH技術(shù)分析了6個(gè)不同底物原料農(nóng)業(yè)沼氣罐中產(chǎn)甲烷古菌群落的多樣性，大大豐富了對于大型沼氣反應(yīng)器中產(chǎn)甲烷古菌的研究[39]。王彥偉等利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)結(jié)合DGGE研究不同地區(qū)低溫沼氣池中前期、后期產(chǎn)甲烷古菌的群落變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同樣品發(fā)酵前期、后期產(chǎn)甲烷古菌的優(yōu)勢群落及數(shù)量上都存在較明顯的差異[40]。實(shí)時(shí)定量PCR更能反映出微生物菌群的真實(shí)情況并能對目的微生物進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

2.6穩(wěn)定同位素核酸探針技術(shù)

穩(wěn)定同位素核酸探針技術(shù)（stable isotope probing，DNA/RNA-SIP）通過對微生物核酸進(jìn)行同位素標(biāo)記，從而在分子水平揭示特定元素在復(fù)雜環(huán)境中的微生物調(diào)控機(jī)制[41]。根據(jù)探測的核酸分子不同可以分為DNA-SIP和RNA-SIP[42]。2000年，Radajewski 等開發(fā)了DNA-SIP技術(shù)，并成功應(yīng)用于森林土壤環(huán)境中[43]。2002年，Manefield 等利用RNA-SIP技術(shù)發(fā)現(xiàn)所研究的工業(yè)反應(yīng)器中的苯酚降解菌主要是Thauera genus成員[44]。常用的穩(wěn)定性同位素有13C 和 15N 等，標(biāo)記原子增加了DNA的浮力密度，通過密度梯度離心，選擇性回收13C 標(biāo)記的DNA，可用于微生物的鑒定和代謝功能的分析。除了DNA 之外，RNA 和磷脂脂肪酸（PLFA）等也可被用作標(biāo)記對象。由于RNA不依賴于細(xì)胞分裂，因此標(biāo)記RNA相較于DNA更接近原位狀況，靈敏度更高。目前穩(wěn)定性同位素示蹤技術(shù)在世界各國學(xué)者中掀起研究熱潮。Nikolausz等利用穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)評價(jià)不同底物條件下厭氧反應(yīng)器中主要產(chǎn)甲烷途徑，發(fā)現(xiàn)以雞糞為底物的反應(yīng)器主要通過氫營養(yǎng)途徑產(chǎn)甲烷，而在以玉米飼料和烘干谷物為底物的反應(yīng)器中，2種產(chǎn)甲烷途徑都存在，同時(shí)觀察到在加入玉米飼料后，同位素?cái)?shù)值發(fā)生了明顯的改變，證實(shí)了將同位素示蹤技術(shù)用作進(jìn)程控制的工具是可行的[45]。Conrad等的研究結(jié)合了穩(wěn)定同位素分餾效應(yīng)和分子生物學(xué)技術(shù)，評價(jià)了不同產(chǎn)甲烷途徑的貢獻(xiàn)率。將穩(wěn)定性同位素標(biāo)記技術(shù)與分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合而成的穩(wěn)定性同位素探測技術(shù)（SIP），為微生物群落結(jié)構(gòu)、功能結(jié)構(gòu)和代謝功能間關(guān)系的建立提供了新的解決方法。

Ginige等以13CH3OH標(biāo)記的DNA作為模板進(jìn)行16S rRNA基因序列擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)與甲醇營養(yǎng)菌Methylophilales相關(guān)的16S rRNA基因在標(biāo)記的DNA中具有較高的豐度；同時(shí)根據(jù)這些序列數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)FISH探針進(jìn)行原位雜交試驗(yàn)，結(jié)果表明活性污泥微生物群落的反硝化能力與SIP試驗(yàn)鑒定到的甲醇營養(yǎng)菌豐度相關(guān)；結(jié)合顯微放射自顯影技術(shù)，認(rèn)定SIP試驗(yàn)中所鑒定的甲醇營養(yǎng)菌Methylophilales同時(shí)也是活性污泥中重要的反硝化菌[46]。Ginige等很好地證明了多種分子技術(shù)復(fù)合使用的巨大優(yōu)勢。然而在實(shí)際應(yīng)用中，由于試驗(yàn)條件、技術(shù)水平等的限制，復(fù)合技術(shù)聯(lián)合使用并未普及，在今后的研究中，復(fù)合技術(shù)的完善與推廣將成為產(chǎn)甲烷菌多樣性研究的熱點(diǎn)。

3結(jié)論

傳統(tǒng)的微生物研究方法是以純培養(yǎng)為基礎(chǔ)的，許多研究證實(shí)，通過傳統(tǒng)方法鑒定出來的微生物不到環(huán)境微生物總數(shù)的10%。基于16S rRNA基因的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)，給環(huán)境微生物的研究提供了更加快速、準(zhǔn)確的手段。除了上述列舉的分子生物學(xué)技術(shù)，還有其他一些技術(shù)如單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single strain conformation polymorphism，SSCP）分析、實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄PCR（real-time RT-PCR）技術(shù)等，這些技術(shù)各有優(yōu)勢。在對產(chǎn)甲烷菌多樣性分析中，應(yīng)注意技術(shù)本身的特殊性及存在的不足，采用多種分子技術(shù)復(fù)合使用，克服操作過程中存在的不確定因素，從而使對復(fù)雜系統(tǒng)中產(chǎn)甲烷菌群的結(jié)構(gòu)及代謝途徑的研究更加全面、準(zhǔn)確，從而發(fā)揮產(chǎn)甲烷菌在環(huán)境和能源領(lǐng)域中的重要作用。

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