現(xiàn)行兩種水質(zhì)糞大腸菌群測定方法的比較

馬旭東，趙 鋒

（陜西省安康市環(huán)境保護監(jiān)測站，陜西 安康725000）

1 概述

大腸菌群并非細菌學(xué)分類命名，它不代表某一個或某一屬細菌，而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細菌，這些細菌在生化及血清學(xué)方面并非完全一致，其定義為：需氧及兼性厭氧、在37℃能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無芽胞桿菌，糞大腸菌群則是大腸菌群的一部分主要來自于糞便，因此糞大腸菌群的存在表明可能受到了糞便污染，可能存在大腸桿菌。

國家標準和行業(yè)標準中都對糞大腸菌群的檢測（多管發(fā)酵法）作出了比較詳細的規(guī)定，現(xiàn)就其兩個標準中的異同作出如下探討。

2 相同點

適用范圍相同：行業(yè)標準和國家標準都適用于地表水、地下水和污水中的糞大腸菌群的檢測。

原理相同：多管發(fā)酵法是以最可能數(shù)簡稱MPN來表示試驗結(jié)果的。實際上它是根據(jù)統(tǒng)計學(xué)理論，估計水體中的大腸菌群密度和衛(wèi)生質(zhì)量的一種方法。如果從理論上考慮，并且進行大量的重復(fù)檢定，可以發(fā)現(xiàn)這種估計有大于實際數(shù)字的傾向。不過只要每一稀釋度試管重復(fù)數(shù)目增加，這種差異便會減少，對于細菌含量的估計值，大部分取決于那些既顯示陽性又顯示陰性的稀釋度。因此在實驗設(shè)計上，水樣所要求重復(fù)的數(shù)目，要根據(jù)所要求數(shù)據(jù)的準確度而定。

3 不同點

（1）國家標準中規(guī)定水樣采集前，需要在采樣瓶中加入適量的硫代硫酸鈉，用以消除或減小樣品中的氯對于微生物正常生長的影響，而行業(yè)標準中沒有相應(yīng)的規(guī)定。

（2）國家標準中規(guī)定水樣在分析時的稀釋方法為取1mL水樣注入到9mL滅菌生理鹽水中混勻，若需要再次稀釋則取上述稀釋液1mL注入到9mL滅菌生理鹽水中，以此類推。若接種量小于1mL時則必須作10倍遞增稀釋，并且還要注意的是每遞增稀釋一次，換用1支1mL滅菌刻度吸管，行業(yè)標準中沒有相應(yīng)的規(guī)定。

（3）對于不同的水樣，國家標準中沒有給出一個建議稀釋度，而行業(yè)標準中有一個明確的稀釋方法建議，見表1。

表1 行業(yè)檢測稀釋方法建議

（4）復(fù)發(fā)酵試驗的方法不同，這一點也是最為重要的一點。行業(yè)標準中對于復(fù)發(fā)酵試驗的規(guī)定是：輕微震蕩初發(fā)酵試驗陽性的發(fā)酵管，用3mm接種環(huán)或滅菌棒將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到EC培養(yǎng)液中。在44.5±0.5℃下培養(yǎng)24±2h。接種后所有發(fā)酵管必須在30min內(nèi)放入水浴中。培養(yǎng)后立即觀察，發(fā)酵管產(chǎn)氣則證實為糞大腸菌群陽性。而國家標準中規(guī)定若復(fù)發(fā)酵有產(chǎn)氣者，則轉(zhuǎn)種于伊紅美藍瓊脂平板上，置44.5℃培養(yǎng)18～24h，凡平板上有典型菌落者，則證實為糞大腸菌群陽性。即國家標準中在復(fù)發(fā)酵試驗發(fā)酵管產(chǎn)酸或產(chǎn)氣之后還需要進行一個平板分離和革蘭氏染色見證試驗才能證明水樣中有無糞大腸菌群的存在，而行業(yè)標準中只要是復(fù)發(fā)酵試驗產(chǎn)氣則就能證明糞大腸菌群陽性。

4 革蘭氏染色

4.1 原理

通過結(jié)晶紫初染和碘液媒染后，在細胞壁內(nèi)形成了不溶于水的結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物，革蘭氏陽性菌由于其細胞壁較厚、肽聚糖網(wǎng)層次較多且交聯(lián)致密，故遇乙醇或丙酮脫色處理時，因失水反而使網(wǎng)孔縮小，再加上它不含類脂，故乙醇處理不會出現(xiàn)縫隙，，因此能把結(jié)晶紫與碘復(fù)合物牢牢留在壁內(nèi)，使其仍呈紫色；而革蘭氏陰性菌因其細胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯(lián)度差，在遇脫色劑后，以類脂為主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖網(wǎng)不能阻擋結(jié)晶紫與碘復(fù)合物的溶出，因此通過乙醇脫色后仍呈無色，再經(jīng)沙黃等紅色染料復(fù)染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。

4.2 步驟

（1）涂片固定。

（2）草酸銨結(jié)晶紫染1min。

（3）自來水沖洗。

（4）加碘液覆蓋涂面染約1min。

（5）水洗，用吸水紙吸去水分。

（6）加95%酒精數(shù)滴，并輕輕搖動進行脫色，20s后水洗，吸去水分。

（7）蕃紅染色液（稀）染1min后，自來水沖洗。干燥，鏡檢。

5 革蘭氏染色對于糞大腸菌群檢測的重要意義

在微生物學(xué)中，大腸桿菌是一種革蘭氏陰性無芽孢的原核生物。相對于革蘭氏陽性細菌來說，其特點是：細胞壁較薄、較疏松且肽聚糖含量較低。這就造成了在進行革蘭氏染色時會在復(fù)染階段被二次染色從而區(qū)別于革蘭氏陽性細菌。

6 結(jié)論

（1）行業(yè)標準中沒有對于采樣時采樣瓶的處理方法，故在實際操作中可以參照國家標準中的相關(guān)規(guī)定。

（2）行業(yè)標準中沒有規(guī)定水樣在分析時的稀釋方法，故在實際操作中可以參照國家標準中的相關(guān)規(guī)定。

（3）在實際的分析工作中分析人員可以根據(jù)這個稀釋方法以及平時對于該項目的積累可以盡可能少地選擇一個或者幾個稀釋度對樣品進行分析，從而減少因稀釋度的選擇不合適而造成的各種浪費。

（4）就算按照國家標準的規(guī)定，每個樣品在復(fù)發(fā)酵之后還要對其陽性試管進行分離鑒定及革蘭氏染色，而在分離鑒定和革蘭氏染色過程中仍然會有可能因操作手法、試劑或其他偶然因素而造成鑒定結(jié)果出現(xiàn)假陽性或假陰性，從而對糞大腸菌群的整個實驗結(jié)果造成偏離甚至是錯誤。

而在行業(yè)標準的復(fù)發(fā)酵過程中，如果發(fā)酵管中根本不存在大腸桿菌，而是存在一些其他種類的革蘭氏陽性細菌，而革蘭氏陽性細菌在發(fā)酵過程中也必然會產(chǎn)氣。這時只要發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)氣就認定為糞大腸菌群陽性是否欠妥。

7 建議

總大腸菌群、糞大腸菌群和細菌總數(shù)等都是屬于生物監(jiān)測項目，并常常與其他各種化學(xué)項目同期采樣。因這兩個標準中都沒有對于生物項目和化學(xué)項目在采樣時應(yīng)注意的先后順序，從而導(dǎo)致經(jīng)常會出現(xiàn)在同一個采樣點位先采化學(xué)項目、后采生物項目，或者化學(xué)項目與生物項目交替進行采樣的情況，而這些情況勢必會對生物項目的水樣造成影響。希望下次修訂標準的時候可以考慮這個情況。

［1］中華人民共和國衛(wèi)生部，中國國家標準化管理委員會.生活飲用水標準檢驗方法 微生物指標 GB/T 5750.12－2006［S］.北京：中華人民共和國衛(wèi)生部，中國國家標準化管理委員會：2006.

［2］國家環(huán)境保護部.水質(zhì)糞大腸菌群的測定多管發(fā)酵法和濾膜法HJ/T347－2007［S］.北京：國家環(huán)境保護部，2007.

［3］周德慶.微生物教程［M］.2版.北京：高等教育出版社，2002.

［4］沈 萍.微生物學(xué)實驗［M］.4版.北京：高等教育出版社，2007.

［5］國家環(huán)境保護總局，國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.地表水環(huán)境質(zhì)量標準GB3838－2002［S］.北京：國家環(huán)境保護總局，國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，2002.

［6］周群英.環(huán)境工程微生物學(xué)［M］.3版.北京：高等教育出版社，2000.