三種去除非全長(zhǎng)cDNA片段方法的比較研究

田 飛，李翠新，何 德

（西南林業(yè)大學(xué)，云南 昆明650224）

1 引言

在構(gòu)建全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)時(shí)，連接和轉(zhuǎn)化是關(guān)鍵步驟。在做樣品與載體連接之前，去除由PCR擴(kuò)增不完全和限制性內(nèi)切酶酶切產(chǎn)生的非全長(zhǎng)cDNA片段是必不可少的工作，殘留的非全長(zhǎng)cDNA片段會(huì)直接影響連接效果，影響建成文庫(kù)的代表性、冗余度和挑取單克隆測(cè)序的工作量[1～3]。而SMART技術(shù)中去除非全長(zhǎng)cDNA片段的方法也由其創(chuàng)立的CLONTECH公司從2001年的膠回收法[4]，改為 CHROMA－SPIN 400柱重力自流法，而在近幾年又改為CHROMA－SPIN 400柱離心法。然而多年來(lái)廣大的科研工作者大多數(shù)只是對(duì)其提供的去除方法進(jìn)行延用，卻沒(méi)有見(jiàn)到對(duì)這3種方法進(jìn)行平行比較和取舍的研究報(bào)道[5，6]。本文作者通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)最新的CHROMA－SPIN 400柱離心法的純化效果并不理想，所以對(duì)這3種方法做了一個(gè)綜合比較，以期得到最經(jīng)濟(jì)有效的純化方法，為后繼實(shí)驗(yàn)者提供指導(dǎo)和參考。

2 實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

小桐子花采自云南省昭通市巧家縣。瓊脂糖購(gòu)自BIOWEST公司，膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司，CHROMA－SPIN 400柱購(gòu)自CLONTECH公司，PCR儀購(gòu)自 BIORAD公司，型號(hào)為 C1000TM Thermal cycler，槍頭和離心管購(gòu)自美國(guó)Labnet公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2.2 擴(kuò)增并酶切cDNA

將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA用PCR儀擴(kuò)增后，取160μL擴(kuò)增液，用SfiⅠ限制性內(nèi)切酶酶切處理，備用。具體操作參照 CLONTECH 公司的 CreatorTMSMARTTMcDNA Library Construction Kit說(shuō)明書。

2.3 膠回收法純化

取50μL酶切過(guò)的PCR擴(kuò)增液跑瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒做膠回收，膠回收液標(biāo)記為1號(hào)處理液，－20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 CHROMA－SPIN 400柱重力自流法純化

取20個(gè)滅菌處理過(guò)的2mL離心管，編號(hào)1到20。從冰箱中取出一支CHROMA－SPIN 400柱，室溫放置1h活化，顛倒數(shù)次后垂直放置于一支架上，讓管中的樹(shù)脂重新沉降成柱。30min后，待樹(shù)脂柱上表面清晰可見(jiàn)，掰斷舍棄尾，揭開(kāi)頂蓋，排出柱中緩沖液，再往柱中添加TE緩沖液沖洗依次，待尾管處停止滴液后，給尾管套上白尾套。取50μL酶切過(guò)的PCR擴(kuò)增液，小心加到樹(shù)脂上表面的中心位置。待樣品液完全被樹(shù)脂柱吸收后，打開(kāi)尾管，用移液槍往柱中滴加TE緩沖液沖洗，并立刻用標(biāo)記好的離心管依次放于尾管下承接洗脫液，每管接一滴，直至接滿20管。立即做瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，合并最早出現(xiàn)條帶的前三管洗脫液，標(biāo)記為2號(hào)處理液，－20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 CHROMA－SPIN 400柱離心法純化

從冰箱中取出一支CHROMA－SPIN 400柱，室溫放置1h活化，顛倒數(shù)次后垂直放置于一支架上，讓管中的樹(shù)脂重新沉降成柱。沉降完全后，掰斷舍棄尾，并迅速套上一個(gè)配套的收集管，揭開(kāi)頂蓋，700g，離心5min。將收集管連同管中的收集液一起丟掉，拿一個(gè)新的配套收集管給純化柱套上，取50μL酶切過(guò)的PCR擴(kuò)增液，小心加到樹(shù)脂柱上表面的中心位置，700g室溫離心5min，純化好的cDNA樣品即在新的收集管中。取出純化柱，給收集管蓋上蓋子，標(biāo)記為3號(hào)處理液體，－20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6 濃縮純化液體至等體積

為控制變量，將3份純化液濃縮至等體積。具體方法為往3份純化液中各添加1／10倍體積3mol／L的NaAc，1.3μL濃度為20μg／μL的糖原溶液和2.5倍體積－20℃預(yù)冷的95%乙醇，搖晃混勻后置于－20℃冰箱中冷凍1h助沉。1h后取出離心管，14000g室溫離心20min。用槍頭小心吸去上清，再添加100μL80%的乙醇震蕩洗滌一次。14000g低溫離心后，吸去乙醇層，酒精燈旁晾干沉淀，再均以7μL RNase－free水溶解沉淀。

3 結(jié)果與分析

3.1 CHROMA－SPIN 400柱重力自流法電泳檢測(cè)結(jié)果

CHROMA－SPIN 400柱重力自流法的20管洗脫液，每管取3μL，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果如圖1所示，含有樣品的洗脫液出現(xiàn)在15、16、17、18四管中，而且這四管洗脫液的條帶在500bp處都有一細(xì)窄的亮帶，是由急劇的cDNA含量減少造成的，說(shuō)明CHROMA－SPIN 400柱重力自流法讓樣品液中小于500bp的cDNA片段的量有了明顯的減少。

圖1 CHROMA－SPIN 400柱重力自流法洗脫液檢測(cè)電泳圖

3.2 三份處理液濃縮至等體積后電泳檢測(cè)結(jié)果

取1、2、3號(hào)濃縮液和未處理的酶切過(guò)的RT－PCR擴(kuò)增液各3μL做瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖2。

圖2 三種方法純化液濃縮至等體積后電泳圖

3種方法的處理液電泳檢測(cè)都有條帶，CHROMA－SPIN 400柱離心法的條帶與膠回收法的條帶亮度接近，說(shuō)明這兩種方法回收率接近，都較低，且都顯著低于CHROMA－SPIN 400柱重力自流法的回收率。而從圖4中可以較明確的看到經(jīng)CHROMA－SPIN 400柱重力自流法和CHROMA－SPIN 400柱離心法處理過(guò)的樣品液電泳圖在低于500bp范圍內(nèi)仍然有彌散帶出現(xiàn)，而膠回收法在500bp以下處幾乎沒(méi)有暗帶了，說(shuō)明膠回收法除去小分子cDNA片段較徹底，而另兩種方法雖然使500以下cDNA片段有明顯減少，但去除并不徹底。

3.3 綜合對(duì)比三種方法

結(jié)合以上檢測(cè)結(jié)果，從成本、實(shí)驗(yàn)用時(shí)、去除效果、回收率和一次處理溶液量對(duì)3種方法進(jìn)行綜合比較，如表1所示。

表1 三種方法綜合比較表

4 結(jié)語(yǔ)

從綜合對(duì)照表和電泳對(duì)比圖中我們可以看到最新的CHROMA－SPIN 400柱離心法除了操作較簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)較快捷之外，在小分子去除效果上與CHROMASPIN 400柱重力自流法相比并沒(méi)有優(yōu)勢(shì)，而且關(guān)鍵的回收率遠(yuǎn)不及CHROMA－SPIN 400柱重力自流法。而膠回收法實(shí)驗(yàn)用時(shí)最少，而且小分子片段去除較徹底，只是回收率較低。所以綜合來(lái)看，當(dāng)樣品量較多時(shí)適宜采用膠回收法，不僅小分子片段去除較徹底，成本最低，而且可一次處理大量樣品，省時(shí)；當(dāng)樣品量較少時(shí)，適宜采取CHROMA－SPIN 400柱重力自流法保證回收率，雖然費(fèi)時(shí)一點(diǎn)；反倒是最新的CHROMASPIN 400柱離心法在關(guān)鍵的回收率和小分子去除效果兩方面與另兩種方法對(duì)比，都處于劣勢(shì)，所以不可取。

筆者分析認(rèn)為CHROMA－SPIN 400柱離心法與CHROMA－SPIN 400柱重力自流法相比，回收率之所以低很多，是因?yàn)殡x心力使大孔樹(shù)脂之間聚集太緊密，阻礙了cDNA片段的通過(guò)，而重力自流法中的大孔樹(shù)脂聚集只受重力，不受離心力，所以聚集程度適中，大分子cDNA片段剛好能通過(guò)，而小分子cDNA則被大孔樹(shù)脂吸附。而膠回收法之所以回收率較低，主要是因?yàn)橛写罅亢怂針悠窔埩粼诃傊侵?，未被選擇性溶出，隨離心廢液一起丟棄了。改變點(diǎn)樣量，膠回收中殘留洗脫不下來(lái)的損失樣品量基本不變，所以一次點(diǎn)樣越多，損失量不變，回收率就相對(duì)提高，可以用這種方法來(lái)相對(duì)提高膠回收率。另外，最近報(bào)道有凍融法、透析袋電洗脫法和低溶點(diǎn)瓊脂糖[7]等新的膠回收方法能夠顯著提高膠回收率，相信這些方法能夠彌補(bǔ)膠回收法回收率低這一缺點(diǎn)，而且膠回收法具有要去除的片段大小可以通過(guò)肉眼直觀，選擇切出，選擇范圍自由的優(yōu)點(diǎn)。

所以從長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看，最有潛力成去除全長(zhǎng)cDNA溶液中非全長(zhǎng)cDNA片段的最佳方法的是膠回收法。

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