金蕎麥—表兒茶素類活性物質(zhì)體外抑菌試驗(yàn)

黃仁術(shù)　易凡

摘要：為了探討金蕎麥（Fagopyrum dibotrys）提取液的抑菌效果，試驗(yàn)測得其乙醇提取液中（-）表兒茶素類活性物質(zhì)含量達(dá)到10.019 mg/mL，占其塊根干物質(zhì)重的1.85%；牛津杯法表明金蕎麥（-）表兒茶素類活性物質(zhì)對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、大腸桿菌均有抑制作用，但對黑曲霉、灰綠青霉沒有抑制作用；二倍稀釋法表明（-）表兒茶素類活性物質(zhì)對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母的MIC分別為1.252、2.505、5010、5.010 mg/mL，對金黃色葡萄球菌的MBC為5.010 mg/mL。

關(guān)鍵詞：金蕎麥；（-）表兒茶素；體外抑菌

中圖分類號： S482.2+92文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）01-0308-03

收稿日期：2014-02-18

基金項(xiàng)目：安徽省高校省級自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（編號：KJ2012A280）；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（編號：201210376004）。

作者簡介：黃仁術(shù)（1976—），女，新疆阿克蘇人，碩士，副教授，主要從事天然活性物質(zhì)研究。E-mail：ahhrs@126.com。植物是抑菌活性物質(zhì)的天然寶庫，Grange等報(bào)道約有2 400種植物具有防治有害生物的活性[1]。金蕎麥（Fagopyrum dibotrys）作為一種具有開發(fā)前途的資源植物，目前有關(guān)其抑菌方面的研究較少，且未涉及具體的抗菌活性物質(zhì)成分。如有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道金蕎麥乙醇提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈球菌、沙門氏菌等有抑制作用[2-5]；而陳福勇等發(fā)現(xiàn)金蕎麥乙醇提取物對雞白痢沙門氏菌、金黃色葡萄球菌有較好的抑菌作用，對大腸桿菌無抑制作用[6]；張永仙等則報(bào)道金蕎麥乙醇提取物對豬霍亂沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌、豬與雞的致病性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、豬鏈球菌、克氏肺炎球菌等幾乎無抗菌作用，但在體內(nèi)卻有明顯的抗感染作用[7]。實(shí)際上，金蕎麥乙醇提取物為一類含原花色素的縮合性單寧混合物，主要由（-）表兒茶素及其二聚體組成，其中（-）表兒茶素單元的含量占65%～70%[8]。為此，本研究對金蕎麥乙醇提取物——（-）表兒茶素類活性物質(zhì)的含量進(jìn)行測定，并在此基礎(chǔ)上確定其對一些代表性細(xì)菌和真菌的抗菌效果，從而為無殘留、無毒副作用及細(xì)菌不易產(chǎn)生耐藥性的抗菌藥物開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

金蕎麥采集于安徽省潛山縣；（-）表兒茶素純度為98% （中國藥品生物制品檢定所）；試驗(yàn)菌株包括革蘭陽性菌、革蘭陰性細(xì)菌和真菌，其中革蘭陽性細(xì)菌以金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）為代表，革蘭陰性菌以大腸桿菌（Escherichia coli）為代表，真菌以黑曲霉（Aspergillus niger）、灰綠青霉（Penicillium glaucum）、釀酒酵母（Saccharomyces carlsbergensis）為代表；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，PDA培養(yǎng)基。

1.2儀器設(shè)備

TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），202-1型電熱恒溫干燥箱（上海浦東英豐科學(xué)儀器有限公司），HH-2/HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司），YX-450電熱蒸汽壓力消毒器（上海三申醫(yī)療器械有限公司），PYX-150HA恒溫恒濕培養(yǎng)箱（科立儀器），SW-CJ-1C潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1金蕎麥（-）表兒茶素類活性物質(zhì)的提取與測定建立香莢蘭素-鹽酸分光光度法對（-）表兒茶素類活性物質(zhì)含量的測定標(biāo)準(zhǔn)曲線：D=0.226 2C-0.012 6，R=0999 3，其中，D為吸光度，C為測定液濃度（μg/mL）。稱取20.0 g金蕎麥根部粉碎物，70%乙醇浸泡24 h，提取物用布氏漏斗抽濾提取得到上清液，上清液繼續(xù)用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到濃縮提取液，直至冷凝裝置不再有液體滴出，倒出提取液，量出為37 mL，封口冷藏保存。提取液測定時(shí)，用移液槍取10 μl提取液和10 mL乙醇于50 mL容量瓶中，用1%香莢蘭-濃鹽酸定容，測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算測定液中（-）表兒茶素類活性物質(zhì)的濃度[9]，試驗(yàn)重復(fù)測定3次。

1.3.2供試菌株的復(fù)蘇與純化無菌條件下用接種環(huán)接種金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌于牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃條件下培養(yǎng) 1 d。接種釀酒酵母、黑曲霉、灰綠青霉于PDA培養(yǎng)基，28 ℃條件下培養(yǎng)3 d。再用接種環(huán)挑取單個菌落接種培養(yǎng)，如此重復(fù)4次，得到純種菌體。用接種鏟刮下純種菌體，無菌水稀釋備用。

1.3.3牛津杯法測定（-）表兒茶素類活性物質(zhì)抑菌效果在倒好的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上分別加入100 μL金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌菌液，在PDA培養(yǎng)基上分別加入100 μL釀酒酵母、黑曲霉、灰綠青霉菌液，涂抹均勻。用鑷子夾取已經(jīng)滅菌的牛津杯置于平板中央，用已滅菌的移液槍移取200 μL濃縮物加入牛津杯中。細(xì)菌在37 ℃條件下培養(yǎng)1 d，真菌在28 ℃條件細(xì)培養(yǎng)3 d，觀察并測量抑菌圈。

1.3.4（-）表兒茶素類活性物質(zhì)的MIC、MBC測定每組取滅菌小試管10支，按照1～10編號，細(xì)菌每管加入牛肉膏湯1 mL，真菌每管加入馬鈴薯葡萄糖液1 mL；采用二倍稀釋法，用吸管吸取提取液 1 mL放入第1管，并反復(fù)吹勻；接著從第1管吸出1 mL放入第2管同樣吹勻后吸出1 mL放入第3管，依次逐管進(jìn)行稀釋到第8管；然后各管加入0.5 mL供試菌菌液。第9管為加入1 mL提取液但不加菌液的陰性對照管，第10管為不加提取液只加0.5 mL供試菌菌液的陽性對照管。細(xì)菌在37 ℃條件下培養(yǎng)1 d，真菌在28 ℃培養(yǎng)3 d，根據(jù)各管菌液生長情況測定最低抑菌濃度（MIC）。endprint

進(jìn)一步將未見細(xì)菌或真菌生長的各試管內(nèi)的培養(yǎng)液移種到牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基或PDA培養(yǎng)基上，細(xì)菌在37 ℃條件下培養(yǎng)1 d，真菌在28 ℃條件下培養(yǎng)3 d，根據(jù)培養(yǎng)皿中菌落生長情況測定最小殺菌濃度（MBC）。

2結(jié)果與分析

2.1金蕎麥（-）表兒茶素類活性物質(zhì)的含量

由表1可見，金蕎麥的乙醇提取物經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，其（-）表兒茶素類活性物質(zhì)含量達(dá)到10.019 mg/mL，總提取量占其塊根干物質(zhì)質(zhì)量的1.85%。

表1金蕎麥（-）表兒茶素類活性物質(zhì)含量測定情況

重復(fù)測定液吸光度測定液中活性物質(zhì)

含量（μg/mL）提取液中活性物質(zhì)

含量（mg/mL）Ⅰ0.4391.9969.982Ⅱ0.440 2.00110.004Ⅲ0.443 2.01410.071平均0.4412.00410.019

2.2（-）表兒茶素類 活性物質(zhì)抑菌效果

由圖1可知，金蕎麥（-）表兒茶素類活性物質(zhì)在10.019 mg/mL濃度時(shí)對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、大腸桿菌均形成抑菌圈，表明有明顯的抑菌作用；但對黑曲霉、灰綠青霉沒有形成抑菌圈，表明沒有抑菌作用。進(jìn)一步測量表明，相同濃度下，金蕎麥（-）表兒茶素類活性物質(zhì)對上述菌群的抑菌圈直徑為：金黃色葡萄球菌>釀酒酵母>枯草芽孢桿菌>大腸桿菌（表2）。

2.3（-）表兒茶素類活性物質(zhì)的MIC、MBC

從表3中可知，金蕎麥（-）表兒茶素類活性物質(zhì)對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度（MIC）為1.252 mg/mL，最小殺菌濃度（MBC）為5.010 mg/mL；對大腸桿菌的MIC為 2.505 mg/mL，對枯草芽孢桿菌、釀酒酵母的MIC為 5.010 mg/mL。

3討論

金蕎麥乙醇提取物原液——（-）表兒茶素類活性物質(zhì)含量在10.019 mg/mL濃度時(shí)，對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、大腸桿菌有抑菌作用，對黑曲霉、灰綠青霉沒有抑制作用。（-）表兒茶素類活性物質(zhì)對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母的MIC分別為1.252、2505、5.010、5.010 mg/mL，對金黃色葡萄球菌的MBC為5010 mg/mL；因提取液原液的濃度關(guān)系，未測定出大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母的MBC。金蕎麥（-）表兒茶素類活性物質(zhì)的抑菌活性不同，主要原因是活性成分對不同菌種的菌絲或孢子的生長抵制能力不同所致[10]。同時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果與前人對金蕎麥乙醇提取物的抑菌情況報(bào)道不一，可能與提取液中的活性物質(zhì)濃度不同相關(guān)。

香莢蘭素比色法測定（-）表兒茶素時(shí)，所測物質(zhì)應(yīng)包括（-）表兒茶素、（+）兒茶素，以及二者的二聚體和沒食子酸酯等（-）表兒茶素類物質(zhì)總含量[11]。此類含原花色素的縮合性單寧混合物可以通過結(jié)合細(xì)菌細(xì)胞壁蛋白質(zhì)，聚集細(xì)胞脂質(zhì)，以及單寧自氧化產(chǎn)生過氧化氫，干擾細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性，進(jìn)一步改變細(xì)菌細(xì)胞壁脂肪酸的組成，從而減緩細(xì)菌的生長[12]。

表2金蕎麥（-）表兒茶素類活性物質(zhì)對供試菌的抑菌圈的影響

供試菌抑菌圈直徑（mm）金黃色葡萄球菌13枯草芽孢桿菌10釀酒酵母12大腸桿菌9黑曲霉-灰綠青霉-注：“-”表示未見明顯抑菌圈。

表3金蕎麥（-）表兒茶素類活性物質(zhì)的MIC、MBC

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