氨基酸發(fā)酵工業(yè)中原料替代的思考

李燕軍，范曉光

（天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457）

目前全球氨基酸及其衍生物的種類已經(jīng)超過1000種，全世界氨基酸年產(chǎn)量達600多萬噸，其中谷氨酸及其鹽產(chǎn)量約為300萬噸，排名第二的賴氨酸產(chǎn)量也超過100萬噸。全球行業(yè)分析公司（GIA）發(fā)表的《氨基酸：全球戰(zhàn)略經(jīng)營報告》預(yù)測，到2015年全球氨基酸市值將達116億美元，并以每年6%的速度遞增。我國氨基酸總產(chǎn)量超過300萬噸，成為氨基酸產(chǎn)品的“世界工廠”。目前我國氨基酸發(fā)酵采用的原料主要為糧食淀粉，包括玉米、小麥等，每生產(chǎn)1 t氨基酸約消耗1.25 t折純淀粉。

近年來，全球人口不斷增加，使得糧食需求大增。聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）預(yù)測，到2050年全球人口將增加23億，糧食需求將增長70%，而近十年來，糧食產(chǎn)量年增長率僅為0.5%，供需缺口明顯增加。此外，美國推行的生物乙醇計劃導(dǎo)致世界范圍內(nèi)糧食供給減少，進一步拉大供需缺口。目前我國有13億多人口，預(yù)計到2020年將達到16億，每年需凈增糧食500萬噸，而耕地、水資源等生產(chǎn)條件的約束卻日益突出，糧食進一步增產(chǎn)的難度加大，未來糧食需求大于供給，糧食安全面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。根據(jù)FAO公布的數(shù)據(jù)，2013年我國進口谷物的總量達到2800萬噸，為世界上最大的糧食進口國。為此，中央“十二五”規(guī)劃指出要把保障糧食安全作為首要目標(biāo)，糧食安全是經(jīng)濟安全、社會穩(wěn)定面臨的長期挑戰(zhàn)和戰(zhàn)略課題。

為了應(yīng)對國家糧食戰(zhàn)略需求，從長遠發(fā)展考慮，氨基酸發(fā)酵工業(yè)需不斷開發(fā)非糧植物原料。非糧原料可以大致分為富含糖類植物、富含淀粉類植物和木質(zhì)纖維素類植物。

1 非糧發(fā)酵替代原料

1.1 糖類植物

富含糖類植物主要有甘蔗、甜菜和甜高粱。目前，甘蔗和甜菜制糖工業(yè)的副產(chǎn)物糖蜜作為氨基酸發(fā)酵的碳源已經(jīng)被廣泛使用。

甜高粱（Sorghum bicolor L.Moench）是禾本科高粱屬一年生草本植物，是高粱的一個變種。從海南島至黑龍江都可以種植甜高粱，每公頃甜高粱能夠產(chǎn)出2250～6000 kg糧食和60～75 t富含糖分的莖稈。甜高粱由于抗逆性強，可以在邊際性土地上種植，不與糧爭地。另外，甜高粱籽粒本身就是糧食，將一部分耕地種植甜高粱不會影響我國的糧食安全。甜高粱作為生產(chǎn)燃料乙醇的原料已經(jīng)受到廣泛的關(guān)注，早在“七五”計劃就被列為國家重點科技攻關(guān)課題。然而，甜高粱莖稈中的糖分不耐儲存，成為制約其普遍應(yīng)用的瓶頸。筆者認(rèn)為，利用甜高粱汁液發(fā)酵氨基酸可以借鑒丹麥AgroFerm公司的成功經(jīng)驗。在丹麥，飼料加工商在將綠色牧草（包括黑麥、三葉草和苜蓿等）干燥成粒之前，為了降低能耗，往往先用蒸汽加熱牧草至80°C左右，然后將部分汁液擠出。丹麥一年能產(chǎn)生大約20萬立方米這樣的黃色汁液，干物質(zhì)含量約為6%，其中含33%的糖類物質(zhì)和26%的蛋白[1]。為了便于黃色汁液的儲運，接種乳酸菌，如唾液乳桿菌（Lactobacillus salivarius）進行乳酸發(fā)酵，汁液中所有糖類都被轉(zhuǎn)化成乳酸，pH降至4.0～4.5之間，能夠在厭氧條件下穩(wěn)定保存。這種乳酸液是谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）優(yōu)良的發(fā)酵底物，其中的乳酸等有機酸和氨基酸很容易被谷氨酸棒桿菌利用。并且，由于乳酸菌已經(jīng)將谷氨酸棒桿菌不可利用的成分轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵的小分子物質(zhì)，利用酸液發(fā)酵能夠產(chǎn)生更高濃度的菌體和產(chǎn)物[2]。AgroFerm公司利用這種酸液年產(chǎn)賴氨酸1.25萬噸，基本能夠滿足丹麥?zhǔn)袌龅男枨?。除甜高粱外，玉米采收后的青秸稈、芒草和柳枝稷等高生物量青草也可以采用此法發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸。

1.2 淀粉質(zhì)原料

淀粉是植物體內(nèi)貯藏的高分子碳水化合物，它可以分解成葡萄糖、麥芽糖等成分。富含淀粉的植物種類很多，我國約有400多種。下面介紹幾種較重要的淀粉資源：木薯、橡子、葛根和魔芋。

木薯（Manihot esculenta Crantz）屬大戟科木薯屬植物，是灌木狀多年生木質(zhì)作物，與馬鈴薯、紅薯并稱世界三大薯類。由于我國糧食安全的重要性，薯類作物中，木薯被認(rèn)為是當(dāng)前較適宜種植在華南邊際性土地的非糧作物。木薯淀粉水解糖在我國廣西、東南亞國家如泰國、老撾、柬埔寨、越南、緬甸等被廣泛應(yīng)用于氨基酸發(fā)酵工業(yè)[3]。早在上世紀(jì)70年代，廣西輕工業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院就以木薯淀粉糖和糖蜜為原料發(fā)酵生產(chǎn)賴氨酸，在南寧、梧州分別建立了20 m3、30 m3發(fā)酵罐的賴氨酸生產(chǎn)車間[4]。木薯與其他作物相比，成本低、轉(zhuǎn)化率高、適應(yīng)性廣。具體表現(xiàn)為：一方面，木薯能夠利用少量的光、熱、水等能源轉(zhuǎn)化為高含量的淀粉；另一方面，木薯對各種惡劣環(huán)境抵抗力強，多數(shù)品種對大風(fēng)、干旱、貧瘠、病蟲等災(zāi)害都具有一定的抵抗力。

橡子是殼斗科（Fagaceae）植物果實的通稱。殼斗科植物一般為落葉或常綠喬木，我國的橡子林共有 1.33×107～1.67×107hm2， 每年可產(chǎn) 60～70萬噸橡子。

橡子淀粉是主要的橡子加工產(chǎn)品。橡子淀粉顆粒呈橢圓形，粒徑較玉米淀粉、木薯淀粉小，糊化溫度高于玉米淀粉和木薯淀粉，總體糊化特性與玉米淀粉相似。橡子淀粉具有廣泛的用途，用于制備淀粉糖，轉(zhuǎn)化率可達95%[5]。

葛根為豆科（Fabaceae）多年生纏繞藤本植物葛藤（Argyreia seguinii）的塊根。葛根中含有優(yōu)質(zhì)淀粉、人體必需氨基酸（賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸等）和微量元素（硒、鋅、錳、鍺等）。葛根淀粉具有糊化溫度低、淀粉糊透明度高、黏度穩(wěn)定性強等特點，目前葛根淀粉多應(yīng)用于食品領(lǐng)域，尚未見應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)的報道。

魔芋 （Amorphophalms konjac）是天南星科（Amceae）多年生草本植物。魔芋富含葡甘聚糖、淀粉、纖維素和維生素等，魔芋最主要成分是葡甘聚糖，其含量通?？筛哌_70%，其次是淀粉。葡甘聚糖和淀粉都可作為氨基酸發(fā)酵的底物。我國是世界最大的魔芋生產(chǎn)國，主要加工產(chǎn)品為魔芋精粉，其下腳料魔芋飛粉占精粉質(zhì)量的30%～40%，主要用作豬飼料。僅湖北省每年就有約8萬噸魔芋飛粉未被利用，飛粉中90%是淀粉，通過微生物發(fā)酵可提高其附加值。

除了以上介紹的幾種淀粉植物外，非糧淀粉質(zhì)原料還有涼粉草、菊芋、芭蕉芋、薏苡、芡實、菱角、慈姑和荸薺等。

1.3 木質(zhì)纖維素資源

其實無論是富含糖類的植物，還是淀粉類植物，都只是針對其特殊器官而言，從整株植物來說，都可以稱為木質(zhì)纖維素資源。生物質(zhì)是指由光合作用產(chǎn)生的一切有機物的統(tǒng)稱，包括植物、微生物以及食用植物、微生物的動物及其產(chǎn)生的廢棄物。植物生物質(zhì)絕大多數(shù)屬于木質(zhì)纖維素，包括農(nóng)作物、雜草、木材、農(nóng)林廢棄物（秸稈、木屑等）、廢紙張等。木質(zhì)纖維素是地球上最為豐富的可再生資源，全球每年由光合作用產(chǎn)生的木質(zhì)纖維素總量約為1000億噸，其中碳水化合物占75%，隨著社會需求和技術(shù)進步，終將會成為可發(fā)酵糖的主要來源。

1.3.1 木質(zhì)纖維素組成

木質(zhì)纖維素主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成，不同來源植物的化學(xué)組成受遺傳和環(huán)境的影響，存在一定的變化。除了這3大類組分外，木質(zhì)纖維素還包含其他結(jié)構(gòu)聚合物，如蠟質(zhì)、蛋白等。纖維素分子是由許多吡喃型的β-D-葡萄糖分子以β-1,4-糖苷鍵連接而成的長鏈高聚物，構(gòu)成了木質(zhì)纖維素的骨架結(jié)構(gòu)。半纖維素提供了纖維素鑲嵌的基質(zhì)，也是由長鏈的多糖分子構(gòu)成，除了己糖外，含有大量的戊糖。不同植物半纖維素糖類組成差異很大，主要由木葡聚糖、木聚糖、葡甘聚糖和甘露聚糖4種多聚物組成，水解后的單體有葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖等。木質(zhì)素常與半纖維素、纖維素鑲嵌在一起，不易分開。木質(zhì)素一個基本的功能是提供機械支持作用，因此木本植物的木質(zhì)素含量比草本植物要高。半纖維素和木質(zhì)素可以共價結(jié)合在一起形成木質(zhì)素糖類復(fù)合體（Lignin-carbohydrate complex），增加了纖維素的強度，并抵抗微生物對纖維素的降解。同時，纖維素、半纖維素、木質(zhì)素與蛋白質(zhì)、酸類等其他物質(zhì)之間相互交聯(lián)成致密的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。

1.3.2 木質(zhì)纖維素預(yù)處理

木質(zhì)纖維素復(fù)雜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)天然具有抵抗微生物及酶降解的特性，因此，其糖化比淀粉要困難的多，在酶解之前必須要經(jīng)過一定的預(yù)處理步驟。對于生物質(zhì)預(yù)處理多采取試錯的手段，缺乏系統(tǒng)的理論指導(dǎo)，也可能由于不同原材料、不同工藝的復(fù)雜性決定了預(yù)處理的多樣性。目前該領(lǐng)域的研究和應(yīng)用非?；钴S，我們對各種預(yù)處理方法進行了比較分析，認(rèn)為有發(fā)展?jié)摿Φ挠袦責(zé)幔℉ydrothermal）預(yù)處理和化學(xué)（Chemical）預(yù)處理，以及由二者整合而成的熱化學(xué)（Thermochemical）預(yù)處理。溫?zé)犷A(yù)處理主要包括蒸汽爆破預(yù)處理和水熱預(yù)處理，化學(xué)預(yù)處理有稀酸、稀堿、有機溶劑和氧化預(yù)處理等。經(jīng)過合適的預(yù)處理手段，木質(zhì)纖維素3組分之間的交聯(lián)結(jié)構(gòu)部分解除，纖維素結(jié)晶結(jié)構(gòu)遭到破壞，較大部分半纖維素發(fā)生降解，部分木質(zhì)素被去除，不但減弱了木質(zhì)纖維素對酶類的抗降解屏障，同時增加了酶分子與底物的可及性，使得用酶量減少，糖化得率增加。

1.3.3 木質(zhì)纖維素酶解

木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，決定了降解木質(zhì)纖維素的酶類也復(fù)雜多樣。纖維素酶是一類復(fù)雜酶系的總稱，根據(jù)其催化功能可分為3大類：外切葡聚糖酶 （纖維素外切酶，也叫纖維二糖水解酶CBH）、內(nèi)切葡聚糖酶（纖維素內(nèi)切酶，簡稱EG）和β-葡萄糖苷酶（BGL）。半纖維素組分復(fù)雜多樣，決定了半纖維素的酶解需要多種酶的協(xié)同作用。降解木聚糖主鏈的酶有木聚糖酶和β-木糖苷酶，木聚糖支鏈酶主要包括阿魏酸酯酶、葡萄糖醛酸酶、乙酰酯酶和阿拉伯呋喃糖苷酶。同樣，葡甘聚糖完全水解也需要聚甘露糖酶和β-甘露糖苷酶的協(xié)同作用。木質(zhì)素酶主要包括木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶。

徹底降解結(jié)晶纖維素至少需要3類纖維素酶的協(xié)同作用：外切酶可以從纖維素鏈的還原端（CBH I）或非還原端（CBH II）開始持續(xù)水解纖維素結(jié)晶區(qū)，釋放纖維二糖；內(nèi)切酶主要作用于纖維素的非結(jié)晶區(qū)，隨機水解纖維素鏈內(nèi)的β-糖苷鍵，把纖維素長鏈切割為不同聚合度的短鏈，為外切酶作用提供更多的末端；β-葡萄糖苷酶主要水解纖維二糖和可溶性纖維寡糖，最終把纖維素轉(zhuǎn)化為可利用的葡萄糖。近年來，由于纖維素乙醇項目的推動，纖維素酶的成本大幅降低，但仍占纖維素乙醇總成本的1/4左右。諾維信公司最新推出的第三代纖維素酶CellicRCTec3催化效率為第二代酶的1.5倍，水解玉米秸稈等木質(zhì)纖維素產(chǎn)生1噸葡萄糖約需要28 kg酶量，獲得每噸葡萄糖的總成本在3400～4500元之間。

2 原料替代需重視生物煉制

隨著石化資源的不斷消耗和環(huán)境問題的日益突出，使用綠色可再生的生物質(zhì)原料進行“生物煉制”來生產(chǎn)各種產(chǎn)品，逐步代替現(xiàn)有的“石化煉制”已成為共識，為全世界長期堅持的發(fā)展目標(biāo)。在此背景下，“綠色化工”、“綠色生產(chǎn)”、“綠色經(jīng)濟”、“循環(huán)經(jīng)濟”等概念應(yīng)運而生。生物煉制最初的定義是指能夠利用和加工生物質(zhì)生產(chǎn)液體燃料、能源和化學(xué)品的設(shè)備裝置和技術(shù)平臺的組合，現(xiàn)在被普遍接受的概念是指將生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為一系列產(chǎn)品的可持續(xù)加工過程，這些產(chǎn)品包括化學(xué)品、生物能源和生物材料。

為了發(fā)展非糧替代原料，氨基酸發(fā)酵工業(yè)需納入到生物煉制的框架中來，以全局的理念來思考、系統(tǒng)工程的理論來指導(dǎo)。理由如下：首先，生物煉制的實現(xiàn)很大程度上依賴于發(fā)酵產(chǎn)業(yè)，氨基酸發(fā)酵是發(fā)酵工業(yè)的重要組成部分；其次，非糧原料本身的特性決定了處理工藝的復(fù)雜性和加工產(chǎn)品的多樣性，野生植物資源和木質(zhì)纖維素原料結(jié)構(gòu)復(fù)雜，用現(xiàn)行的糧食加工工藝難以滿足需求；第三，走生物煉制道路、對原料進行綜合利用，是企業(yè)降低成本、減少污染的必由之路。

2.1 野生資源高附加值產(chǎn)品的提取

與糧食原料相比，野生植物資源淀粉含量較低，但往往包含一些具有其他重要價值的成分，若加以提取、開發(fā)高附加值產(chǎn)品，等同于降低企業(yè)的生產(chǎn)成本。反之，若走單一原料處理路線，可能會給加工和發(fā)酵過程帶來困難，同時造成污染。下面將列舉一些具體事例。

在木薯產(chǎn)業(yè)中，除淀粉外，木薯葉、木薯渣、木薯桿也是重要的資源，有待綜合開發(fā)利用。如印度尼西亞的科研人員采用木薯皮制備表面活性碳，具體工藝是：先將木薯皮在氫氧化鉀溶液中浸漬，接著在450～750°C的溫度下碳化1～3 h[6]。另外，以木薯葉為原料加工的休閑食品也已問世。

橡子中含有較高濃度的單寧（4.55%），丹寧是重要的鞣質(zhì)，廣泛使用于印染行業(yè)。目前國內(nèi)橡子淀粉生產(chǎn)多采用濕法，且大多仍采用傳統(tǒng)工藝技術(shù)，所生產(chǎn)的橡子淀粉中單寧及其他雜質(zhì)高，淀粉的產(chǎn)率和產(chǎn)量低，使得經(jīng)濟效益受到嚴(yán)重影響，而且用水量大，廢水處理壓力大，易造成環(huán)境污染。采用清潔工藝，可以同時從橡子殼（皮）中提取出丹寧和多羥基黃酮類色素物質(zhì)，增加經(jīng)濟效益。另一方面，丹寧、黃酮類物質(zhì)為典型的微生物發(fā)酵抑制物，若不提取，會對橡子淀粉糖的發(fā)酵產(chǎn)生抑制作用。

葛根、葛藤葉中含有12%異黃酮類化合物，主要包括：大豆苷元、大豆苷和葛根素。這些黃酮類化合物具有多種藥理作用，能夠降低心肌耗氧量，使冠脈、腦血管流量增加，明顯緩解心絞痛，抗心律失常，抗氧化，增強機體的免疫力和降血糖。目前葛根黃酮類化合物作為藥物和保健食品的應(yīng)用越來越廣泛。因此，在加工葛根淀粉的同時，提取高附加值的葛根黃酮非常必要。

魔芋中的葡甘聚糖具有束水性、膠凝性、增稠性、粘結(jié)性、可逆性、懸浮性、成膜性、賦味性等多種特性，因此在食品、醫(yī)藥、化工、紡織、印染、造紙、石油、地質(zhì)等領(lǐng)域有著廣泛的用途。魔芋葡甘聚糖的水溶膠在適當(dāng)條件下成膜，可作為一種可食性和自然降解的膜材料，能在食品表面形成抗菌膜，起到保鮮防菌的作用。魔芋葡甘聚糖在生物工程上可制成膠質(zhì)，用于電泳分離。

2.2 木質(zhì)纖維素生物煉制

木質(zhì)纖維素原料組分復(fù)雜、結(jié)構(gòu)致密，尋找合適的預(yù)處理和組分分離手段是進行生物煉制的關(guān)鍵。我國是農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)作物秸稈資源豐富，大量焚燒秸稈不但造成了環(huán)境污染，同時浪費了資源。為此，中國科學(xué)院過程工程研究所陳洪章研究員課題組在國家“973”計劃“秸稈資源高值化關(guān)鍵過程的基礎(chǔ)研究”的資助下，進行了系統(tǒng)深入的研究，建立了秸稈初級生物煉制平臺。發(fā)明了常壓無污染蒸汽爆破（汽爆）技術(shù)，特別適合孔隙度較大的秸稈類草本植物的處理。汽爆可分成兩個階段，首先是汽相蒸煮，高壓蒸汽滲透到物料內(nèi)的空隙，使半纖維素降解成可溶性糖，同時木質(zhì)素軟化和部分降解，降低與纖維素的連結(jié)強度；其次是爆破過程，利用汽相飽和蒸汽和高溫液態(tài)水兩種介質(zhì)共同作用于物料，瞬間完成絕熱膨脹過程，使物料在軟化條件下產(chǎn)生剪切力發(fā)生變形運動。同時在汽爆過程中，半纖維素降解釋放乙酸等有機酸，使物料發(fā)生自體催化作用。在以汽爆為基礎(chǔ)的組分分離技術(shù)支撐下，陳洪章研究員團隊實現(xiàn)了秸稈的多級分層綜合利用，獲得了乙醇、丁醇、醋酸纖維素、羧甲基纖維素、瓦楞紙、聚醚多元醇、酚醛樹脂等多種產(chǎn)品。于2010年在吉林省松原來禾化學(xué)有限公司建成 “30萬噸/年秸稈煉制工業(yè)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)線”，設(shè)計能力為年產(chǎn)丁醇、丙酮、乙醇5萬噸，高純度木質(zhì)素3萬噸，纖維素12萬噸。目前該項目年處理秸稈500萬噸，生產(chǎn)丁醇100萬噸。

將木質(zhì)纖維素水解為可發(fā)酵的單糖，可以通過“糖平臺”路線作為氨基酸發(fā)酵的原料。然而也需要借鑒生物煉制的思路，不能為了獲得可發(fā)酵糖分子，一味地加酶進行水解，既造成了浪費，也降低了效率。比較理想的路線是先用汽爆或稀酸預(yù)處理木質(zhì)纖維素獲得半纖維素水解液，再用堿萃取固形物獲得木質(zhì)素，最后加酶將纖維素水解為可發(fā)酵糖分子。在預(yù)處理過程中，大約有80%～90%的半纖維素降解成為葡萄糖、木糖、阿拉伯糖等可利用單糖，在去除半纖維素和木質(zhì)素之后，纖維素由于沒有其他分子纏繞，同時結(jié)晶結(jié)構(gòu)也遭到一定程度的破壞，其酶解過程變得容易得多。大量研究證實，木質(zhì)素會對纖維素酶產(chǎn)生無效吸附，去除之后可以降低用酶量，增加酶分子對纖維素的可及性。同時，木質(zhì)素本身是十分重要的產(chǎn)品，可以用來加工高附加值的樹脂、粘合劑和涂料等。

2.3 復(fù)雜培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)酶

以非糧原料制得的培養(yǎng)基成分比較復(fù)雜，含有多種碳源、氮源、微量元素、生長因子等，更加適合培養(yǎng)微生物菌體和產(chǎn)酶。木質(zhì)纖維素水解液中，同時含有己糖（葡萄糖、半乳糖和甘露糖）和戊糖（木糖和阿拉伯糖），多種糖類共存不利于快速發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸，但有利于菌體積累和蛋白合成，同時由于葡萄糖濃度低，生成的副產(chǎn)物有機酸要少。氨基酸工業(yè)中，酶法合成占有重要的位置，如苯丙氨酸、蛋氨酸、纈氨酸、天冬氨酸和半胱氨酸都可以通過酶法生產(chǎn)。另外，一些特殊氨基酸（如非蛋白L-氨基酸、D-氨基酸、β-氨基酸）和氨基酸衍生物主要通過酶法合成。酮基丁酸、羥基丁酸、叔亮氨酸、鳥氨酸、瓜氨酸等需要通過酶法催化合成。拆分DL-氨基酸的重要的酶有氨基酰化酶和羧肽酶等，海因酶可以用于生產(chǎn)天然或非天然的α-或β-氨基酸，可以催化合成光學(xué)純的L-或D-氨基酸，阿斯巴甜 （L-天冬酰胺-L-苯丙氨酸甲酯）是由蛋白酶連接而成?？傊?，在發(fā)酵法生產(chǎn)蛋白氨基酸的同時，酶催化將成為非蛋白氨基酸和氨基酸衍生物生產(chǎn)的主要方式。今后可以開發(fā)多種非糧植物原料，用于培養(yǎng)微生物合成酶蛋白，滿足酶法生產(chǎn)氨基酸的需求。

3 與原料替代相適應(yīng)的菌株改造

通常，淀粉原料需經(jīng)過糖化步驟被分解為葡萄糖，才能作為氨基酸發(fā)酵的底物。近年來，科學(xué)家們借鑒檸檬酸發(fā)酵的思路，嘗試將淀粉酶轉(zhuǎn)入到氨基酸發(fā)酵菌株中，直接以淀粉為底物進行發(fā)酵。木質(zhì)纖維素水解液是一系列復(fù)雜糖類的組合，包括二糖單元的纖維二糖和乳糖，己糖（葡萄糖、半乳糖、甘露糖等）和戊糖。其中，除主要成分葡萄糖外，含有較高濃度的戊糖：5%～20%木糖和1%～5%阿拉伯糖。自然界的微生物以葡萄糖為最適底物，通常難以利用其他糖類。在生物乙醇項目推動下，以代謝工程手段改造酵母菌株擴大其可利用的碳源譜，已經(jīng)進行了比較系統(tǒng)的研究。最近，也出現(xiàn)了一些對大宗氨基酸發(fā)酵菌株谷氨酸棒桿菌和大腸桿菌相關(guān)代謝工程改造方面的報道。

3.1 直接利用淀粉

淀粉糖化步驟雖然高效，但需要高溫蒸煮，能耗高，投入的液化酶和糖化酶用量大。通過微生物菌株改造，直接利用淀粉發(fā)酵可降低能耗和生產(chǎn)成本。Seibold等[7]在谷氨酸棒桿菌中構(gòu)建重組質(zhì)粒表達來源于灰色鏈霉菌 （Streptomyces griseus）的α-淀粉酶，使得菌株能夠表達和分泌淀粉酶，以可溶性淀粉為底物合成賴氨酸。Tateno等[8]在谷氨酸棒桿菌基因組上整合表達異源α-淀粉酶，實現(xiàn)了直接利用粗淀粉高效發(fā)酵賴氨酸的生產(chǎn)工藝。 他們將牛鏈球菌（Streptococcus bovis）α-淀粉酶基因構(gòu)建到幾個基因的啟動子及信號肽序列下，通過蛋白表達量的優(yōu)化，最終選擇將含有冷激蛋白CspB基因啟動子的融合基因整合到谷氨酸棒桿菌基因組中，工程菌株以玉米淀粉或小麥淀粉為唯一碳源，發(fā)酵獲得了5 g/L左右的賴氨酸產(chǎn)量。

3.2 直接利用纖維素

直接利用纖維素原料發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸的技術(shù)難度很高，需要表達、分泌多種異源蛋白并協(xié)調(diào)其配比，同時兼顧蛋白合成和目標(biāo)氨基酸合成的代謝途徑。但是也有少量的相關(guān)研究報道。Paradis等[9]從糞產(chǎn)堿纖維單胞菌（Cellulomonas fimi）中克隆了外切葡聚糖酶Cex和內(nèi)切葡聚糖酶CenA編碼基因，構(gòu)建了大腸桿菌和乳糖發(fā)酵短桿菌（Brevibacterium lactofermentum）穿梭質(zhì)粒，實現(xiàn)了兩個纖維素酶基因在這兩種菌株中的表達。乳糖發(fā)酵短桿菌是氨基酸生產(chǎn)菌，可以發(fā)酵產(chǎn)生谷氨酸、賴氨酸、蘇氨酸和異亮氨酸。采用相似的方法，Adham等[10]實現(xiàn)了霍耳斯特德氏鏈霉菌（Streptomyces halstedii）來源的木聚糖酶xysA和纖維素酶celA1編碼基因在大腸桿菌和乳糖發(fā)酵短桿菌中的表達和分泌。2011年，Tsuchidate等[11]將熱纖梭菌（Clostridium thermocellum）內(nèi)切葡聚糖酶基因celA連接在大腸桿菌信號肽TorA下，在谷氨酸棒桿菌中表達；重組菌株在外源添加β-葡萄糖苷酶的條件下以15 g/L葡聚糖為底物進行發(fā)酵，獲得了178 mg/L谷氨酸。受細(xì)菌纖維小體（Cellulosome）結(jié)構(gòu)的啟發(fā)，Hyeon等[12]在谷氨酸棒桿菌中構(gòu)建了一個包含內(nèi)切葡聚糖酶celE和腳手架蛋白CbpA的微型纖維小體，其催化羧甲基纖維素降解的效率是相應(yīng)游離酶的2.8倍。其中，內(nèi)切葡聚糖酶celE是由熱纖梭菌celE的催化骨架和食纖維梭菌 （Clostridium cellulovorans）celB的對接結(jié)構(gòu)域組成的嵌合蛋白，CbpA也來源于食纖維梭菌，這一結(jié)果為谷氨酸棒桿菌采用統(tǒng)合生物工藝（CBP）一步法發(fā)酵纖維素原料生產(chǎn)氨基酸奠定了基礎(chǔ)。盡管取得了上述進展，但直接利用纖維素發(fā)酵氨基酸還有很長的路要走，短期內(nèi)難以取得較大突破。

3.3 利用混合糖（戊糖利用）

同步利用己糖和戊糖，是木質(zhì)纖維素水解液發(fā)酵工程中菌株改造的重要內(nèi)容。木質(zhì)纖維素水解液中的糖類主要包括葡萄糖、木糖和阿拉伯糖。葡萄糖容易被多種微生物利用，而大多數(shù)微生物則難以利用木糖和阿拉伯糖。因此，戊糖代謝的菌種改造是氨基酸發(fā)酵領(lǐng)域中利用木質(zhì)纖維素資源的關(guān)鍵問題。大腸桿菌本身可以利用木糖和阿拉伯糖，其代謝木糖的途徑為：在木糖異構(gòu)酶（Xylose isomerase）作用下，將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖，然后在木酮糖激酶（Xylulokinase）作用下生成木酮糖-5-磷酸，進入磷酸戊糖途徑。阿拉伯糖的代謝也是經(jīng)過木酮糖-5-磷酸進入磷酸戊糖途徑，然而它需要在3種酶：核酮糖激酶（Ribulosekinase）、阿拉伯糖異構(gòu)酶（Arabinosei somerase）和核酮糖-5-磷酸差向異構(gòu)酶 （Ribulose-5-phosphate-4-epimerase）的作用下才能被轉(zhuǎn)化為木酮糖-5-磷酸[13]。谷氨酸棒桿菌是利用木質(zhì)纖維素水解液極具潛力的菌種，它不但能夠利用淀粉水解糖中的葡萄糖、糖蜜中的蔗糖和果糖，同時能夠利用麥芽糖和核糖，以及水解液中的有機酸如乙酸、丙酸等。另外，谷氨酸棒桿菌對木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)生的一些常見發(fā)酵抑制劑糠醛類和酚類化合物具有抗性。然而，谷氨酸棒桿菌自身不能利用木糖和阿拉伯糖，需要采用基因工程手段引入大腸桿菌等微生物的戊糖代謝途徑，才能發(fā)酵半纖維素水解產(chǎn)生的戊糖。2008年，Kawaguchi等[15]在谷氨酸棒桿菌中異源表達大腸桿菌的araA，araB和araD基因，重組菌株能夠以阿拉伯糖為唯一碳源生長。當(dāng)額外表達阿拉伯糖轉(zhuǎn)運基因araE時，菌株利用阿拉伯糖的生長速率加快[16]。因為谷氨酸棒桿菌本身能夠編碼木酮糖激酶[17]，因此只要異源表達木糖異構(gòu)酶基因xylA，就能實現(xiàn)以木糖為唯一碳源的生長[18]。然而，Meiswinkel等[19]同時表達了外源的木糖異構(gòu)酶和木酮糖激酶基因，谷氨酸棒桿菌在木糖培養(yǎng)基上生長速率增加了一倍，該菌株還能利用稻草水解液生成少量谷氨酸和賴氨酸。

外切葡聚糖酶和內(nèi)切葡聚糖酶水解纖維素的底物主要為纖維二糖，需要在β-葡萄糖苷酶的作用下才能被徹底水解為葡萄糖。現(xiàn)有商品化的纖維素酶主要來源于瑞氏木霉，β-葡萄糖苷酶含量較低，因此纖維素酶解產(chǎn)物中含有較高濃度的纖維二糖。2013年，Adachi等[20]在谷氨酸棒桿菌細(xì)胞表面過表達β-葡萄糖苷酶，重組菌株以纖維二糖為碳源生長，獲得了與葡萄糖為底物相當(dāng)?shù)木w濃度，在20 g/L纖維二糖培養(yǎng)基中發(fā)酵4 d，產(chǎn)生了1.08 g/L賴氨酸。與大腸桿菌相比，谷氨酸棒桿菌被證實具有較弱的葡萄糖效應(yīng)，能夠同步利用多種糖類發(fā)酵。Gopinath等[21]在谷氨酸棒桿菌中異源表達大腸桿菌araBAD操縱子和木糖異構(gòu)酶基因xylA，工程菌株在葡萄糖、木糖和阿拉伯糖復(fù)配的培養(yǎng)基中，或在稻草和麩皮水解液培養(yǎng)基中，同步代謝3種糖類產(chǎn)生谷氨酸和賴氨酸。Sasaki等[22]構(gòu)建的能夠代謝纖維二糖和木糖的谷氨酸棒桿菌工程菌株，在葡萄糖存在的條件下也是同步利用3種碳源。

3.4 利用其他原料

乳清是奶制品工業(yè)的副產(chǎn)物，乳清中含有大量的乳糖，為氨基酸發(fā)酵工業(yè)潛在的重要原料。然而，谷氨酸棒桿菌自身沒有代謝乳糖的酶類。Barrett等[23]在谷氨酸棒桿菌中異源表達德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）來源的乳糖代謝酶，包括乳糖透性酶和β-半乳糖苷酶，同時表達乳酸乳桿菌（Lactobacillus lactis）來源的4種半乳糖代謝酶類，獲得了能夠利用乳清培養(yǎng)基的菌株，發(fā)酵賴氨酸產(chǎn)量可達2 g/L。

幾丁質(zhì)（Chitin）又稱殼多糖，甲殼素，為N-乙酰葡糖胺通過β連接聚合而成的結(jié)構(gòu)同多糖。廣泛存在于甲殼類動物的外殼、昆蟲的甲殼和真菌的胞壁中，也存在于一些綠藻中，是自然界中儲量僅次于纖維素的第二大天然多糖，每年能產(chǎn)生大約1億噸。幾丁質(zhì)降解后的產(chǎn)物為N-乙酰葡萄糖胺和脫乙?；陌被咸烟牵℅lucosamine），既可作為發(fā)酵的碳源，同時也是氮源。通常，谷氨酸棒桿菌代謝氨基葡萄糖的速率緩慢。Uhde等[24]篩選到一株代謝氨基葡萄糖速率與葡萄糖相仿的谷氨酸棒桿菌，研究發(fā)現(xiàn)其nagB基因啟動子區(qū)域發(fā)生了一個點突變，nagB編碼6-磷酸葡萄糖胺脫氨酶。氨基葡萄糖的代謝途徑是首先在具通透酶活性的特異性磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng) （PTS）作用下，跨膜轉(zhuǎn)運的同時發(fā)生磷酸化生成6-磷酸葡萄糖胺，然后在脫氨酶作用下生成果糖-6-磷酸，進入糖酵解途徑。由此可見，該點突變導(dǎo)致nagB的過量表達，從而使得菌株能夠以氨基葡萄糖為底物迅速生長。因此，可以借鑒上述構(gòu)建谷氨酸棒桿菌工程菌株，以幾丁質(zhì)降解物氨基葡萄糖為底物，發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸產(chǎn)品。

4 結(jié)語

氨基酸發(fā)酵在整個發(fā)酵工業(yè)中占據(jù)重要的地位，隨著氨基酸及其衍生物應(yīng)用范圍的不斷擴大，氨基酸發(fā)酵工業(yè)呈現(xiàn)逐年遞增的態(tài)勢。目前氨基酸發(fā)酵主要以糧食為原料，對我國的糧食安全造成一定的威脅，因此拓展原料來源、尋求替代原料成為重要的課題?？勺鳛榘l(fā)酵原料的植物資源有富含糖類植物、淀粉質(zhì)植物和木質(zhì)纖維素?，F(xiàn)有的社會環(huán)境需求和技術(shù)條件下，利用上述替代原料發(fā)酵氨基酸成本較高。然而，企業(yè)如能因地制宜，就近取材，在生物煉制概念的指導(dǎo)下，對特色野生植物資源進行綜合開發(fā)，發(fā)酵氨基酸的同時獲得高附加值的產(chǎn)品，既能降低成本，又減少了污染，可能形成具有競爭力的產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)，同時帶動地方經(jīng)濟的發(fā)展。從長遠來看，木質(zhì)纖維素的利用為必然趨勢，因為石化資源枯竭之后，縱然能夠開發(fā)太陽能、風(fēng)能、水能、地?zé)崮艿榷喾N替代能源，但人們?nèi)粘Ｉ钪惺褂玫牟牧系膩碓粗挥心举|(zhì)纖維素，只能通過生物煉制生產(chǎn)各種生物基材料。因此，政府應(yīng)該制定相應(yīng)政策，加大經(jīng)費投入來鼓勵木質(zhì)纖維素資源利用的基礎(chǔ)研究和產(chǎn)業(yè)開發(fā)。其中，通過代謝工程手段改造微生物菌株，同步利用木質(zhì)纖維素水解液中的己糖和戊糖，發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸產(chǎn)品，同時將本身難以降解又對綠色工藝造成影響的木質(zhì)素提純并加以利用，將是極具發(fā)展?jié)摿Φ漠a(chǎn)業(yè)模式。另外，木質(zhì)纖維素利用過程中原料的預(yù)處理、酶解以及發(fā)酵工藝是一個統(tǒng)一的整體，應(yīng)該用系統(tǒng)學(xué)的概念前后對應(yīng)、統(tǒng)籌兼顧，實現(xiàn)過程集成和綠色生產(chǎn)。我們相信，在政府、科研人員和企業(yè)的通力合作下，經(jīng)過長期堅持和努力，氨基酸發(fā)酵工業(yè)將在以綠色、可再生生物質(zhì)為原料的循環(huán)經(jīng)濟產(chǎn)業(yè)圈中扮演重要的角色。

[1]ANDERSEN M,KIEL P.Integrated utilisation of green biomass in the green biorefinery[J].Industrial Crops and Products,2000,11(2):129-137.

[2]ANDERSEN M,KIEL P.Method for treating organic waste materials:Europe,WO 00/56912[P].1999.

[3]HERMANN T.Industrial production of amino acids by coryneform bacteria[J].Journal of Biotechnology,2003,104(1):155-172.

[4]庾岳峰．利用我區(qū)糖蜜、木薯資源發(fā)展氨基酸工業(yè)[J]．廣西科學(xué)院學(xué)報，1986，S1：85-87．

[5]張志健，王勇．我國橡子資源開發(fā)利用現(xiàn)狀與對策[J]．氨基酸和生物資源，2009，31(3)：10-14．

[6]SUDARYANTO Y,HARTONO S B,IRAWATY W,et al.High surface area activated carbon prepared from cassava peel by chemical activation[J].Bioresource Technology,2006,97(5):734-739.

[7]SEIBOLD G,AUCHTER M,BERENS S,et al.Utilization of soluble starch byarecombinantCorynebacterium glutamicum strain:growth and lysine production[J].Journal of Biotechnology,2006,124(2):381-391.

[8]TATENO T,FUKUDA H,KONDO A.Direct production of L-lysine from raw corn starch by Corynebacterium glutamicum secreting Streptococcus bovis α-amylase using cspB promoter and signal sequence[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2007,77(3):533-541.

[9]PARADIS F W,WARREN R A J,KILBURN D G,et al.The expression of Cellulomonas fimi cellulase genes in Brevibacterium lactofermentum[J].Gene,1987,61(2):199-206.

[10]ADHAM S A,HONRUBIA P,DíAZ M,et al.Expression of the genes coding for the xylanase Xys1 and the cellulase Cel1 from the straw-decomposing Streptomyces halstedii JM8 cloned into the amino-acid producerBrevibacterium lactofermentum ATCC13869[J].Archives of Microbiology,2001,177(1):91-97.

[11]TSUCHIDATE T,TATENO T,OKAI N,et al.Glutamate productionfromβ-glucanusingendoglucanase-secreting Corynebacterium glutamicum[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2011,90(3):895-901.

[12]HYEON J E,JEON W J,WHANG S Y,et al.Production of minicellulosomes for the enhanced hydrolysis of cellulosic substrates by recombinant Corynebacterium glutamicum[J].Enzyme and Microbial Technology,2011,48(4):371-377.

[13]HAHN-HAGERDAL B,KARHUMAA K,JEPPSSON M,et al.Metabolic engineering for pentose utilization in Saccharomyces cerevisiae[M]//Biofuels.Springer Berlin Heidelberg,2007:147-177.

[14]SAKAI S,TSUCHIDA Y,OKINO S,et al.Effect of lignocellulose-derived inhibitors on growth of and ethanol production by growth-arrested Corynebacterium glutamicum R[J].Applied and Environmental Microbiology,2007,73(7):2349-2353.

[15]KAWAGUCHI H,SAAKI M,VERTèS A A,et al.Engineering of an L-arabinose metabolic pathway in Corynebacterium glutamicum[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2008,77(5):1053-1062.

[16]SASAKI M,JOJIMA T,KAWAGUCHI H,et al.Engineering of pentose transport in Corynebacterium glutamicum to improve simultaneous utilization of mixed sugars[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2009,85(1):105-115.

[17]KALINOWSKI J,BATHE B,BARTELS D,et al.The complete Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 genome sequence and its impact on the production of L-aspartate-derived amino acids and vitamins[J].Journal of Biotechnology,2003,104(1):5-25.

[18]KAWAGUCHI H,VERTES A A,OKINO S,et al.Engineering of a xylose metabolic pathway in Corynebacterium glutamicum[J].Applied and Environmental Microbiology,2006,72(5):3418-3428.

[19]MEISWINKEL T M,GOPINATH V,LINDNER S N,et al.Accelerated pentose utilization by Corynebacterium glutamicum for accelerated production of lysine,glutamate,ornithine and putrescine[J].Microbial Biotechnology,2013,6(2):131-140.

[20]ADACHI N,TAKAHASHI C,ONO-MUROTA N,et al.Direct L-lysine production from cellobiose by Corynebacterium glutamicum displaying beta-glucosidase on its cell surface[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2013,97(16):7165-7172.

[21]GOPINATH V,MEISWINKEL T M,WENDISCH V F,et al.Amino acid production from rice straw and wheat bran hydrolysates by recombinant pentose-utilizing Corynebacterium glutamicum[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2011,92(5):985-996.

[22]SASAKI M,JOJIMA T,INUI M,et al.Simultaneous utilization of D-cellobiose,D-glucose,and D-xylose by recombinant Corynebacterium glutamicum under oxygen-deprived conditions[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2008,81(4):691-699.

[23]BARRETT E,STANTON C,ZELDER O,et al.Heterologous expression of lactose-and galactose-utilizing pathways from lactic acid bacteria in Corynebacterium glutamicum for pro duction of lysine in whey[J].Applied and Environmental Mi crobiology,2004,70(5):2861-2866.

[24]KURITA K.Chitin and chitosan:functional biopolymers from marine crustaceans[J].Marine Biotechnology,2006,8(3):203-226.