轉(zhuǎn)基因RNAi 技術(shù)在番茄研究中的應(yīng)用

楊瑪麗， 趙統(tǒng)敏， 余文貴， 張保龍， 陳天子， 趙麗萍， 王銀磊

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，江蘇 南京210014;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所，江蘇 南京210014)

RNAi(RNA interference)是在20 世紀(jì)90 年代被發(fā)現(xiàn)的一種由雙鏈RNA(Double strained RNA，dsRNA)誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象，其機(jī)制是通過阻礙特定基因的翻譯或轉(zhuǎn)錄來抑制基因表達(dá)，在進(jìn)化過程中是高度保守的［1］。RNAi 具有4 個重要特征:高特異性、抑制基因表達(dá)的高效性、RNAi 的可擴(kuò)散性和可遺傳性以及沉默信號的高穩(wěn)定性［2-4］。因此，RNA干擾現(xiàn)象自從被發(fā)現(xiàn)以后，迅速成為當(dāng)今生物學(xué)研究的一大熱點(diǎn)。利用RNAi 技術(shù)，能夠擴(kuò)大可操作基因的范圍和突變的種類，對目的基因的表達(dá)具有可控性，為RNAi 在植物功能基因組學(xué)研究以及植物性狀改良方面提供了一個強(qiáng)有力的手段［5］。而番茄是世界范圍內(nèi)的重要經(jīng)濟(jì)作物，同時在植物生物學(xué)研究領(lǐng)域也占有重要地位，因此RNAi 技術(shù)在番茄應(yīng)用中的研究比其他蔬菜作物更廣泛、更深入，并率先在品質(zhì)及抗病性改良方面取得了成功。為此，本研究對RNAi 在番茄基因功能、品質(zhì)改良、抗病研究中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述。

1 RNAi 在番茄基因功能分析方面的應(yīng)用

隨著后基因組時代的到來，植物功能基因組學(xué)已成為生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。高通量測序技術(shù)的成熟使得植物核酸序列信息與日劇增，針對目的基因構(gòu)建siRNA，利用RNAi 技術(shù)關(guān)閉該基因的表達(dá)，根據(jù)表型的改變可以分析基因的功能，因此RNAi 為大規(guī)模功能基因組學(xué)的研究提供了切實(shí)可行的方法，在番茄發(fā)育相關(guān)基因功能研究中也得到了廣泛的應(yīng)用。

1.1 番茄營養(yǎng)器官發(fā)育

張建苓［6］構(gòu)建了SlDEAH1 基因的沉默表達(dá)載體，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因番茄葉片長度明顯短于野生型番茄葉片，葉片大小也明顯小于野生型番茄葉片，表明該基因在番茄葉片發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。Xiao等［7］利用RNA 干涉技術(shù)分別調(diào)控了GA 20-氧化酶的3 個家族成員的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GA20ox1 和GA20ox2 RNAi 轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)半矮化，葉片變小增厚，葉色加深，而GA20ox3 RNAi 轉(zhuǎn)基因植株側(cè)根數(shù)量減少，長度增加，3 個GA20ox 的RNAi 轉(zhuǎn)基因植株均能正常開花結(jié)果，形成正常的種子，說明抑制GA20oxd 表達(dá)對植物營養(yǎng)器官的生長發(fā)育產(chǎn)生影響，而對生殖器官的發(fā)育影響不大。

1.2 番茄生殖器官發(fā)育

王翔等［8］利用RNAi 技術(shù)顯著降低了轉(zhuǎn)基因植株中TAG1 的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)該基因不僅嚴(yán)重影響番茄雄蕊和雌蕊的形態(tài)，還影響果實(shí)的育性。Vrebalov 等［9］利用RNAi 技術(shù)，證明了番茄TAGL1 基因能夠調(diào)控番茄肉質(zhì)果實(shí)膨大及成熟。Dong 等［10］以MADS-box 轉(zhuǎn)錄因子SlMADS1 為靶基因構(gòu)建了RNAi 載體，轉(zhuǎn)基因植株的番茄果實(shí)成熟時間縮短，乙烯產(chǎn)量相比對照植株的果實(shí)也增長了2 ～4 倍，由此證明SlMADS1 作為負(fù)調(diào)控因子參與番茄果實(shí)成熟。De 等［11］針對生長素響應(yīng)因子ARF7 構(gòu)建RNAi載體抑制其表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植株獲得了無籽果實(shí)，為生長素調(diào)控植物的單性結(jié)實(shí)提供了直接證據(jù)。

近年來番茄基因組測序的完成，人們獲得了眾多的候選基因，RNAi 為注釋和認(rèn)識這些基因作用提供了一種快速、高效的鑒定方法，今后越來越多的基因功能將得以確定。

2 RNAi 在番茄品質(zhì)遺傳改良方面的應(yīng)用

番茄因其豐富的營養(yǎng)、獨(dú)特的風(fēng)味和多樣的食用方式而深受人們喜愛。隨著人民生活水平和生活質(zhì)量的提高，番茄品質(zhì)受到越來越多的關(guān)注。RNAi 技術(shù)對目的基因的操作具有可控性，不僅可以縮短育種周期，而且可以特定的改變農(nóng)產(chǎn)品的某些品質(zhì)。因此，利用RNAi 技術(shù)提升番茄品質(zhì)已成為番茄品質(zhì)育種的主要研究方向之一，主要用于提高番茄紅素和維生素C 含量及提高番茄耐貯性等方面的研究。

2.1 RNAi 與番茄紅素積累

番茄紅素的抗氧化性能是天然類胡蘿卜素中最強(qiáng)的，而且在保護(hù)人類健康方面起著非常重要的作用［12-14］。隨著番茄紅素生物合成途徑的闡明以及RNAi 技術(shù)的不斷發(fā)展，在提高番茄果實(shí)中番茄紅素含量方面的研究不僅僅局限于促進(jìn)番茄紅素生物合成酶(PSY、PDS、ZDS)的超量表達(dá)，應(yīng)用RNAi 技術(shù)可介導(dǎo)抑制植物基因的表達(dá)，從而達(dá)到調(diào)控基因的目的。

研究結(jié)果表明，番茄果實(shí)中的光敏色素對果實(shí)成熟過程中番茄紅素積累具有調(diào)節(jié)作用［15］。Liu等［16］利用RNAi 技術(shù)，對光信號傳導(dǎo)基因LeHY5 和LeCOP1LIKE 進(jìn)行調(diào)控，可以大幅度改變番茄果實(shí)的色素積累和營養(yǎng)品質(zhì)。Davuluri 等［17］利用RNAi 技術(shù)，結(jié)合使用果實(shí)特異性啟動子，選擇性抑制了果實(shí)中的DET1 基因的活性，得到的轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中番茄紅素的含量提高了4 倍，且對產(chǎn)量及品質(zhì)未產(chǎn)生不良影響。萬群等［18］通過RNAi 抑制編碼番茄紅素轉(zhuǎn)化酶基因Lcy 的表達(dá)，并結(jié)合果實(shí)特異性啟動子Pds，得到的轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中番茄紅素的平均含量是對照的2.1 倍，最高可增長3.2 倍。馬超等［19］通過RNAi 阻斷番茄紅素β 環(huán)化酶基因Lyc-β來達(dá)到調(diào)控番茄紅素大量積累的結(jié)果，轉(zhuǎn)基因植株中番茄紅素的含量最高可達(dá)13.84 μg/g，F(xiàn)W，是對照的4.26 倍。最近，Sun 等［20］利用RNAi 技術(shù)將編碼9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素加雙氧酶蛋白質(zhì)基因SlNCED1 進(jìn)行了沉默，轉(zhuǎn)基因植株果實(shí)的番茄紅素和β-胡羅卜素均得到了顯著增加。

2.2 RNAi 與番茄耐貯性改良

番茄是呼吸躍變型的果實(shí)，不耐貯藏和運(yùn)輸，果實(shí)成熟后極易變質(zhì)腐爛。利用RNAi 技術(shù)提高果實(shí)耐貯性時，主要是通過兩種途徑延長番茄的存貯期。

第1 種途徑是通過抑制乙烯的產(chǎn)生，主要選擇與乙烯合成有關(guān)的SAM(S-adenosine ammonium sulfate acid)水解酶基因、ACC(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid)合成酶基因、ACC 氧化酶基因、ACC脫氫氨酶基因，從而達(dá)到果實(shí)耐貯的目的。Xiong等［21］根據(jù)ACC 氧化酶基因的序列構(gòu)建RNAi 載體，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)13%的植株沒有表現(xiàn)出RNA 干擾效果，18% 的植株表現(xiàn)出50%的RNA 干擾效果，果實(shí)從破色期到成熟期需要30 d，69%的轉(zhuǎn)化植株表現(xiàn)出100%的RNA 干擾效果，果實(shí)從破色期到成熟期需要120 d，而對照果實(shí)只需5 d。Chen 等［22］用BP 克隆的方法構(gòu)建了番茄ACO(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase)基因的RNAi 載體，獲得轉(zhuǎn)基因植株27 株，內(nèi)源ACO 基因的表達(dá)均得到了抑制，所有轉(zhuǎn)基因植株的乙烯生產(chǎn)量明顯低于對照植株。Gupta 等［23］利用RNAi 技術(shù)，并結(jié)合果實(shí)特異性啟動子2A11 抑制了3 個ACS(1-aminocycloppropane-l-carboxlic acid synthase)基因(ACS6、ACS1A、ACS2)的表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植株果實(shí)從破色期到成熟期延長至45 d，而對照果實(shí)收貨后8 ～10 d 即開始腐爛。

第2 種途徑是通過抑制細(xì)胞壁果膠的降解，主要是選擇與細(xì)胞壁水解有關(guān)基因作為靶基因使其沉默。甘露聚糖酶通過參與細(xì)胞壁降解在番茄成熟過程中發(fā)揮重要作用，Wang 等［24］利用mRNAi 技術(shù)抑制了LeMan4a 基因的表達(dá)，從而抑制了甘露聚糖酶的活性，轉(zhuǎn)基因植株果實(shí)的硬度明顯比對照要高。Meli 等［25］選擇了與果實(shí)成熟過程中特有的N 糖蛋白質(zhì)修飾酶中α-Man 和β-Hex 基因，分別構(gòu)建了RNAi 載體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，含有α-Man-RNAi 的轉(zhuǎn)基因植株的果實(shí)硬度是對照的2.5 倍，含有β-Hex-RNAi的轉(zhuǎn)基因植株的果實(shí)硬度是對照的2 倍，二者的貨架期均延長了大約30 d，而且未對包括產(chǎn)量在內(nèi)的其他表型性狀產(chǎn)生負(fù)面影響。

由此可見，RNAi 技術(shù)能非常有效地抑制靶基因的表達(dá)，是改良番茄耐貯性的有效手段。

2.3 RNAi 與番茄維生素C 改良

番茄中含有豐富的抗壞血酸(即維生素C)，通過基因工程手段調(diào)控植物抗壞血酸合成和代謝，能夠增加其產(chǎn)品的營養(yǎng)品質(zhì)，并增強(qiáng)植物本身對逆境的抗性?？箟难徇^氧化酶(APX)和抗壞血酸氧化酶(AAO)是植物抗壞血酸的氧化代謝途徑中的關(guān)鍵酶。

Zhang 等［26］利用RNAi 技術(shù)減少了線粒體抗壞血酸過氧化物酶mitAPX 基因的表達(dá)，相比對照植株，轉(zhuǎn)基因植株中mitAPX 活性減少了29% ～45%，而抗壞血酸的含量增加了1.4 ～2.2 倍，從而為提高植物抗壞血酸含量提供了一種切實(shí)可行的的方法。

3 RNAi 在番茄抗病方面的應(yīng)用

3.1 抗病毒病

植物病毒病是重要的植物病害，應(yīng)用RNAi 技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對病毒的有效防治。把源自病毒的基因構(gòu)建成反向重復(fù)結(jié)構(gòu)導(dǎo)入植物體，植物會通過RNAi 機(jī)制對病毒轉(zhuǎn)錄的mRNA 進(jìn)行切割降解，從而阻止病毒的復(fù)制擴(kuò)張，進(jìn)而保護(hù)植物體不受病毒危害［27］。

番茄黃化曲葉病毒病是一種在世界范圍內(nèi)暴發(fā)流行的毀滅性病害，危害嚴(yán)重的地區(qū)可導(dǎo)致番茄的全面絕產(chǎn)，已經(jīng)成為世界許多地區(qū)番茄生產(chǎn)上的重要限制因素［28-29］。引起該病害的番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)為單鏈DNA 病毒，具有6 個開放性閱讀框，分別編碼外殼蛋白質(zhì)(CP)、移動蛋白質(zhì)(V2)、復(fù)制相關(guān)蛋白質(zhì)(Rep)、轉(zhuǎn)錄激活蛋白質(zhì)(TrAP)和復(fù)制加強(qiáng)蛋白質(zhì)(REn)［30］。以V1 基因?yàn)榘谢驑?gòu)建siRNAs，利用GFP 作為報告基因，轉(zhuǎn)入micro-tom 番茄中干擾了CP 積累，經(jīng)過煙粉虱接種鑒定，轉(zhuǎn)基因植株49 d后沒有表現(xiàn)出癥狀，而對照植株接種14 d 后就表現(xiàn)出癥狀［31］。以C1 基因的3'端的726 個核苷酸序列形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)入到感病番茄材料Campbell-28中，用來誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后的基因沉默以抑制TYLCV 的復(fù)制，得到的轉(zhuǎn)基因番茄植株對TYLCV 表現(xiàn)出了較好的抗性［32］。將Rep 蛋白質(zhì)基因的5'端部分序列與IR序列相連導(dǎo)入番茄，轉(zhuǎn)基因番茄植株在被TYLCV 侵染后無病癥產(chǎn)生，而且通過PCR 也未檢測到病毒DNA［33］。同時，有研究選用了TYLCV 中開放閱讀框之間的3 個重疊片段C1C2、C2C3、V1V2 分別構(gòu)建了RNAi 載體，獲得的轉(zhuǎn)基因番茄利用TYLCV-Eg 侵染性克隆過量接種10 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含有C1C2 載體的轉(zhuǎn)基因植株抑制病毒的復(fù)制的效果最為理想［34］?？梢娡ㄟ^RNAi 技術(shù)可以干擾TYLCV 的功能基因，阻止病毒功能基因的合成，從而阻礙病毒的合成、組裝和復(fù)制，達(dá)到抗病毒的作用。

番茄花葉病毒(ToMV)是一類世界性分布的植物病毒，侵染番茄后，會使葉片出現(xiàn)黃綠相間、濃淡不均，對番茄的品質(zhì)和產(chǎn)量影響較大。蘇建輝等［35］利用ToMV 的CP、復(fù)制酶區(qū)基因片段，構(gòu)建RNAi 載體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)野生型加工番茄出現(xiàn)系統(tǒng)侵染并嚴(yán)重矮化或植株枯死時，轉(zhuǎn)基因植株一直沒有發(fā)病現(xiàn)象，RT-PCR 也沒有檢測到ToMV 病毒。

馬鈴薯Y 病毒(PVY)主要感染馬鈴薯、番茄、辣椒等作物，感染該病毒一般減產(chǎn)50%左右。有研究結(jié)果表明eIF4E 參與植物病毒互作，影響病毒在寄主中復(fù)制和侵染過程。張余洋等［36］通過RNA 干涉調(diào)控番茄elF4E 表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化番茄對PVY表現(xiàn)較好的抗性，因此通過RNAi 技術(shù)抑制elF4E表達(dá)可提高植物對PVY 的抗性。

3.2 抗真菌病

番茄容易受到真菌性病害的侵染。有研究結(jié)果表明，在病原菌與植物的互作過程中，植物體內(nèi)的雙鏈干涉序列是可以進(jìn)入到病原菌體內(nèi)，盡管進(jìn)入的機(jī)制還不十分清楚［37］。針對病原菌的致病關(guān)鍵基因構(gòu)建干擾載體，并轉(zhuǎn)化到寄主細(xì)胞中，通過病原菌與寄主的互作，RNAi 產(chǎn)物能夠進(jìn)入到病原菌體內(nèi)，從而抑制了致病關(guān)鍵基因的表達(dá)，使病原菌缺乏致病力［38］。目前利用該方法在番茄抗真菌病害研究中還沒有報道。

3.3 抗根結(jié)線蟲

在全世界范圍內(nèi)，根結(jié)線蟲(Meloidogyne spp.)對很多的作物造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙農(nóng)業(yè)的持續(xù)發(fā)展。利用RNA 干涉技術(shù)在植物組織內(nèi)產(chǎn)生dsRNA，線蟲在取食植物細(xì)胞質(zhì)的同時也攝入了dsRNA，從而誘導(dǎo)相應(yīng)基因的沉默，為運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)防治根結(jié)線蟲提供了新的策略。

番茄是多種根結(jié)線蟲的高感病的寄主，利用RNAi 技術(shù)提高番茄對線蟲抗性的報道也逐漸增多。張余洋等［39］選取根結(jié)線蟲寄生相關(guān)的3 個基因作為靶基因分別構(gòu)建RNAi 載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化得到番茄轉(zhuǎn)基因植株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分別干涉Mi-crt和16D10 的轉(zhuǎn)基因植株均獲得了明顯的根結(jié)線蟲抗性，從而證實(shí)利用RNAi 技術(shù)使番茄獲得對線蟲抗性的方法是可行的。Matsuraga 等［40］將南方根結(jié)線蟲POS-1 基因的dsRNA 接種到番茄根部，接著用根結(jié)線蟲侵染根部發(fā)現(xiàn)，根結(jié)線蟲的孵化率與對照組相比明顯降低。可見在植物表達(dá)與昆蟲同源的雙鏈RNA，可以觸發(fā)取食體內(nèi)發(fā)生RNA 干擾，進(jìn)而影響昆蟲生長甚至殺死昆蟲，而且利用RNAi 技術(shù)防治害蟲具有很高的特異性，不會對其他有益昆蟲產(chǎn)生影響。

需要注意的是線蟲的取食管對分子的大小具有篩選的作用，如果選擇的dsRNA 片段過長，可能會超過線蟲取食管所限制的大小，而無法進(jìn)入線蟲體內(nèi)。

4 展望

RNAi 已成為研究基因功能不可或缺的工具。但在利用RNAi 技術(shù)研究基因功能時，最好同步構(gòu)建超表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，通過正向和反向遺傳學(xué)方法來觀察某個基因在植物中的表型，相互驗(yàn)證，從而確定其功能。另外，解析基因的功能必須同時考慮基因及其表達(dá)產(chǎn)物之間的廣泛聯(lián)系和相互作用網(wǎng)絡(luò)，僅僅依靠RNAi 是難于勝任的，還需要與其他技術(shù)的結(jié)合，如RNAi 與基因芯片技術(shù)的結(jié)合，以便了解被沉默基因與其他基因的關(guān)系。

RNAi 技術(shù)作為一種下調(diào)表達(dá)技術(shù)，廣泛應(yīng)用于作物的遺傳改良進(jìn)程中。利用RNAi 技術(shù)獲得的轉(zhuǎn)基因植株，既不存在有功能的基因或蛋白質(zhì)，也不存在轉(zhuǎn)基因mRNA 的積累，較為符合人們對生物安全性的要求。因此，隨著人們對RNAi 技術(shù)研究的不斷深入，該技術(shù)可以創(chuàng)制更多類型的新種質(zhì)，在番茄抗病性、品質(zhì)遺傳改良方面將具有更為廣泛的應(yīng)用前景。

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